איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור
Summary
אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.
Abstract
קיפול פילמור חריגה של עמילואיד β (Aβ) פפטיד הוא חשב ליזום את מפל ניווניות בפתוגנזה מחלת אלצהיימר<sup> 1</sup>. Aβ היא ברובה 40 – פפטיד או חומצה אמינית 42 כי הוא נוטה צבירה עצמית לתוך β גיליונות עשיר סיבי עמילואיד המצויים ליבות של פלאק סנילי המוח במחלת האלצהיימר. הגדלת הראיות עולה כי משקל מולקולרי נמוך, multimers Aβ מסיסים הם רעילים יותר סיבי עמילואיד Aβ<sup> 2</sup>. זיהוי וכימות נמוכה גבוהה משקל מולקולרי multimeric מינים Aβ ברקמת המוח הוא יעד חיוני במחקר מחלת האלצהיימר, ואת השיטות הננקטות גם יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של multimers רעילים proteopathies אחרים<sup> 3</sup>. Multimers Aβ טבעי ניתן להבחין באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide ואחריו immunoblotting עם Aβ נוגדנים ספציפיים. עם זאת, הפרדה וזיהוי של Aβ multimeric מחייב שימוש homogenates קליפת המוח מרוכז מאוד ואחזור אנטיגן נקבוביות בגודל קטן nitrocellulose ממברנות. כאן אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי-SDS, ו אנטיגן epitope אחזור / המערבי סופג עם 6E10 נוגדן לאזור N-הטרמינל של הפפטיד Aβ. באמצעות פרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות מונומרים Aβ, הדימרים, trimers, tetramers, ומעלה multimers משקל מולקולרי ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.
Protocol
Discussion
למרות החשיבות של צבירת Aβ בפתוגנזה של מחלת האלצהיימר 1,4,5, מחקרים מעטים תיארו או לכמת את התפלגות multimers Aβ מגוון אנושי דגימות רקמה קליפת המוח 2. טכניקות immunohistochemical בשימוש נפוץ שאינם מאפשרים אפליה של מינים שונים Aβ multimeric ברקמת קליפת המוח קבוע. בשנת מבולבל homogenates…
Acknowledgements
תודות רבות איליין Pranski וקרולין Suwyn לקבלת סיוע טכני מעולה להארי לוין השלישי, מ 'פול מרפי, ומרלה תשלובת עבור שיחות חשובות. המימון ניתן על ידי RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, קרן Woodruff של אוניברסיטת אמורי ועדת המחקר.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
