Summary
हम स्पष्ट मानव cortical homogenates, एसडीएस PAGE द्वारा प्रोटीन जुदाई, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति और Aβ पेप्टाइड एंटीबॉडी के साथ immunoblotting की तैयारी के लिए एक तकनीक का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम लगातार cortical ऊतकों में अल्जाइमर रोग विज्ञान के साथ मनुष्यों से monomeric और multimeric Aβ का पता लगाने.
Abstract
विषम और β-amyloid की तह polymerization पेप्टाइड (Aβ) अल्जाइमर रोग के रोगजनन में neurodegenerative झरना आरंभ करने के लिए सोचा है
Protocol
भाग 1: स्पष्ट ऊतक homogenates की तैयारी
- लगभग 30 भी मूसल स्ट्रोक के साथ (यानी जोड़ने के 400μl बफर - 4 ठंडा बफर (प्लस 2x protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल [सांता क्रूज़] 0.1M फॉस्फेट-buffered खारा [और मिलीग्राम + + - मुक्त Ca + +]) के समय की मात्रा में unfixed cortical ऊतक homogenize Dounce 100mg ऊतक).
- ३,००० पर 5 मिनट के लिए स्पिन homogenates छ (4 डिग्री सेल्सियस). ध्यान से -80 पर स्पष्ट supernatants और इन अर्क की दुकान aliquots हटाने ° उपयोग करें जब तक सी.
- स्पष्ट bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग homogenates के लिए निर्माता के निर्देशों (ThermoFisher) के अनुसार कुल प्रोटीन एकाग्रता (μg / μl), निर्धारित है.
भाग 2: एसडीएस पृष्ठ नमूना तैयारी
- एक अच्छी तरह से 10 के साथ, 10-20% Tricine जेल (Invitrogen), अधिकतम मात्रा है कि अच्छी तरह से प्रति लोड किया जा सकता है. 25μl ~ कुल मात्रा 2x एसडीएस नमूना बफर और 10x कम करने एजेंट भी शामिल है, तो स्पष्ट homogenate की अधिकतम मात्रा है कि अच्छी तरह से प्रति लोड किया जा सकता 10μl है. 20% (w / v) स्पष्ट cortical homogenates कुल प्रोटीन एकाग्रता 5 μg / μl से अधिक है, 50μg कुल प्रोटीन के लिए प्रति अच्छी तरह से अनुमति चाहिए. 5mg/ml कम से कम प्रोटीन के साथ नमूने कम कुल प्रोटीन लोड हो रहा है की जरूरत होगी प्रति अच्छी तरह से. हालांकि, उच्च प्रोटीन के स्तर monomeric और एकत्रित Aβ (50 60μg कुल प्रोटीन इष्टतम है) का पता लगाने के लिए इष्टतम हैं.
हमेशा कुल प्रोटीन का एक ही राशि के प्रति अच्छी तरह से लोड. - प्रत्येक जेल के लिए, कम से कम SeeBlue Plus2 (Invitrogen) के रूप में एक आणविक वजन मार्कर के 10μl के साथ अच्छी तरह से लोड. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 10-Aβ40 सिंथेटिक या Aβ42 एक और कुएं में पेप्टाइड (1xPBS में पतला) के 100ng चलाते हैं.
- बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार, हौसले से thawed, स्पष्ट homogenates का उपयोग. 5-10 सेकंड के लिए भंवर ट्यूब, एक सूखी स्नान में 100 पर गर्मी डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, तो जल्दी से सभी नमूने स्पिन टोपी में संक्षेपण हटायें.
भाग 3: एसडीएस पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन
- XCell ज़रूर Gelbox सेल - मिनी लॉक में एक 10-20% Tricine जेल पर vortexed नमूने लोड, Tricine एसडीएस चल बफर का उपयोग निर्माता के निर्देशों (Invitrogen) के अनुसार,,
- 125V के बारे में 90 मिनट के लिए एक निरंतर वोल्टेज में जेल चलाएँ. नमूने चलाने के 4KDa मार्कर बैंड तक जेल के नीचे से 1 सेमी के बारे में है.
भाग 4: जैल से झिल्ली के लिए स्थानांतरण प्रोटीन
- प्लास्टिक के मामले से ध्यान जैल हटाने और XCell द्वितीय ब्लाट मॉड्यूल के अंदर हस्तांतरण सैंडविच इकट्ठा, निर्माता के निर्देशों (Invitrogen) के अनुसार. पूर्व गीला Tris-Glycine हस्तांतरण बफर (20% मेथनॉल) के साथ पैड और 0.2μm nitrocellulose झिल्ली सोख्ता है, और पैड या फिल्टर सैंडविच / कागज झिल्ली सोख्ता से किसी भी बुलबुले को दूर.
