このプロトコルは、次の3つについて説明します<em>ショウジョウバエ</em>準備:目のディスク脳の複合体の解離を開発し1)成人の脳の解剖、2)成人の網膜の解剖、3)。すべての準備が固定組織の免疫組織化学のために使用することができますが重点は、特殊な調製技術とライブイメージングのための条件に置かれている。
市販<em>ショウジョウバエ</em>脳と視覚系が広くニューロンの発達、機能と変性を研究するモデルシステムを利用している。ここでは、3つの脳の準備と開発蛹の開発アイディスク、脳の複雑なから大人のハエから個々の眼と脳の解剖の範囲をカバーする視覚システムを示す。すべてのプロトコルは準備のライブ文化のために最適化されています。しかし、我々はまた、該当する固定組織の免疫組織化学のための条件を提示する。最後に、我々は、灌流チャンバ内に、従来と共振4D共焦点ライブイメージングを使用して、これらの製剤のためのライブイメージングの条件を示しています。一緒に、これらのプロトコルは、分の規模で機能的な細胞内アッセイから何時間もの規模で発達や変性過程に至るまで、さまざまな時間スケールでのライブイメージングの基礎を提供する。
イメージングのために使用する蛍光プローブ
ここでは、3つのクラスからの蛍光プローブの選択のためのショウジョウバエの視覚システムの準備の長所と短所を説明します。外因性に生きている組織の準備に追加される(1)プローブ、遺伝的にライブとの両方でエンコードされている(2)蛍光タンパク質固定イメージング、免疫組織化学のための固定された組織に追加される(3)蛍光色素。
1。外因性のプローブ:
LysotrackerグリーンDND – 26またはDND – 99レッド (インビトロジェン社)これらは、蛍光膜透過性の最も顕著に細胞、リソソームに強く酸性化のコンパートメントに蓄積する化合物、後期エンドソーム、およびオートファゴソーム市販されている。ナノモル濃度でLysotrackerは(我々は典型的には50 nmを使用して)1分以内に完全にL3とP +20%目のディスクを貫通している。 Lysotrackerは、継続的に蓄積し、5分未満でアルカリ化効果が、我々のイメージを発揮するので。目のディスクとは対照的に、Lysotrackerは組織を中断することなく、脳に浸透していません。しかし、外膜の涙慎重には、視葉内の少数の細胞の直径の浸透が可能になります。
Lysotrackerとは対照的にLysosensor DND – 189(インビトロジェン社)、Lysosensorは酸性コンパートメントに蓄積していませんが、展示物は酸性pHでの蛍光の増加。 LysosensorはLysotrackerと非常に似ている浸透特性があります。我々は、1μMの濃度でLysosensorを使用してください。
2。遺伝的に符号化されたプローブ:
多くのライブイメージング実験のために、我々はバイナリGal4/UAS発現システム12の制御下にGFP、TagRFP 10またはpH感受性pHluorin 11など、様々な蛍光分子でタグ付けされた遺伝子を発現する。光受容体の開発に表現するGAL4 -ラインはGMR – Gal4の(すべての光受容体)8とmDelta0.5 – Gal4の(R4とR7を開発する)13が含まれています。いくつかの亜型特異的なGAL4 -ドライバの行は、その使用、異なるロドプシンのプロモーター14が存在する。ライブイメージングで特に有用な蛍光プローブがphotoconvertible蛋白質である。我々は成功Dendra2、単量体、緑色から赤色photoconvertable蛋白質15を使用している。 Dendra2が488nmのアルゴンレーザーのラインを使用してphotoconvertibleなるように設計されていることに注意してください。しかし、我々は、従来のまたは共振どちら走査型共焦点モードで私たちのセットアップを使用して可視青色光を使用して変換を達成することはできません。対照的に、405nmのUVレーザとの変換が効率的です。
3。免疫組織化学:
固定成人の目には、私たちはしばしばrhabdomeric構造(図1A)を可視化するローダミンファロイジン(インビトロジェン社)または抗Chaoptin(光受容体特異的な抗体16)のいずれかを選択します。ラミナカートリッジの構造を分析するための良い方法は、抗chaoptin 16、グリアマーカー抗黒檀17、および抗SEC6 18(図1B)に結合することです。図に示す。 3、抗体のこの組み合わせは、大きなシナプス(chaoptin)とシナプス後部(SEC6)のプロセスだけでなく、薄板19の上皮グリア(黒檀)を区別する。
灌流チャンバーの組み立て
ライブイメージングのために、我々は、組織の準備を妨げることなく、ソリューションの遅い交換を可能にする灌流チャンバーを採用。灌流チャンバアセンブリのデモは、ビデオに含まれており、模式的に図2に示します。灌流チャンバーの組立は、図5に示す。 2A。第一標本上のガスケットを敷設することから始めます、と示すように、アセンブリに進んでください。ガスケットの目的は、チャンバーの底と蓋、組織がシールされており、これによってソリューションが流れるの内部空間との間のスペースを作成することです。ガスケットの内側のスペースは、入口(解決策がここに入る)、組織の準備、およびソリューションは、チャンバを離れるに経由するコンセントを含める必要があります。ガスケットの2つの機能が重要です:まず、ガスケットはまだ高解像度レンズと撮像を可能にするのに十分に薄い脳のための十分な厚さでなければなりません。理想的なガスケットの厚さは、セットアップ固有のパラメータに依存します。第二に、ガスケットの切り込みが、バブルが試料(図2B)に問い合わせることなく通過できるようにするコンパートメントを提供します。
顕微鏡でのイメージング
我々は、直接スライド上の培養液中に灌流チャンバーまたは63xの水浸レンズ用63x(絞り1.3)グリセリン浸レンズを使用してください。グリセリンレンズは、油のレンズよりも多くの作動距離を提供します。我々は、従来のスキャナ(8000 Hzの対1400 Hzの、それぞれ)よりもはるかに速い速度でスキャン共鳴走査共焦点顕微鏡を使用してください。共鳴スキャンは高速で時間をかけて3次元記録を可能に二のフレームレート。さらに、より高速なスキャン速度が大幅に生きている組織の繰り返しスキャンするための主要な関心事であるレーザー光毒性6を減少させる。レーザー強度とPMT電圧(ゲイン)のバランスはノイズを最小限にし、退色しながら信号を最大にするために達成されなければならない。重要な今後の検討は、特定の地域でのレーザーの影響の量は解像度とズームによって決定されることである。例えば、選択の領域は512 × 512、ズーム1倍時のような256 × 256、ズーム2倍で同じ解像度でスキャンされ、まだ最大限に可能な限りのライブイメージング速度は、256 × 256でズーム2倍4倍高速です。 8000 Hzと2倍の行の平均のスキャン速度で10秒ごとにZ -スタックの速度でZ -スタックあたり5コマ:迅速に細胞内区画の移動の操作を記録するために、我々が正常に以下の設定で記録されている。時間のスケールで長いイメージングセッションでは、我々は多くの場合数分ごとに1つにフレームレートを削減し、準備がシフトする可能性が高いとして、より大きな領域を選択してください。
ショウジョウバエ視覚系の解剖学
図3は、 ショウジョウバエの成体の眼(図3A)、成人の脳(図3B)、および20〜25%蛹のアイディスク/脳の複雑な(図3C)の解剖学的構造を示しています。図3Aは、とや粘膜と接続されている脂肪細胞なしの両方大人の目を示しています。大人の目の解剖時には、光受容体の細胞体(左)によって形成されたボールに囲まれたアイの中央にある板は、、(右)の下に細胞体を中断せずに削除する必要があります。成人の脳の解剖のために、人は光受容体の細胞体、板、視葉、中央の脳、および気管(図3B)を区別することができるはずです。視葉に添付されたラミナを残しながら、光受容体と気管は、この解剖のために削除する必要があります。 20から25パーセント蛹のアイディスク/脳、複雑なの同定に役立つように、ライブイメージは、図3Cに示されている。
図1(A)成体の脳。 (B)大人の目。 (C)20%-25%蛹eye-disc/brain複合体。
図2(A)潅流チャンバーの組立と試験片の相対的な(B)ガスケットの位置決め。
図3()抗chaoptin使用して大人感桿分体染色。抗chaoptin(緑、光受容体)、抗黒檀(赤、グリア)、およびSEC6(青、介在ニューロン)を使用して、(B)アダルトラミナ染色。
この作品は、ウェルチ財団(I – 1657)とNIH(RO1EY18884)からの補助金によって支えられている。 PRHは、生物医学研究のユージンマクダーモットの学者である。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | ||
GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | ||
20-Hydroxyecdysone | Sigma | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment: