SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval
Summary
Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.
Abstract
Die anomale Falten und Polymerisation des β-Amyloid (Aß)-Peptid wird angenommen, dass die neurodegenerative Kaskade in der Alzheimer-Pathogenese der Erkrankung einleiten<sup> 1</sup>. Aß ist vorwiegend ein 40 – oder 42-Aminosäuren-Peptid, die anfällig für Selbst-Aggregation in β-Faltblatt-reiche Amyloidfibrillen, dass in den Kernen der zerebralen senilen Plaques bei Alzheimer-Krankheit gefunden werden wird. Zunehmende Hinweise darauf, dass niedermolekulare, lösliche Aß Multimere toxischer als fibrillären Aß-Amyloid sind<sup> 2</sup>. Die Identifizierung und Quantifizierung von niedrig-und hochmolekularen multimeren Aß Arten in Hirngewebe ist ein wesentliches Ziel in Alzheimer-Forschung und der angewandten Methoden auch auf die Identifizierung und Charakterisierung von toxischen Multimere in anderen proteopathies angewendet werden<sup> 3</sup>. Natürlich vorkommende Aß Multimere kann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durch Immunoblot mit Aß-spezifische Antikörper, gefolgt erkannt werden. Allerdings erfordert die Trennung und Detektion von multimeren Aß die Verwendung von hochkonzentrierten kortikalen Homogenaten und Antigen-Retrieval in kleinen Porengröße Nitrocellulosemembranen. Hier beschreiben wir eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE und Antigen-Epitopdemaskierungslösung / Western-Blot mit einem Antikörper 6E10, die N-terminalen Region des Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen Aß Monomere, Dimere, Trimere, Tetramere und höherem Molekulargewicht Multimere in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.
Protocol
Discussion
Trotz der Bedeutung der Aß Aggregation in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit 1,4,5, haben nur wenige Studien beschrieben oder quantifiziert die Verteilung der verschiedenen Aß-Multimere in menschlichen kortikalen Gewebeproben 2. Häufig verwendete immunhistochemische Techniken nicht für die Diskriminierung von unterschiedlichen multimeren Aß Spezies in festen kortikalen Gewebes ermöglichen. In fixierten kortikalen Gewebehomogenaten kann Aß Multimere getrennt und biochemisch untersucht mi…
Acknowledgements
Vielen Dank an Elaine Pranski und Carolyn Suwyn für hervorragende technische Unterstützung und Harry LeVine III, M. Paul Murphy, und Marla Gearing für wichtige Gespräche. Die Finanzierung wurde von RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, die Woodruff-Stiftung und der Emory University Research Committee zur Verfügung gestellt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
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- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
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- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
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