Summary
Biz insan kortikal homojenatlarında açıklık, SDS-PAGE ile protein ayırma, antijen alımı ve Aβ peptid antikor immunoblotting hazırlanması için kullanılan bir tekniktir açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz sürekli olarak insanlarda Alzheimer patolojisi olan kortikal doku monomerik ve multimer Aβ algılar.
Abstract
Β-amiloid anormal katlama ve polimerizasyon (Aβ) peptid Alzheimer hastalığının patogenezinde nörodejeneratif kaskad başlatmak için düşünülüyor
Protocol
Bölüm 1: açıklık doku homojenatlarında Hazırlık
- Yaklaşık 30 bile havaneli şart vuruş ile (yani ekle 400μl tampon - buz gibi soğuk tampon (artı 2x proteaz inhibitörü kokteyl [Santa Cruz] 0.1M fosfat tamponlu tuzlu [ve Mg + +-serbest Ca + +]) 4 kez hacmi Sabitlenmemiş kortikal doku homojenize Dounce 100 mg doku).
- 3.000 az 5 dakika Spin homojenatlarında g (4 ° C). Dikkatle -80 açıklık süpernatantlar ve bu özler mağaza alikotları kaldırmak ° C kullanana kadar.
- Üreticinin talimatlarına (ThermoFisher) göre, bir bicinchoninic asit (BCA) deneyi ile açıklık homojenatlarında total protein konsantrasyonu (mg / ml) belirleyin.
Bölüm 2: SDS-PAGE ile örnek hazırlama
- Iyi bir 10 ile,% 10-20 Tricine jel (Invitrogen), yanı başına yüklenecek maksimum ses ~ 25μl. Toplam hacmi 2x SDS numune tamponu ve 10x indirgen, yanı başına yüklenecek açıklık Homojenat maksimum ses 10μl. % 20 (w / v) Sade kortikal homojenatlarında 50μg total protein için de izin veren, total protein konsantrasyonu 5 mg / ml 'den büyük olması gerekir. Daha az protein 5mg/ml numuneler başına daha az total protein yüklenmesi gerektirecektir. Ancak, yüksek protein düzeyleri monomerik ve toplu Aβ tespiti için en uygun (50 60μg total protein, optimum).
Her zaman ortalama toplam protein aynı miktarda yük. - Her jel için, SeeBlue Plus2 (Invitrogen) gibi bir moleküler ağırlık marker 10μl ile en az bir yük. Pozitif kontrol olarak, sentetik Aβ40 veya başka bir kuyuda Aβ42 peptid (1xPBS içinde seyreltilmiş) 10-100ng çalıştırın.
- Taze çözülmüş, açıklık homojenatlarında kullanarak, buz üzerinde reaksiyon karışımları hazırlayın. Vorteks tüpleri, 5-10 saniye için 100 kuru bir banyo ısı ° C, 5 dakika sonra, hızlı bir şekilde kapağı yoğunlaşma kaldırmak için tüm örnekler dönerler.
Bölüm 3: SDS-PAGE Jel elektroforezi
- Tricine SDS çalışan tampon kullanarak, üreticinin talimatlarına (Invitrogen) göre,% 10-20 Tricine jel üzerine XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox vortekslenmiş numuneleri yükleyin
- Yaklaşık 90 dakika boyunca sabit bir gerilim 125V jel çalıştırın. 4KDa marker bant jel alttan 1 cm kadar numunelerinin çalışılabilmesi edelim.
Bölüm 4: Jeller gelen Membranlar aktarma Proteinler
- Dikkatlice plastik kasa (Invitrogen) üreticinin talimatlarına göre, jeller kaldırmak ve XCell II Blot Modülü içinde transfer sandviç montajı. Pre-Tris-Glycine transfer tampon (% 20 metanol) ile pedleri ve 0.2μm nitroselüloz membranlar ıslak kurutma ve blot pabuçları veya filtre kağıdı / membran sandviç herhangi bir kabarcıkları.
- XCell Gelbox, transfer tamponu ile iç odanın doldurun ve dih 2 O (metanol maruz zamanla plastik gelbox yıpratmak) dış kamara doldurun.
- 2-3 saat boyunca sabit bir 25mA amperajda transfer çalıştırın.
- Transfer tamamlandığında, sandviç yapısızlaştırabileceğimizi ve dih 2 O ve membranlar içine jeller kare plastik petri kaplarına 1xPBS (veya başka uygun bir kap) içine yerleştirin.
- Protein transfer verimliliği görselleştirmek için, jeller Sadece Mavi SafeStain (Invitrogen) ile boyanmış olabilir, Ponceau G Kırmızı leke (Sigma Aldrich) membranlar, hem üreticinin talimatlarına göre. Bu boyama immunoblotting engel olmaz. Boyama yetersiz protein transferi ortaya çıkarsa, Adım 3 transfer süresi değiştirin.
Bölüm 5. Antijen-epitop alma ve İmmünoblotting
- Antijen alma antikor bağlanma membran Aβ epitoplar immunoblotting sırasında ortaya çıkarmada önemli bir adımdır. Herhangi bir vapur, mikrodalga fırın, su banyosu, tutar sabit bir sıcaklık 100 ° C yeterli olacaktır. Bir vapur antijen alımı için, oda sıcaklığında, 1xPBS dolu bir ağır Kapak plastik poşet membran ısı mühür. Sat, önceden ısıtılmış bir vapur düz kese kese genişletmek için ek bir 15 dakika boyunca inkübe başladıktan sonra. Membran aşırı kırışıklıklar önlemek için, poşetten çıkarmadan önce yavaş yavaş soğutmak için izin verin.
