Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana Published: May 29, 2010 doi: 10.3791/1925
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Energy - Plant Research Laboratory, Michigan State University (MSU), 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University (MSU)

Summary

Молекулярные основы пространственно-конкретных ответов фитохрома в настоящее время исследованы с помощью трансгенных растений, которые обладают тканей и органов конкретных фитохрома недостатков. Выделение специфических клеток выставке индуцированных фитохрома истощения хромофора по флуоресценции, активированных сортировки клеток следуют анализ микрочипов в настоящее время используется для идентификации генов, вовлеченных в пространственно-конкретных ответных фитохрома.

Protocol

1. Роста растений

  1. Подтвержденные UAS-BVR X GAL4-GFP усилитель ловушку линии выделяли, как описано 4 (для резюме см. рис. 1) и дикого типа или родительских линий и посеянное на почве, т.е. ~ 2000 стерилизованных семян на линии.
  2. Растения выращиваются в течение 5 недель на почве под белой подсветкой из 100 μmolm -2 с -1 при 22 ° С и влажности 70%.

2. Лист протопластов Изоляция (адаптировано из Денеке и Витале 9)

  1. Для выделения протопластов, подготовить TEX буфера. За 1 буфера литр TEX, отвешивать следующие компоненты: 3,1 г Gamborg в B5 соли, 0,5 г 2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты (MES, 2,56 ммоль), 0,75 г дигидрата хлорида кальция (CaCl 2 · 2H 2 O, 6,75 мМ), 0,25 г нитрата аммония (NH 4 NO 3, 3,12 мМ), 136,9 г сахарозы (0,4 М). Растворите компоненты полностью в ~ 900 мл деионизированной, дистиллированной воды (DDH 2 O) и довести рН до 5,7 с 1 М КОН. Принесите конечного объема до 1 литра и фильтр стерилизуют при 0,2 мкм бутылку-топ фильтр связан с вакуумным насосом.
  2. Сбор зеленый, здоровые листья из растений (~ 250 мл листьев свободно упакованных в стакане) и промойте ~ 40 мл DDH 2 O 4 раза, с последующей промывкой в два раза стерильной DDH 2 O. Использование № 20 скальпеля, нарезать листья на тонкие полоски ткани и разделить поровну на две 50 мл стерильные пробирки, пластик. Приготовьте 1х лист пищеварения смесь, добавив 5 мл аликвоту 10x лист пищеварения маточного раствора (10x лист пищеварения маточного раствора: растворить 2% вес / Macerozyme R-10, 4% вес / Целлюлаза "Onozuka" R-10 в TEX буфера, фильтр стерилизуют при 0,2 мкм и заморозить 5 мл аликвоты при -80 ° C) до 45 мл свежего буфера TEX. Добавить ~ 25 мл 1x лист пищеварения смесь на 50 мл трубку, чтобы охватить все ткани листа.
  3. Вакуумные проникнуть в ткани листа пищеварения смесь в открытой трубы в течение 1 часа при комнатной температуре, используя вакуум-эксикаторе связано с водяным насосом, затем 3-часовой инкубации при комнатной температуре на рокер с осторожном встряхивании. Capped труб с ткани листа в 1x смесь пищеварения листа хранятся завернутые в алюминиевую фольгу в ходе этого процесса, чтобы предотвратить воздействие света.
  4. Через 3 часа, увеличение рокер скорость ~ 2 минуты, чтобы освободить протопластов. Фильтры сырой подвески протопласт через два слоя стерильной тканью сыра для удаления мусора и сбор фильтрата в стерильном стакане стекла. Фильтры фильтрата через стерильный 100-мкм нейлоновая сетка в стерильную чашку Петри. Сбор течь через и перенести его на новые стерильные 50 мл трубки. Используйте около 15-20 мл свежего буфера TEX мыть стерильную чашку Петри и собирать протопластов присоединения к поверхности.
  5. Центрифуга потока за счет использования ротора качели ведро на 100xg при 10 ° С в течение 15 мин (ускорение 6, замедление 0).
  6. Удалить ~ 25 - 30 мл жидкости ниже плавающий слой протопласта, который содержит остаточные и гранулированного мусора, стерильным 9 "стеклянной пипетки Пастера подключен к перистальтического насоса, не нарушая плавающий слой протопластов и оставив ~ 10 - 15 мл.
  7. Добавьте свежие буфера TEX до конечного объема 40 мл, мягко ресуспендированием протопластов.
  8. Повторите шаги с 2,5 до 2,7 раза, чтобы удалить как можно больше продуктов распада клеток, как это возможно. Центрифугирования время сокращается до 10 минут в течение первого повторения и до 5 минут в финале повторения.
  9. Аспирируйте плавающей протопластов с разрезом, стерильный 1 мл передачи пипетки в новый 15 мл трубки. Перейдем непосредственно к сортировке и хранить в темноте в течение до 2 часов при температуре 4 ° С до сортировки.

