開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

Summary

このプロトコルは、次の3つについて説明します<em>ショウジョウバエ</em>準備：目のディスク脳の複合体の解離を開発し1）成人の脳の解剖、2）成人の網膜の解剖、3）。すべての準備が固定組織の免疫組織化学のために使用することができますが重点は、特殊な調製技術とライブイメージングのための条件に置かれている。

Abstract

市販<em>ショウジョウバエ</em>脳と視覚系が広くニューロンの発達、機能と変性を研究するモデルシステムを利用している。ここでは、3つの脳の準備と開発蛹の開発アイディスク、脳の複雑なから大人のハエから個々の眼と脳の解剖の範囲をカバーする視覚システムを示す。すべてのプロトコルは準備のライブ文化のために最適化されています。しかし、我々はまた、該当する固定組織の免疫組織化学のための条件を提示する。最後に、我々は、灌流チャンバ内に、従来と共振4D共焦点ライブイメージングを使用して、これらの製剤のためのライブイメージングの条件を示しています。一緒に、これらのプロトコルは、分の規模で機能的な細胞内アッセイから何時間もの規模で発達や変性過程に至るまで、さまざまな時間スケールでのライブイメージングの基礎を提供する。

Protocol

1。はじめこのビデオでは、我々は視細胞を中心としたライブイメージングと免疫組織化学のためにショウジョウバエの脳と網膜を準備する方法を説明します。最初に、我々は、脳の解剖のために準備する方法を示します。次に、我々はライブの準備のための基礎を形成する一般的な免疫組織化学に使用される2つの基本的な解剖のデモンストレーションを行います。これら二つの製剤は、成人の脳と眼の解剖です。次に、我々は、光受容体のライブイメージングのためのその使用法を重視した大人と脳の発達のライブイメージングに使用される解剖のデモンストレーションを行います。最後に、我々はどのようにイメージを生きている組織を説明し、共振共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングのいくつかの例が表示されます。 2。解剖の準備良い解剖では、シャープなピンセットが必要です。両端が細かい点で交わるまで研ぎブロックまたは非常に細かいサンドペーパー（> 1500）を使用して、軽く両側に前後に鉗子を渡します。我々は標準的な研ぎ石を使用してください。ここでは、シャープの技術をカバーし、しかし鋭い鉗子は、ライブ解剖のために不可欠であることに注意してくださいれません。我々はすべての解剖前にピンセットを研ぐ。 成人の脳の解剖のために、それらを麻酔し、目的の遺伝子型を整理してCO 2のパッドの上にハエを置きます。蛹のケースを壊すように注意しながら、蛹の解剖のために、単純にバイアルに到達し、慎重にピンセットで蛹を削除します。 水とキムワイプを湿らせ。あなたの鉗子からごみを削除するには、解剖時にこれを使用します。ステレオスコープのステージ上で解剖皿を置き、HL3溶液1で塗りつぶす。すべての解剖は、組織は、解剖の手順の間に生きていると健康なままであることを保証するためにHL3で行われます。また、我々は解剖時に鉗子を保護するためにSylgardのカバー底部を持っている解剖皿を使用してください。 今、あなたが免疫組織化学を実行する予定がある場合は解決策を修正する準備。 500μLマイクロチューブにHL3の180μL場所。 3.7％ホルムアルデヒド溶液を得るために37％ホルムアルデヒドの20μLを追加。 最後に、適切な手の位置は、良好な解剖のために重要です。良い手の位置で、あなたの鉗子は、着実かつ制御、微妙な動きが可能になります。最初に、親指の側に鉗子を置きます。その後、指の先端が上にかかっているようなまっすぐ下に人差し指をもたらす。