- Oda sıcaklığında, membran dikkatle buharda poşetten çıkarın ve 5 dakika 5 dakika (% 0.05 Tween-20 ile Tuzlu, pH 8.0 Tris-Tamponlanmış TBS-T durulama ardından 1xPBS membran, durulama [Sigma] ), yörüngesel bir çalkalayıcı. Titreme, bir saat süreyle bloke çözüm membranı (% 2,5 yağsız süt TBS-T) inkübe edin. Durulama olmadan, (6E10) 1:1,000 [1μg/ml] 1:5,000 [0.2μg/ml] seyreltme Covance, kaçınarak kabarcık engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikor içeren bir tabak veya plastik poşet membran transferis Için oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı 4 sallayarak ° C (uzun inkübasyon daha iyi bir sinyal verebilir) bir saat sonra 24-48 saat inkübe
- TBS-T 30 dakika membran durulayın (tek bir hızlı 3 x 10 dakika çalkalama takip durulama).
- 90 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı engelleme çözümü 1:10,000 seyreltilmiş HRP-konjuge sekonder antikor membran (Amersham ECL koyun anti-fare, GE Healthcare), inkübe edin.
- TBS-T 30 dakika membran durulayın (tek bir hızlı 3 x 10 dakika çalkalama takip durulama).
- Shaker, plastik levha koruyucuları arasındaki, havsız filtre kağıdı üzerinde aşırı reaktif kurulayın ve membran bir film kaset yerleştirmek, 5 dakika boyunca taze SuperSignal West Pico Electrochemiluminescence reaktifi (ThermoFisher) membran kuluçkaya yatmaktadır. Tozsuz Kimwipes gerekirse ek SuperSignal reaktif kurutun.
- 30 dakika 30 saniye aralıklarla Kodak Biomax MR film ortaya çıkarmak ve bir film geliştirici gelişir. 5 dakika sonra, Aβ monomer bantları muhtemelen doymuş olacaktır.
- Membranlar Geri Yükleme sallayarak Plus oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tampon sıyırma ve istenirse ek antikorlar ile reprobed (TBS-T durulandıktan sonra) elimden olabilir.
Bölüm 6: Temsilcisi immüno:
7 insan denekler 50μg total protein içeren Şekil 1a-c. Aydınlatılmış homojenatlarında multimer Aβ ve APP varlığı için incelenir. Antikor 6E10 İmmünoblotting Aβ monomerlerin, dimerleri, trimerler, tetramers ve tüm Alzheimer durumlarda APP (üst bant) yanı sıra 2 AD durumlarda bol miktarda yüksek molekül ağırlığı Aβ multimerleri ortaya koymaktadır. Sentetik Aβ40 düşük molekül ağırlıklı bantları kimliğini onaylar. AD: Alzheimer hastalığı, LCD'de: demansı olmayan insan (a) 30 dakikalık film pozlama, (b) 5 dakikalık bir film maruz kalma, (c) 30 saniyelik film maruz kalma: Lewy Bodies, ND ile Demans .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alzheimer hastalığı 1,4,5 patogenezinde Aβ agregasyonunun önemine rağmen, az sayıda çalışma açıklanan veya insan kortikal doku örnekleri 2 farklı Aβ multimerlerin sayısal dağılımı var. Yaygın olarak kullanılan immünohistokimyasal teknikler sabit kortikal doku, farklı multimer Aβ türlerin ayrımcılığa izin vermez. Sabitlenmemiş kortikal doku homojenatlarında, Aβ multimerleri ayrılmış ve biyokimyasal jel elektroforezi ve antikor tabanlı algılama yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Ancak, algılama ve toplu Aβ doğru kantifikasyon önlenmesi hedeflenmektedir Aβ epitoplar toplanmış ve post-translationally peptit yapılarının içinde gizli olabilir. SDS-PAGE ve Aβ 6,7 N-terminal bölgesi için bir antikor ile immunoblotting ile birlikte ısı kaynaklı antijen-epitop alma kullanarak, ayrı ve doğal olarak oluşan insan beyni izole Aβ multimerleri tespit etmek mümkün . Farklı Aβ multimer nüfus açıklık doku homojenatlarında sonra dansitometrisi tarafından belirlenebilir. Ayrıca, jel veya membran-çıkarma kombinasyonu doğal olarak ortaya çıkan diğer yapısal karakterizasyonu için immunoblotting Aβ sağlayacaktır, post-translationally Aβ multimerleri insan dokusunun değiştirilmiş. Bu insan beyninin Aβ multimerleri SDS dayanıklı, ya da SDS-duyarlıdır ve bu nedenle tanımlanmış koşullar altında SDS denatürasyon küçük agrega ayrılmış olmadığını belirlemek için önemli olacaktır. Insan beyninde toplanan Aβ farklı formları karakterizasyonu, Alzheimer hastalığı için tedavi ve biyobelirteçler için arama kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Elaine Pranski ve mükemmel teknik yardım için Carolyn Suwyn ve Harry LeVine III, M. Paul Murphy ve Dişli Marla önemli konuşmalar için çok teşekkürler. Finansman RR-00165 PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, Woodruff Vakfı ve Emory Üniversitesi Araştırma Komitesi tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma-Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