3. Протопластов Сортировка по флуоресценции, активированных сортировки клеток (FACS)

  1. Перед сортировкой, изучить протопластов с помощью конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM) с использованием 488-нм лазером для возбуждения для подтверждения целостности протопласта и наличие флуоресценции GFP протопластов бассейн. Минимальная мусора необходимо, чтобы избежать засорения сопла FACS сортировки.
  2. Сортировать изолированных протопластов в TEX буфера с помощью FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) с использованием 200-мкм сопла на макро-глава рода на случай ставок между 6000 и 15000, с системой давление около 9 фунтов на квадратный дюйм следующий адаптированный протокол 10.
  3. Дикого типа не-GFP протопластов используются для определения аутофлюоресценция порогов.
  4. Для сбора GFP-положительных протопластов, сортировка клеток с использованием воздушного охлаждения аргоновый лазер (Spectra Physics модели 177, Newport Corporation, Irvine, CA) работает при 100 мВт на 488-нм линий аргона для выявления флуоресценции с помощью GFP 530/30 группы фильтр.
  5. После сбора GFP-положительных протопластов, изучить отсортированы по CLSM протопластов, как описано в пункте 3.1.
  6. Извлечение общей РНК из отсортированных протопластов использованием завод Qiagen RNeasy Mini Kit. кДНК могут быть подготовлены для гибридизации, как описано в Affymetrix GeneChip Expression Анализ Техническое руководство и гибридизации с AtH1 Arabidopsis Affymetrix целом массивы генома.

Представитель Результаты

Мы обнаружили значительное количество GFP-положительных клеток в канале GFP по FACS (рис. 2). В анализах оптимизации использования GFP усилитель-ловушки родителей, конститутивно GFP-экспрессирующих линии, J0571, отображается ~ 17% до 24% GFP-положительных протопластов, тогда как линия с сосудистыми и кожными выражения, J1071, был ~ 1,4% GFP-положительных протопластов (табл. 1). Сортировка 3 х 500 мкл (~ 1,5 мл в общей сложности протопластов приостановка) J0571 протопластов в течение 1 ч дали ~ 100000 GFP-положительных протопластов. Сортировка 3 х 500 мкл (~ 1,5 мл полную остановку протопластов) из J1071 протопластов в течение 1,5 ч дали ~ 3000 GFP-положительных протопластов. Конфокальной изображений указано очень высокий выход протопластов как для J0571 и J1071 образцов до сортировка была проведена (рис. 3C и 3E), и отсортированных фракций, содержащихся только яркие GFP-люминесцентные протопластов (рис. 3G и данные не приведены). Это открытие подтверждает, что нетронутые GFP-положительных протопласты могут быть отсортированы по СУИМ. Не-GFP протопластов также можно сортировать и собраны в отдельный канал. Не-GFP протопластов служить идеальным отрицательного контроля для последующего анализа микрочипов для выявления конкретных изменений в экспрессии генов при восстановлении holophytochrome уровнях. РНК извлечения из изолированных протопластов (1 мл) дает РНК в достаточном количестве для обнаружения fluorospectrometry (рис. 4). Изолированные РНК оценивали с помощью NanoDrop инструмента (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) и количественно NanoDrop 3.7.1 программного обеспечения количественной РНК. РНК урожайности предварительно отсортированные C24 дикого типа протопластов или FACS-сортируются, GFP-положительных протопластов усилитель ловушку превысил менее 20 нг необходимые для использования в РНК-маркировки анализов для микрочипов (табл. 2).

