Summary
Magnetico modulazione del sistema sensori biologici è utilizzata in modo rapido, con sensibilità e semplicemente rilevare saggi biologici, come le molecole di DNA e proteine.
Abstract
Un sistema di modulazione magnetica sensori biologici (MMB) [1,2] rapidamente e omogeneamente rilevato bersagli biologici a basse concentrazioni, senza lavaggio o fase di separazione. Quando l'IL-8 bersaglio era presente, un 'sandwich' saggio basato su sfere magnetiche attaccato con IL-8 anticorpo di cattura per streptavidina accoppiato proteina fluorescente attraverso l'IL-8 e un obiettivo biotinilato IL-8 anticorpi. Le sfere magnetiche sono manovrati in movimento oscillatorio applicando un gradiente di campo magnetico alternato attraverso due poli elettromagnetici. Le proteine fluorescenti, che sono attaccati ai talloni magnetici sono condensate nella zona di rilevamento e il loro movimento dentro e fuori di un raggio laser ortogonali produce un segnale periodico fluorescente che viene demodulato utilizzando il rilevamento sincrono. Il sistema di sensori biologici di modulazione magnetica è stato precedentemente utilizzato per rilevare le sequenze codificanti della proteina non strutturale del virus Ibaraki 3 (NS3) DNA complementare (cDNA) [2]. Le tecniche che si dimostrano in questo lavoro per la manipolazione esterna e la condensazione delle particelle possono essere utilizzate per altre applicazioni, ad esempio la consegna di farmaci magneticamente accoppiati
Protocol
IL-8 saggio:
- La miscela di reazione compresi i seguenti quattro componenti in 100 microlitri di volume finale di tampone nelle loro rispettive concentrazioni. 10 ml di sfere magnetiche con anticorpo di cattura a 100 perline / mL concentrazioni finali, 2 l di biotinilato IL-8 a 1 la concentrazione di anticorpi nano-gram/μl finale, 1 l di streptavidina proteina fluorescente a 20 nano-gram/μl concentrazione finale, e 1 ml di IL-8 target a 0,48 pico-gram/μl. I componenti vengono aggiunti uno ad uno per il tampone e poi agitato per 30 minuti.
- Una reazione di controllo è preparato allo stesso modo senza l'IL-8 di destinazione.
- Le reazioni sono poi collocati senza alcuna separazione o lavaggio in cuvette e controllati con il sistema MMB.
MMB sistema:
- Posizionare la cuvetta nella sua posizione tra i due poli elettromagnetici.
- Operare la corrente di modulazione ed attendere 30 secondi per consentire l'aggregazione e la condensazione delle perle
- Misurare il segnale del amplificatore lock-in con un oscilloscopio.
Rappresentante dei risultati:
Ispezione visiva delle perle aggregati presentato una netta differenza tra la reazione con il target e la reazione senza il bersaglio. In tutte le reazioni con il bersaglio, le perle formano un unico aggregato denso che si muoveva dentro e fuori il raggio laser in modo uniscono. Tuttavia, in tutti la reazione senza il bersaglio, le perle erano meno aggregata e il loro movimento è stato meno unire (vedi Figura 1).
Figura 1: ispezione visiva del immunodosaggio a sandwich '(a) senza l'obiettivo di IL-8 (b) con l'obiettivo di IL-8.
L'orologio di modulazione palo (giallo) e il segnale di uscita PMT (magenta), mentre la rilevazione 0,48 pico grammi IL-8 di destinazione sono presentati nella figura 1 (a). La modulazione di frequenza per ogni polo è a 2 Hz. Tuttavia, come è stato previsto teoricamente, quando le perline passare il raggio laser, la PMT rileva la luce fluorescente e non vi è un picco della tensione di uscita PMT. Pertanto, la frequenza di demodulazione è a 4 Hz. Quando il segnale di PMT e il raddoppio-modulazione dell'orologio (a 4 Hz), sono alimentati per il blocco amplificatore, il rilevatore di fase sensibile rileva la sincronizzazione e risultati con alta tensione (vedi Figura 2).
Figura 2: (a) l'orologio di modulazione (giallo) e il segnale di PMT (magenta) quando il rilevamento 0,48 pico grammi di IL-8 di destinazione. (B) Il blocco provocato tensione amplificatore a due diverse scansioni.
Il blocco amplificatore non ha rilevato alcun segnale quando il campione di controllo è stato testato. Questo fatto, insieme con la differenza visiva di aggregazione suggerisce che il sistema MMB può chiaramente identificare la presenza di IL-8 di destinazione.
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Discussion
In sintesi, abbiamo dimostrato che il sistema MMB può essere utilizzato per rilevare la presenza di IL-8 bersaglio a basse concentrazioni (0,5 pico grammi è il limite di rilevabilità del Bio-Plex saggi di citochine Precision Pro [3,4]). La capacità del sistema non si limita a IL-8 e può essere utilizzato per rilevare altre proteine. I vantaggi del sistema MMB sono la capacità di individuare il target rapidamente e senza alcuna separazione o fase di lavaggio. Così, facilita il processo di rilevamento e consente al sistema di essere utilizzato in applicazioni sul campo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Horowitz Ishaya Fondo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set | Bio-Rad | 171-B5008M | |
| Recombinant human IL-8 target | Thermo Fisher Scientific, Inc. | R202625 | |
| Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 | BD Biosciences | 554718 | |
| Streptavidin coupled fluorescent protein | Bio-Rad | Streptavidin PE |
References
- Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
- Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
- Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
- Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.