- XCell Gelbox में स्थानांतरण बफर के साथ भीतरी कक्ष को भरने और dIH 2 हे (मेथनॉल जोखिम नीचे समय के साथ प्लास्टिक gelbox पहन कर सकते हैं) के साथ बाहरी कक्ष भरने.
- 25mA की एक निरंतर amperage पर 2-3 घंटे के लिए हस्तांतरण चलाएँ.
- जब स्थानांतरण पूरा हो गया है, सैंडविच deconstruct और दोनों वर्ग प्लास्टिक पेट्री डिश में 1xPBS (या किसी अन्य उपयुक्त कंटेनर) में dIH 2 हे और झिल्ली में जैल जगह.
- प्रोटीन हस्तांतरण की क्षमता कल्पना करने के लिए, जैल बस ब्लू SafeStain (Invitrogen) के साथ दाग जा सकता है, और एस काकरेज़ी रंग लाल दाग (सिग्मा Aldrich) झिल्ली के साथ, दोनों के निर्माता के निर्देशों के अनुसार. यह धुंधला हो जाना immunoblotting साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. यदि धुंधला अक्षम प्रोटीन हस्तांतरण से पता चलता है, तो चरण 3 में हस्तांतरण के समय को संशोधित.
भाग 5. एंटीजन - मिलान पुनर्प्राप्ति और Immunoblotting
- एंटीजन पुनर्प्राप्ति एंटीबॉडी बंधनकारी के लिए झिल्ली पर immunoblotting के दौरान Aβ epitopes खुलासा करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. कोई स्टीमर, माइक्रोवेव, या पानी स्नान है कि 100 के एक निरंतर तापमान बनाए रखता ° सी पर्याप्त होगा. एक स्टीमर में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, एक भारी शुल्क Kapak प्लास्टिक 1xPBS के साथ भरा थैली में कमरे के तापमान पर झिल्ली, गर्मी सील. लेटाओ एक पूर्व गर्म स्टीमर में फ्लैट पाउच, एक बार थैली विस्तार करने के लिए, एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए सेते शुरू होता है. झिल्ली धीरे धीरे यह थैली से हटाने से पहले शांत करने के लिए, अत्यधिक wrinkling को रोकने की अनुमति दें.
- कमरे के तापमान पर, ध्यान से गश्त थैली से झिल्ली को हटा दें और अपने 1xPBS में 5 मिनट के लिए झिल्ली, एक 5 मिनट टीबीएस टी (0.05% बीच - 20 के साथ खारा, 8.0 पीएच Tris-buffered में कुल्ला द्वारा पीछा कुल्ला [सिग्मा] ), एक कक्षीय हिलनेवाला पर. एक घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में झिल्ली (2.5% टीबीएस टी में नोनफेट दूध) सेते हैं, मिलाते हुए. Rinsing के बिना, एक डिश या प्लास्टिक की थैली प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में पतला (1:1,000 [1μg/ml] [1:5,000 0.2μg/ml] कमजोर पड़ने, Covance पर), से बचने बुलबुला 6E10 एंटीबॉडी युक्त झिल्ली हस्तांतरणएस एक घंटे और फिर 24-48 घंटे 4 में मिलाते डिग्री सेल्सियस (लंबी ऊष्मायन एक बेहतर संकेत दे सकता है). के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर सेते
- टीबीएस टी में 30 मिनट के लिए कुल्ला झिल्ली (एक त्वरित 3 एक्स 10 मिनट rinses द्वारा पीछा कुल्ला).
- एचआरपी - संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली (Amersham ईसीएल विरोधी माउस भेड़, जीई हेल्थकेयर), अवरुद्ध समाधान में 1:10,000 पर पतला हिलनेवाला पर 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, सेते हैं.
- टीबीएस टी में 30 मिनट के लिए कुल्ला झिल्ली (एक त्वरित 3 एक्स 10 मिनट rinses द्वारा पीछा कुल्ला).
- एक प्रकार के बरतन में, 5 मिनट के लिए हौसले से बनाया SuperSignal पश्चिम पिको Electrochemiluminescence अभिकर्मक (ThermoFisher) में झिल्ली सेते हैं, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त फिल्टर पेपर पर अतिरिक्त अभिकर्मक दाग और एक फिल्म कैसेट में झिल्ली जगह प्लास्टिक शीट से रक्षा के बीच. धूल से मुक्त, यदि आवश्यक हो Kimwipes के साथ अतिरिक्त SuperSignal अभिकर्मक ब्लाट.
