Summary
Magnetisk modulering biosensing systemet utnyttjas för att snabbt, lyhört och enkelt upptäcka biologiska analyser, såsom DNA-molekyler och proteiner.
Abstract
En magnetisk modulering biosensing system (MMB) [1,2] snabbt och homogent upptäcks biologiska mål vid låga koncentrationer utan tvätt eller separation steg. När IL-8 mål var närvarande, en "sandwich'-baserad analys fäst magnetiska kulor med IL-8 fånga antikroppar mot streptavidin kombination fluorescerande proteinet via IL-8 mål och en biotinylerad IL-8 antikropp. Den magnetiska kulor manövreras i oscillerande rörelse med hjälp av en växlande magnetfältsgradienten genom två elektromagnetiska poler. Den fluorescerande proteiner, som är knuten till magnetiska kulor sammanställs till att upptäcka området och deras rörelser in och ut ur en ortogonal laserstråle ger en periodisk fluorescerande signal som demodulerade synkrona upptäckt. Den magnetiska modulering biosensing system som tidigare användes för att upptäcka kodande sekvenser av de icke-strukturella Ibaraki virusprotein 3 (NS3) kompletterande DNA (cDNA) [2]. De tekniker som demonstreras i detta arbete för extern manipulation och kondensation av partiklar kan användas för andra tillämpningar, t.ex. leverans av magnetiskt kopplade läkemedel
Protocol
IL-8 analysen:
- Reaktionsblandningen ingår följande fyra komponenter i 100 l slutlig volym på analysens buffert i sina respektive koncentrationer. 10 ìl av magnetiska pärlor med fånga antikroppar vid 100 pärlor / l slutkoncentrationer, 2 ìl biotinylerad IL-8-antikroppar vid 1 nano-gram/μl slutlig koncentration, 1 ìl streptavidin fluorescerande proteinet vid 20 nano-gram/μl slutlig koncentration, och 1 l av IL-8 mål på 0,48 pico-gram/μl. Komponenterna läggs en efter en att analysen buffert och sedan skakas i 30 minuter.
- En kontroll reaktion är förberedd på samma sätt utan IL-8 mål.
- Reaktionerna är senare placeras utan separation eller tvätt steg i kyvetter och kontrolleras med hjälp av MMB systemet.
MMB systemet:
- Placera kyvetten i sin position mellan de två elektromagnetiska poler.
- Använd modulering nuvarande och vänta 30 sekunder på att aggregering och kondensering av pärlor
- Mät signalen från lock-in förstärkare med ett oscilloskop.
Representativa resultat:
Visuell inspektion av den aggregerade pärlor fram en tydlig skillnad mellan reaktion med målet och den reaktion utan målet. I alla reaktioner med målet bildade pärlorna en enda tät aggregat som flyttat in och ut laserstråle i en förena sätt. Men i alla reaktion utan målet var pärlorna mindre aggregerade och deras rörelse var mindre förenas (se figur 1).
Figur 1: visuell kontroll av sandwich "immunoassay (a) utan målet IL-8 (b) med målet IL-8.
Stången modulering klocka (gul) och PMT utsignal (magenta) medan upptäcka 0,48 pico-gram IL-8 mål presenteras i figur 1 (ett). Den modulering frekvens för varje pol är 2 Hz. Eftersom det teoretiskt var väntat, då kulorna passerar laserstrålen upptäcker PMT den fluorescerande ljus och det finns en topp i PMT utspänning. Därför är demodulation frekvensen 4 Hz. När PMT signalen och fördubblat-modulering klocka (vid 4 Hz) matas till slussen i förstärkaren, upptäcker den känsliga fasen detektor synkroniseringen och resultat med hög spänning (se figur 2).
Figur 2: (a) modulering klocka (gul) och PMT-signal (magenta) när detektering 0,48 pico-gram IL-8 mål. (B) resulterade låset i förstärkare spänning på två olika genomsökningar.
Låset förstärkaren inte upptäcka några signal när kontrollprovet testades. Detta faktum, tillsammans med den visuella skillnaden i sammanläggning tyder på att MMB systemet tydligt kan identifiera förekomsten av IL-8 mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammanfattningsvis visade vi att MMB systemet kan användas för att upptäcka förekomsten av IL-8 mål vid låga koncentrationer (0,5 pico-gram är detektionsgränsen av Bio-Plex Precision Pro cytokin-analyser [3,4]). Förmågan hos systemet är inte begränsat till IL-8 och kan användas för att upptäcka andra proteiner. Fördelarna med MMB systemet är förmågan att upptäcka mål snabbt och utan separation eller tvätt steg. Därför underlättar det att upptäcka processen och gör att systemet kan användas i fält applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Ishaya Horowitz fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set | Bio-Rad | 171-B5008M | |
| Recombinant human IL-8 target | Thermo Fisher Scientific, Inc. | R202625 | |
| Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 | BD Biosciences | 554718 | |
| Streptavidin coupled fluorescent protein | Bio-Rad | Streptavidin PE |
References
- Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
- Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
- Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
- Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.
