Summary

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion av A-beta Multimers i Human kortikala Tissue homogenat med antigen-epitopåtervinning

Published: April 23, 2010
doi:

Summary

Vi beskriver en teknik för beredning av klargjorde mänskliga kortikal homogenat, protein separation av SDS-PAGE, antigenåtervinning och immunoblotting med en antikropp mot A-beta-peptiden. Med hjälp av detta protokoll, upptäcka vi konsekvent monomera och multimeric A-beta i kortikala vävnad från människor med Alzheimers patologi.

Abstract

Den avvikande vikning och polymerisation av β-amyloid (A-beta) är peptid tänkt att inleda neurodegenerativa kaskaden vid Alzheimers sjukdom patogenes<sup> 1</sup>. A-beta är främst en 40 – eller 42-aminosyra peptid som är benägen att själv-aggregation till β-sheet-rika amyloidfibrerna som finns i kärnor av cerebral senila plack vid Alzheimers sjukdom. Ökande bevis tyder på att lågmolekylärt, lösligt A-beta multimers är giftigare än fibrillar A-beta-amyloid<sup> 2</sup>. Identifiering och kvantifiering av låg-och hög molekylvikt multimeric A-beta-arter i hjärnvävnaden är ett viktigt mål vid Alzheimers sjukdom forskning och de metoder som används också kan användas för identifiering och karakterisering av giftiga multimers i andra proteopathies<sup> 3</sup>. Naturligt förekommande A-beta multimers kan detekteras av SDS-polyakrylamidgelelektrofores följt av immunoblotting med A-beta-specifika antikroppar. Kräver emellertid separation och detektion av multimeric A-beta användning av starkt koncentrerad kortikal homogenat och antigenåtervinning i små por-storlek nitrocellulosa membran. Här beskriver vi en teknik för beredning av klargjorde mänskliga kortikal homogenat, separation av proteiner med SDS-PAGE, och antigen-epitopåtervinning / Western blotting med antikroppar 6E10 till N-terminalen regionen av A-beta-peptiden. Med hjälp av detta protokoll, upptäcka vi konsekvent A-beta-monomerer, dimerer, trimerer, tetramers och högre molekylär multimers vikt i kortikala vävnad från människor med Alzheimers patologi.

Protocol

Del 1: Förberedelse av förtydligas vävnad homogenat Dounce homogenisera ofixerade kortikal vävnad i 4 gånger volymen av iskall buffert (0,1 miljoner fosfatbuffrad koksaltlösning [Ca + + – och Mg + +-free] plus 2x proteashämmare cocktail [Santa Cruz]) med cirka 30 till och med mortelstöt stroke (dvs lägga 400μl buffert till 100 mg vävnad). Spin homogenat i 5 minuter vid 3000 g (4 ° C). Ta försiktigt bort förtydligas supernatanterna och alikvoter lagrar av dessa extrakter vid -80 ° C fr…

Discussion

Trots betydelsen av A-beta-aggregering i patogenesen av Alzheimers sjukdom 1,4,5, har få studier som beskrivs eller kvantifieras fördelningen av olika A-beta multimers i mänskliga kortikala vävnadsprover 2. Vanligen används immunhistokemiska tekniker tillåter inte diskriminering av olika multimeric A-beta-arter i fasta kortikal vävnad. I ofixerade kortikal vävnad homogenat, kan A-beta multimers separeras och biokemiskt bedömas med hjälp av gelelektrofores och antikroppsbaserade metoder f?…

Acknowledgements

Många tack till Elaine Pranski och Carolyn Suwyn för utmärkt tekniskt bistånd och till Harry Levine III, M. Paul Murphy, och Marla Gearing för viktiga samtal. Finansiering gavs av RR-00.165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, den Woodruff Foundation och Emory University forskning.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets   Santa Cruz Biotechnology Sc-29130 1 tablet in 25ml buffer
BCA Protein Assay kit   ThermoFisher Scientific 23225  
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark   Invitrogen EI0002  
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)   Invitrogen LC1676  
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)   Invitrogen NP0004  
SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard   Invitrogen LC5925  
Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well   Invitrogen EC6625BOX  
Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size   Invitrogen LC2000  
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)   Invitrogen LC1675  
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)   Invitrogen LC3675  
SimplyBlue SafeStain   Invitrogen LC6060 Will not interfere with immunostaining
ATX Ponceau S Red staining solution   Sigma Aldrich 09276 Will not interfere with immunostaining
Kapak heat sealable plastic sample pouches   Fisher Scientific 0181225AA  
6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16)   Covance SIG-39320 Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
Tween 20   Sigma Aldrich P2287  
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep)   GE Healthcare Life Sciences NA931-1ML Dilute at 1:10,000
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate   ThermoFisher 34077  
Kodak Biomax MR Film   Carestream Health 870 1302  

References

  1. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
  2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  3. Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
  4. Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
  5. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
  6. Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
  7. Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).

Play Video

Cite This Article
Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).

View Video