今すぐあなたの中指の側面に鉗子の側面を休み、解剖皿に移動する。親指と中指で料理との物理的な接触を行う。皿に親指と中指を休んでいる間、顕微鏡ステージ上に手首を植える。この方法では、解剖時に表面にしっかりと三点を植え、それは、鉗子の非常に微妙な操作を行うことが可能になりました。このテクニックは、最初は少し抵抗を感じるかもしれないが、練習すれば、すぐに脳の解剖のマスターになります。 3。成人脳 CO 2パッドの上に、向きを大人は離れてあなたの手から頭と腹側を上に飛ぶ。ちょうど頭下胸部をつかむ。適切に行われれば、脚と口吻が長くなります。ステレオスコープの下に表示している状態で、頭を削除するには、鉗子で拡張口吻をつかむ。ボディと水没頭を捨てる。水中ヘッドに再び焦点を合わせる。全体の解剖は、ソリューションの下に実行されます。これは、常時鉗子で頭の上に保持するために非常に重要です。そうでなければ、頭が浮くと取得することは難しいでしょう。頭が解剖中にフォーカスの外に移動した場合、単に顕微鏡を調整することなく焦点面に戻すに移動します。この一見単純な作業では、最初は難しいかもしれませんが、焦点にあなたの頭を維持することは時間をかけて容易になるだろう。 第一口先と眼の間に結合組織を引き裂くことによって解剖を始める。常に少なくとも一つの鉗子でしっかりと保持している間に目で涙。脳の下の損傷を防ぐために、鉗子のつま先は、網膜やキューティクルの直下のみであるかどうかを確認。左右交互に、頭の後ろに向かって作業し、網膜を離れて引き裂くために、ピンセットを使用してください。網膜を離れて引き裂くことはラミナがこの解剖を通して視葉にアタッチしたままになっている可能性が増加します。途中でキューティクルを引き裂く、頭部の背部のまわり続ける。他の目で涙、キューティクルを引き離し始める。あなたがキューティクルをつかんでている限り、あなたは脳を粉砕されていない知っているように！これを念頭に、脳が明らかにされるまでは離れてキューティクルと網膜を引っ張っていきます。 脳が表示されていれば、あなたは、脳（図1A）に接続された気管を削除するために始めることができます。脳が特定されるまで気管とキューティクルにプルし続ける。この時点で、tのお皿の底に再び焦点を合わせる必要彼の残りの手順。あなたの脳がそうでなければ一晩抗​​体の洗​​浄中に浮かぶことがあるため、残りの気管を外します。光受容体端末のイメージングのための、それは板を保持することが望ましいですが、細胞体と強く自家蛍光顔料が含まれている網膜を、削除する必要があります。これを行うには、慎重に粘膜を損傷することなく、ふさふさと色素細胞の残骸で引っ張る。これは、細かいスキルであり、訓練が必要です。 成人の脳は、我々は第6節で議論する条件を使用して数時間あるいは数日を保つ事が可能である。免疫組織化学のために、成人の脳は現在、ホルムアルデヒドで固定する準備が整いました。2は、すでに準備作業を行った固定液に成人の脳を移動するために5μLに設定P20 pipettemanを使用してください。 40から10の頭脳をもたらすすべき、20分間大人の脳を解剖し続ける。さらに40分の修正で脳を残す、しかし、この期間は最適な一次抗体染色によって異なる場合があります。ホルムアルデヒド溶液を除去し、以下、PBS -トリトンと呼ばれるPBS、0.4％TritonX – 100を含む溶液の400μLで各5分間3回脳を洗う。完全に修正液を洗浄した後、一次抗体溶液を追加することがあります。 4。成人の目成人の脳で説明したようにこの解剖を始める。頭部を沈めると顕微鏡をリフォーカスした後、吻と眼の間に結合組織を引き裂くことから始めます。口先の上に、目からキューティクルを分離。今、頭の後ろに向かって作業し、目の裏側から表皮を分離。 one鉗子で、頭の後ろの中心をつかむ。他に、目をつかんで引っ張る。