Enhancer Ловушка линии % От GFP-положительных протопластов Количество отсортированных протопластов GFP
J0571 17,18% ~ 24,06% 26400 ~ 36000
J1071 ~ 1,43% 1000 ~ 1300

Таблица 1. Процент GFP-положительных протопластов из двух усилитель ловушку линии до сортировки и количество GFP-положительных протопластов собранные работает 500 мкл суспензии через протопласт флуоресценции Активированный сотовый Сортировщик (FACSVantage, BD).

Завод линии РНК-выход (нг)
C24 WT 12486,5
J0571 60
J1071 71,5

Таблица 2. Выход из РНК изоляции от протопластов. РНК выделяли из предварительно отсортированные C24 дикого типа или отсортировать GFP-положительных протопластов из двух линий усилитель ловушку и количественно.

Рисунок 1
Рисунок 1. GAL4 усилитель-ловушки основе индукции биливердин редуктазы (BVR) экспрессии в трансгенных растений Arabidopsis thaliana. (А). Человек, выбранный из библиотеки GAL4 основе усилитель ловушку линий, которые содержат GAL4 проблематику маркерный ген GFP, могут пересекаться со строки, содержащей GAL4 проблематику гена-мишени, чтобы вызвать экспрессию гена-мишени в GAL4 содержащей ячейки, помеченные GFP по флуоресценции. На основе рисунка из д-р Джим Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) производство фитохрома хромофора, phytochromobilin (PΦB) и holophytochrome в родительских линий. (С) Влево, сокращение биливердин IXα (BV IXα) и PΦB по биливердин редуктазы (BVR) деятельности БР и PΦR, соответственно. BVR активности приводит к истощению PΦB и приводит к сокращению производства фотоактивных holophytochrome. Правильно, реакции, катализируемой BVR показано.

Рисунок 2
Рисунок 2. Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) приобретение участков точка. Сравнение протопластов сортировки клеток для C24 дикого типа (А), J0571 (Б) и J1071 (С). () Приобретение точкой сюжета не-GFP флуоресцентные C24 дикого типа протопластов возбуждаются 488-нм аргонового лазера и используется для определения аутофлюоресценция порога. (B) и (С) участков приобретение точка показать пропорции протопластов, которые являются положительными GFP в ответ на возбуждение 488-нм лазером. R3 сортировки ворота в В и С разграничить GFP-положительных целей, которые были отсортированы по флуоресценции, активированных сотовый Сортировщик (FACSVantage, BD) и собраны. Красный канал указывает гalues ​​для хлорофилла аутофлюоресценция из протопластов и зеленый канал указывает значения для GFP флуоресценции.

Рисунок 3
Рисунок 3. Конфокальной микроскопии протопластов растений используется для сортировки клеток. Конфокальной лазерной отсканированных изображений протопластов до (А, С, Е) и после (G), сортировка по флуоресценции, активированных сотовый Сортировщик (СУИМ). B, D, F и Н DIC изображений. Протопластов C24 дикого типа (А, В), J1071 (C, D) и J0571 (E, F, G, H) показаны. Изображения С, Е и G были объединены образы GFP флуоресценции (ВР 505 нм - 575 нм) и флуоресценции (LP 650 нм), полученных из возбуждение с 488-нм лазером. Через Н среднем на 4 сканирует под 63x нефти. Bar = 10 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4. Количественная оценка РНК, выделенной из протопластов по fluorospectrometry. РНК, выделенная из (А) C24 дикого типа, (B), J0571, и (C) J1071. Указывает РНК для предварительно отсортированных дикого типа протопластов. B и C указывают на РНК из GFP-положительных протопластов, упорядоченные по флуоресценции, активированных сортировки клеток (FACS). РНК количественного программного обеспечения, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспрессия генов профилирования через микрочипы (1) показал, что более 30% генов Arabidopsis сеянцы света регулируется 11 и (2) выявила обширная группа генов, кодирующих светового сигнала трансдукции белков, участвующих в фитохрома сигнальный каскад 12, 13 . Такие эксперименты позволяют предположить, что свет вызывает быстрое и долгосрочные изменения в экспрессии генов. Каждый пул фитохромов может контролировать только часть развития и адаптивные реакции. Более того, вполне вероятно, что ниже по течению сигнализации компоненты взаимодействуют с фитохромов в клеточной и тканевой конкретным образом 2, 14, 15.