- 30 मिनट 30 सेकंड के अंतराल के लिए कोडक Biomax एमआर फिल्म को बेनकाब और एक फिल्म डेवलपर में विकसित. 5 मिनट के बाद, Aβ monomer बैंड शायद संतृप्त किया जाएगा.
- झिल्ली पुनर्स्थापित प्लस कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बफर विपठ्ठन में मिलाते और reprobed अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ अगर वांछित (टीबीएस-टी में rinsing के बाद) छीन कर सकते हैं.
भाग 6: प्रतिनिधि Immunoblot:
आंकड़े स्पष्ट 1a ग 7 मानव विषयों से 50μg कुल प्रोटीन युक्त homogenates multimeric Aβ और एपीपी की उपस्थिति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं . एंटीबॉडी 6E10 के साथ Immunoblotting Aβ monomers dimers, trimers, tetramers, और सभी मामलों में अल्जाइमर एपीपी (शीर्ष बैंड), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 2 ई. मामलों में प्रचुर मात्रा में उच्च आणविक भार Aβ multimers पता चलता है. सिंथेटिक Aβ40 कम आणविक भार बैंड की पहचान की पुष्टि करता है. ई. अल्जाइमर रोग, DLB:: Nondemented मानव (क) 30 मिनट की फिल्म प्रदर्शन, (ख) 5 मिनट की फिल्म प्रदर्शन, (ग) 30 दूसरी फिल्म जोखिम: Lewy निकायों, एन डी के साथ मनोभ्रंश .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अल्जाइमर 1,4,5 रोग के रोगजनन में Aβ एकत्रीकरण के महत्व के बावजूद, कुछ अध्ययनों में वर्णित है या मानव cortical ऊतक नमूने 2 में विविध Aβ multimers का वितरण मात्रा निर्धारित है. आमतौर पर इस्तेमाल किया immunohistochemical तकनीक अलग तय cortical ऊतकों में multimeric Aβ प्रजातियों के भेदभाव के लिए अनुमति नहीं है. Unfixed cortical ऊतक homogenates में, Aβ multimers और अलग किया जा सकता biochemically जेल वैद्युतकणसंचलन और एंटीबॉडी आधारित तरीकों का पता लगाने का उपयोग कर मूल्यांकन. हालांकि, Aβ epitopes है कि लक्षित कर रहे हैं एकत्रित और बाद translationally संशोधित पेप्टाइड संरचनाओं के भीतर छिपा हो सकता है, पता लगाने और एकत्रित Aβ की सटीक मात्रा का ठहराव को रोकने. गर्मी प्रेरित प्रतिजन का मिलान एसडीएस PAGE और एन टर्मिनल 6,7 Aβ के क्षेत्र के लिए एक एंटीबॉडी के साथ immunoblotting के साथ संयुक्त पुनर्प्राप्ति का उपयोग करना, हम अलग और स्वाभाविक रूप से मानव दिमाग से अलग Aβ multimers घटनेवाला का पता लगाने में सक्षम हैं. स्पष्ट ऊतक homogenates में अलग Aβ multimer आबादी तो densitometry द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, जेल या झिल्ली निष्कर्षण के साथ संयोजन immunoblotting Aβ स्वाभाविक रूप से घटनेवाला के आगे संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देगा, के बाद translationally मानव ऊतकों से Aβ multimers संशोधित. यह महत्वपूर्ण हो निर्धारित करने के लिए है कि मानव मस्तिष्क में Aβ multimers एसडीएस प्रतिरोधी रहे हैं, या अगर वे एसडीएस के प्रति संवेदनशील हैं और इसलिए छोटे समुच्चय में परिभाषित शर्तों के तहत नीचे एसडीएस विकृतीकरण से टूट जाएगा. मानव मस्तिष्क में एकत्रित Aβ के विविध रूपों के लक्षण वर्णन और उपचार अल्जाइमर रोग के लिए बायोमार्कर के लिए खोज की सुविधा होगी.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ऐलेन Pranski और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए कैरोलिन Suwyn और हैरी लेविन III, एम. पॉल मर्फी, और महत्वपूर्ण बातचीत के लिए कमर कस Marla के लिए बहुत धन्यवाद. अनुदान 00,165 - आर आर, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, Woodruff फाउंडेशन और Emory विश्वविद्यालय के अनुसंधान समिति द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma-Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