眼が（図1B）皿の底に沈降することができます。ラミナは、おそらくまだ目に添付され、この時点で完全に無傷の光受容細胞の端子のライブイメージングに使用することができます。光受容体の細胞体のライブイメージングを続行するには、セクション4.5に進んでください。次の3つのセクションでは、固定された目の免疫組織化学を説明する。 免疫組織化学のために、5μLに設定P20 pipettemanを使用してソリューションを固定するために目を移動する。 10分の合計のために大人の目を解剖し続ける。さらに30分の修正で目にしておきます。修正液と、成体の脳の解剖で説明されている行為の洗浄を削除します。 あなたが最終的に画像に目のommatidial構造を希望される場合ラミナが削除されている必要があります。あなたの解剖皿に固定された目を戻すと、まだ接続されているすべての気管や脂肪細胞を取り除く。次に、一方の鉗子と眼の外側を押しながら、他で板を取り外します。それはcellbodies下（図1B）を公開し、一体で外れるはず。唯一の薄板をつかむように注意してください！そうしないと、網膜から視細胞を切り離し危険性があります。 P20のpipettemanを使用して、500uLチューブに400uL PBS -トリトンに目を移動する。静かに光受容体からの自家蛍光赤色色素を除去するために一晩4℃で、それらを揺すり。次の日、あなたは、洗浄溶液を破棄し、一次抗体溶液を追加することがあります。 大人の目のライブイメージングのために我々は唯一のpharate大人のハエを使用して、間もなく羽化する前に後期のサナギ、すなわち。この段階では、解剖時の葉身の端末から別の光受容体の細胞体。 Pharate大人蛹は蛹のケースを通して見える明確に定義された翼、目、そしてキューティクルを持っている。蛹を選択して、頭部を露出させる蛹の例前方部分を削除してください。慎重に、さらに発展フライを囲む薄い内膜を取り除く。あなたの鉗子とプルの頭のベースをつかむ。頭が水中に保ちながら蛹の残りを捨てる。 免疫組織化学のための目の解剖で示すように進んでください。 pharate大人の段階では、しかし、光受容体の細胞体では、画像の網膜に囲まれた細胞体をできるように、薄板からより容易に分離させます。また、ラミナでは、画像の遠位薄板をできるように、視葉に接続されたままになります。あなたがイメージする光受容体端末のカートリッジを見ることができる近位ラミナを、ご希望の場合は、葉身はもっと強く眼に添付されている大人のその場で目の切開を行います。 5。アイディスク脳の複合体を開発比較的大きな開発細胞のこの単層を容易に共焦点顕微鏡を用いて観測されているため、20パーセント蛹の開発（P +20％）で、発展途上の目のディスクは、私たちの研究室でのライブイメージングのためのお気に入りとなっている3。 20パーセント蛹を選択するには、マルピーギ管、蛹のケースの下に表示される緑色のスポットを探し、そして"ダークボディ"4を持ってそのサナギを避ける。あなたの解剖皿にHL3でP 20パーセント蛹、浸し、それを選択した後、慎重に慎重に、蛹の袋の前方部分を削除する薄い内膜を貫通しないように。あなたの鉗子と内膜をつかんで引き離す。 慎重に（図1C）非常に顕著な発展途上の脳や目のディスクを見つけるためにリリースの内容全体を検索。アイディスク脳、複雑を簡単に変態のこの段階で分離されている。解剖皿の底に脳を隔離する。視葉から中央の脳を慎重に分離する。視葉/目のディスクは、ライブイメージングで使用されます。 6。イメージングを生きる：顕微鏡であなたが1つか2つしかソリューションの短期間のための画像を希望する場合は、スライドガラス上の画像あなたの組織が壊れる可能性があります。この場合、最初の塗料メーカーの指示を使用してSylgardと表面でスライドを準備。スライドの真ん中に20μLHL3を置きます。