Выражение вниз по течению генов-кандидатов может быть вверх или вниз регулируемой по целевой выражение BVR. Через сравнительный анализ экспрессии генов изменения в UAS-BVR X GAL4-GFP потомства и родительских линий, мы можем определить различные изменения в экспрессии генов, когда такие изменения являются следствием локализованных фитохрома недостатков. На основе профилей экспрессии генов, мы сможем выделить гены, которые кодируют негативные и позитивные факторы в фитохрома-опосредованной клетки к клеточной сигнализации. Последние данные свидетельствуют о том, что несколько сотен стенограммы индуцированные protoplasting растительной ткани 16. Таким образом, идеальный отрицательного контроля для анализа микрочипов является РНК, выделенной из не-GFP протопластов собранные во время сортировки. Стенограммы, которые вызваны protoplasting растительной ткани могут быть исключены из данных анализа с помощью этих элементов управления, что приводит к идентификации генов-мишеней в особенности связанных тканей и органов конкретных фитохрома сигнализации и / или ответы. Чтобы убедиться в стационарном изменения в экспрессии генов, выявленная в ходе камерного типа-конкретное выражение профилирование, QRT-PCR может быть осуществлена ​​на поли (А) РНК из отсортированных GFP-положительных и GFP-отрицательные протопластов.

Гены, чья экспрессия существенно изменилась в микрочипов анализа и подтверждены QRT-PCR определены в качестве кандидатов, участвующих в дискретных фитохрома-опосредованной межклеточной сигнализации. Если Т-ДНК мутантов вставки уже доступны в генов-кандидатов, они могут быть проанализированы на свет с нарушениями фенотипы. Сравнивая фенотипы мутантов проведения мутации в гены-кандидаты и известные фитохрома мутантов дикого типа, мы можем определить конкретные ответы, в которых гены-кандидаты имеют нормативной роли. Если мутанты с мутациями генов-кандидатов дисплей фитохрома с дефицитом фенотипы, это подтвердит, что определены ниже по течению генов-мишеней участвуют в посредничестве различных фитохрома регулируемых реакций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Работа в Монтгомери лаборатории на фитохрома ответы в растениях при поддержке Национального научного фонда (грант №. MCB-0919100 с БЛМ) и химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке департамента США Энергия (грант №. DE FG02 91ER20021 для BLM). Мы благодарим Мелисса Уитакер за техническую помощь во время съемок и критически чтения рукописи, Стефани Костиган для экспериментальных помощи, доктор Louis King за помощь в разработке и оптимизации флуоресценции, активированных сортировки клеток Arabidopsis протоколов для сортировки протопластов и д-р Мелинда Рамка для помощи конфокальной микроскопии. Мы благодарим Марлен Камерон для графического дизайна и помощь Карен птиц за помощь в редактировании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BVR antibody QED Bioscience Inc. 56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10 SERVA Electrophoresis MSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixture Sigma-Aldrich G5768
Macerozyme R-10 SERVA Electrophoresis PTC 001
MES, low moisture content Sigma-Aldrich M3671
Murashige and Skoog salts Caisson Laboratories 74904
Phytablend Caisson Laboratories 28302
RNeasy Plant Minikit Qiagen 16419

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
  2. Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
  3. Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
  4. Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
  5. Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
  6. Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
  7. Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
  8. Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
  9. Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
  10. Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
  11. Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
  12. Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
  13. Ulm, R., &, N. agy, F, Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
  14. Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
  15. Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. hory, J, Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
  16. Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).

Tags

Биологии растений выпуск 39 Arabidopsis thaliana конфокальной микроскопии выражение профилирование микрочипов флуоресценция FACS photomorphogenesis фитохрома protoplasting
Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в<em> Arabidopsis thaliana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warnasooriya, S. N., Montgomery, B.… More

Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925, doi:10.3791/1925 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter