SDS-PAGE/Immunoblot Detektion av A-beta Multimers i Human kortikala Tissue homogenat med antigen-epitopåtervinning
Summary
Vi beskriver en teknik för beredning av klargjorde mänskliga kortikal homogenat, protein separation av SDS-PAGE, antigenåtervinning och immunoblotting med en antikropp mot A-beta-peptiden. Med hjälp av detta protokoll, upptäcka vi konsekvent monomera och multimeric A-beta i kortikala vävnad från människor med Alzheimers patologi.
Abstract
Den avvikande vikning och polymerisation av β-amyloid (A-beta) är peptid tänkt att inleda neurodegenerativa kaskaden vid Alzheimers sjukdom patogenes<sup> 1</sup>. A-beta är främst en 40 – eller 42-aminosyra peptid som är benägen att själv-aggregation till β-sheet-rika amyloidfibrerna som finns i kärnor av cerebral senila plack vid Alzheimers sjukdom. Ökande bevis tyder på att lågmolekylärt, lösligt A-beta multimers är giftigare än fibrillar A-beta-amyloid<sup> 2</sup>. Identifiering och kvantifiering av låg-och hög molekylvikt multimeric A-beta-arter i hjärnvävnaden är ett viktigt mål vid Alzheimers sjukdom forskning och de metoder som används också kan användas för identifiering och karakterisering av giftiga multimers i andra proteopathies<sup> 3</sup>. Naturligt förekommande A-beta multimers kan detekteras av SDS-polyakrylamidgelelektrofores följt av immunoblotting med A-beta-specifika antikroppar. Kräver emellertid separation och detektion av multimeric A-beta användning av starkt koncentrerad kortikal homogenat och antigenåtervinning i små por-storlek nitrocellulosa membran. Här beskriver vi en teknik för beredning av klargjorde mänskliga kortikal homogenat, separation av proteiner med SDS-PAGE, och antigen-epitopåtervinning / Western blotting med antikroppar 6E10 till N-terminalen regionen av A-beta-peptiden. Med hjälp av detta protokoll, upptäcka vi konsekvent A-beta-monomerer, dimerer, trimerer, tetramers och högre molekylär multimers vikt i kortikala vävnad från människor med Alzheimers patologi.
Protocol
Discussion
Trots betydelsen av A-beta-aggregering i patogenesen av Alzheimers sjukdom 1,4,5, har få studier som beskrivs eller kvantifieras fördelningen av olika A-beta multimers i mänskliga kortikala vävnadsprover 2. Vanligen används immunhistokemiska tekniker tillåter inte diskriminering av olika multimeric A-beta-arter i fasta kortikal vävnad. I ofixerade kortikal vävnad homogenat, kan A-beta multimers separeras och biokemiskt bedömas med hjälp av gelelektrofores och antikroppsbaserade metoder f?…
Acknowledgements
Många tack till Elaine Pranski och Carolyn Suwyn för utmärkt tekniskt bistånd och till Harry Levine III, M. Paul Murphy, och Marla Gearing för viktiga samtal. Finansiering gavs av RR-00.165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, den Woodruff Foundation och Emory University forskning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