スライドにHL3のさらに20μLで切除した組織を輸送。組織は、空気にさらされることはありません必要があります。さらに、ピペットの取り扱いやソリューションの表面張力からの応力やひずみは避けなければならない。 ライブイメージングのために、組織がしっかりと最小限の処理との接触で固定する必要があります。我々は安全に微小電極を介して適用水重合外科グルーGluShield、日常的に電気生理学5の胚の調製に用いられる手法を用いて脳の位置を決めます。電気生理学的記録のために引っ張られるようなガラス電極を取得します。先端を折りますとGluShieldが口の中で生成された負の空気圧を使用することに端を埋める。だけの十分な接着剤が入る可能性があることを電極の折ります。今HL3のドロップでSylgardに接着剤の少量を適用するために正圧を使用してください。今、すぐにライブイメージングのための望ましい方向を維持し、接着剤に組織を設定します。水浸レンズは、現在のイメージングに使用することができます。あなたが膜透過性の染料を追加する場合は、イメージングながらお風呂にそれを追加することができます。 我々は、長時間にわたって撮影は6に減少する光退色と高速撮像を可能にする共振スキャニング共焦点顕微鏡を使用したり、完全に、または複数回ソリューションを交換するために、我々は、蠕動ポンプに接続する灌流チャンバー（ハーバードIC30共焦点イメージングチャンバー）を使用してくださいそれは徐々に生きている組織（図2A）上に培養液をperfuses。一定の液体の交換と最小限のGluShield接点の動きは時間7の長い期間にわたって観察されている組織のフラット化を減らす。発育期間のイメージングのための、目の円盤脳の複雑なが完全なままにして接着剤との最小限の接触を持つべきである必要があることに注意してください。 それは薄くて平らなレンダリングするために剃毛されSylgardのドロップでコーティングされたカバースリップを使用してください。カバーガラスと接着剤Sylgardに生きている組織の中心に20μLHL3を分注する。泡が空気（図2B）に生きている組織を公開することなく、チャンバーを通過できるようになるガスケットを生成します。ガスケットは、組織が共焦点顕微鏡のレンズに近い組織を持って来るために十分な薄を押しつぶされることを回避するのに十分な厚さでなければなりません;我々は我々のセットアップで250μm使用。完全に常時水没組織をしないように注意して、灌流チャンバーを組み立てます。蠕動ポンプを使用して近く100μL分あたりの速度で最初に灌流を開始する。この速度は、チャンバーの高さを定義するガスケットの厚さに応じてかなり高速です。時間のスケールのイメージングでは、20 – ヒドロキシおよび抗生物質が、抗真菌ではないを追加し、毎分10μlを約はるかに低い速度で灌流を行う必要がある場合があります。灌流チャンバーを供給する培地中に最終的に、我々はバブルの酸素。 7。代表的な結果： 私たちのビデオプロトコルの最後に5節で紹介した準備を用いて開発する視細胞のライブイメージングのための例を示します。この調製は、細胞特異的に蛍光レポーターを表現するためにショウジョウバエ遺伝子組み換えを利用しています。膜タグ付きmyrRFPとエンドソームのマーカー2xFYVE – GFP 9に示した例では、2つの蛍光レポーターは、光受容体特異的なGMR – Gal4のドライバ8の制御下で発現されています。 70x70x17.5μmと137x137x700nm（512x512x26）のボクセルサイズのバウンディングボックスを持つ2チャンネルの3Dデータセットごとに1分を得た。映画は、細胞内エンドソーム輸送や小胞融合のイベントのダイナミクスを明らかにこの4Dのデータセットの時間をかけて選択した面を示しています。目や粘膜の固定組織の準備のための代表画像を図に示します。 3。

Discussion

イメージングのために使用する蛍光プローブ

ここでは、3つのクラスからの蛍光プローブの選択のためのショウジョウバエの視覚システムの準備の長所と短所を説明します。外因性に生きている組織の準備に追加される（1）プローブ、遺伝的にライブとの両方でエンコードされている（2）蛍光タンパク質固定イメージング、免疫組織化学のための固定された組織に追加される（3）蛍光色素。

1。外因性のプローブ：

LysotrackerグリーンDND – 26またはDND – 99レッド （インビトロジェン社）これらは、蛍光膜透過性の最も顕著に細胞、リソソームに強く酸性化のコンパートメントに蓄積する化合物、後期エンドソーム、およびオートファゴソーム市販されている。ナノモル濃度でLysotrackerは（我々は典型的には50 nmを使用して）1分以内に完全にL3とP +20％目のディスクを貫通している。 Lysotrackerは、継続的に蓄積し、5分未満でアルカリ化効果が、我々のイメージを発揮するので。目のディスクとは対照的に、Lysotrackerは組織を中断することなく、脳に浸透していません。しかし、外膜の涙慎重には、視葉内の少数の細胞の直径の浸透が可能になります。

Lysotrackerとは対照的にLysosensor DND – 189（インビトロジェン社）、Lysosensorは酸性コンパートメントに蓄積していませんが、展示物は酸性pHでの蛍光の増加。 LysosensorはLysotrackerと非常に似ている浸透特性があります。我々は、1μMの濃度でLysosensorを使用してください。

2。遺伝的に符号化されたプローブ：

多くのライブイメージング実験のために、我々はバイナリGal4/UAS発現システム¹²の制御下にGFP、TagRFP ¹⁰またはpH感受性pHluorin ¹¹など、様々な蛍光分子でタグ付けされた遺伝子を発現する。光受容体の開発に表現するGAL4 -ラインはGMR – Gal4の（すべての光受容体^）8とmDelta0.5 – Gal4の（R4とR7を開発する^）13が含まれ^ています。いくつかの亜型特異的なGAL4 -ドライバの行は、その使用、異なるロドプシンのプロモーター¹⁴が存在する。ライブイメージングで特に有用な蛍光プローブがphotoconvertible蛋白質である。我々は成功Dendra2、単量体、緑色から赤色photoconvertable蛋白質^15を使用している。 Dendra2が488nmのアルゴンレーザーのラインを使用してphotoconvertibleなるように設計されていることに注意してください。しかし、我々は、従来のまたは共振どちら走査型共焦点モードで私たちのセットアップを使用して可視青色光を使用して変換を達成することはできません。対照的に、405nmのUVレーザとの変換が効率的です。

3。免疫組織化学：

固定成人の目には、私たちはしばしばrhabdomeric構造（図1A）を可視化するローダミンファロイジン（インビトロジェン社）または抗Chaoptin（光受容体特異的な抗体^16）のいずれかを選択します。ラミナカートリッジの構造を分析するための良い方法は、抗chaoptin ^16、グリアマーカー抗黒檀^17、および抗SEC6 ^18（図1B）に結合することです。図に示す。 3、抗体のこの組み合わせは、大きなシナプス（chaoptin）とシナプス後部（SEC6）のプロセスだけでなく、薄板¹⁹の上皮グリア（黒檀）を区別する。

灌流チャンバーの組み立て

ライブイメージングのために、我々は、組織の準備を妨げることなく、ソリューションの遅い交換を可能にする灌流チャンバーを採用。灌流チャンバアセンブリのデモは、ビデオに含まれており、模式的に図2に示します。灌流チャンバーの組立は、図5に示す。 2A。第一標本上のガスケットを敷設することから始めます、と示すように、アセンブリに進んでください。ガスケットの目的は、チャンバーの底と蓋、組織がシールされており、これによってソリューションが流れるの内部空間との間のスペースを作成することです。ガスケットの内側のスペースは、入口（解決策がここに入る）、組織の準備、およびソリューションは、チャンバを離れるに経由するコンセントを含める必要があります。ガスケットの2つの機能が重要です：まず、ガスケットはまだ高解像度レンズと撮像を可能にするのに十分に薄い脳のための十分な厚さでなければなりません。理想的なガスケットの厚さは、セットアップ固有のパラメータに依存します。第二に、ガスケットの切り込みが、バブルが試料（図2B）に問い合わせることなく通過できるようにするコンパートメントを提供します。

顕微鏡でのイメージング

我々は、直接スライド上の培養液中に灌流チャンバーまたは63xの水浸レンズ用63x（絞り1.3）グリセリン浸レンズを使用してください。グリセリンレンズは、油のレンズよりも多くの作動距離を提供します。我々は、従来のスキャナ（8000 Hzの対1400 Hzの、それぞれ）よりもはるかに速い速度でスキャン共鳴走査共焦点顕微鏡を使用してください。共鳴スキャンは高速で時間をかけて3次元記録を可能に二のフレームレート。さらに、より高速なスキャン速度が大幅に生きている組織の繰り返しスキャンするための主要な関心事であるレーザー光毒性^6を減少させる。レーザー強度とPMT電圧（ゲイン）のバランスはノイズを最小限にし、退色しながら信号を最大にするために達成されなければならない。重要な今後の検討は、特定の地域でのレーザーの影響の量は解像度とズームによって決定されることである。例えば、選択の領域は512 × 512、ズーム1倍時のような256 × 256、ズーム2倍で同じ解像度でスキャンされ、まだ最大限に可能な限りのライブイメージング速度は、256 × 256でズーム2倍4倍高速です。 8000 Hzと2倍の行の平均のスキャン速度で10秒ごとにZ -スタックの速度でZ -スタックあたり5コマ：迅速に細胞内区画の移動の操作を記録するために、我々が正常に以下の設定で記録されている。時間のスケールで長いイメージングセッションでは、我々は多くの場合数分ごとに1つにフレームレートを削減し、準備がシフトする可能性が高いとして、より大きな領域を選択してください。

ショウジョウバエ視覚系の解剖学

図3は、 ショウジョウバエの成体の眼（図3A）、成人の脳（図3B）、および20〜25％蛹のアイディスク/脳の複雑な（図3C）の解剖学的構造を示しています。図3Aは、とや粘膜と接続されている脂肪細胞なしの両方大人の目を示しています。大人の目の解剖時には、光受容体の細胞体（左）によって形成されたボールに囲まれたアイの中央にある板は、、（右）の下に細胞体を中断せずに削除する必要があります。成人の脳の解剖のために、人は光受容体の細胞体、板、視葉、中央の脳、および気管（図3B）を区別することができるはずです。視葉に添付されたラミナを残しながら、光受容体と気管は、この解剖のために削除する必要があります。 20から25パーセント蛹のアイディスク/脳、複雑なの同定に役立つように、ライブイメージは、図3Cに示されている。

図1（A）成体の脳。 （B）大人の目。 （C）20％-25％蛹eye-disc/brain複合体。

図2（A）潅流チャンバーの組立と試験片の相対的な（B）ガスケットの位置決め。

図3（）抗chaoptin使用して大人感桿分体染色。抗chaoptin（緑、光受容体）、抗黒檀（赤、グリア）、およびSEC6（青、介在ニューロン）を使用して、（B）アダルトラミナ染色。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Sylgard 184		Dow Corning	103251252
GluShield		GluStitch, Inc.	GB055QO
20-Hydroxyecdysone		Sigma	H5142-10mg	5mg/ml in EtOH

Special Equipment:

1. Dissection Scope: Leica Mz12.5 with digital camera
2. Leica TCS SP5 Confocal Tandem-Scanner Microscope for conventional and resonant scanning live
   imaging microscopy, including blue (488nm), green (561nm), orange (594nm) and far-red (633nm) lasers as well as special 63x, 1.4 glycerine and a 63x, 1.3 water immersion lenses.
3. Harvard Instruments Confocal Imaging Chamber RC-30 and peristaltic pump model 720
4. Sutter Pipette puller P-97
5. Software: Amira 5.2, Visage Imaging