Summary
Ce protocole décrit trois
Abstract
L'
Protocol
1. Présentation
Dans cette vidéo, nous allons montrer comment préparer les cerveaux drosophile et la rétine pour l'imagerie en direct et l'immunohistochimie avec un accent sur les cellules photoréceptrices. Tout d'abord, nous allons montrer comment se préparer pour les dissections du cerveau. Ensuite, nous allons démontrer deux dissections de base couramment utilisé pour l'immunohistochimie qui forment la base pour les préparations en direct. Ces deux préparations sont le cerveau adulte et des dissections oeil. Ensuite, nous allons démontrer les dissections utilisés pour l'imagerie en direct du cerveau adulte et le développement en mettant l'accent sur leur utilisation pour l'imagerie en direct de photorécepteurs. Enfin, nous allons décrire l'image du tissu façon dont nous vivons et de montrer quelques exemples de l'imagerie de résonance en direct en utilisant la microscopie confocale.
2. La préparation de dissection
- Pour les dissections de bonnes, vous avez besoin d'une pince forte. En utilisant un bloc à aiguiser ou du papier de verre très fin (> 1500), doucement passer la pince avant et en arrière de chaque côté jusqu'à ce que les deux bouts à une fine pointe. Nous utilisons une pierre à aiguiser la norme. Nous ne couvrons pas la technique d'affûtage, mais sachez que le forceps forte sont indispensables pour les dissections vivre. Nous affûter pince avant chaque dissection.
- Pour les dissections cerveau adulte, placer les mouches sur un pad CO 2 pour les anesthésier et trier le génotype désiré. Pour les dissections nymphe, il suffit de rejoindre dans le flacon et retirez soigneusement une nymphe avec votre pince, en prenant soin d'éviter de casser le cas chrysalide.
- Imbibez un Kimwipe avec de l'eau. Vous utiliserez ce lors de la dissection d'enlever les débris de votre pince. Position d'un plat de dissection sur la scène d'un stéréoscope et remplissez-le avec HL3 solution 1. Tous les dissections seront menées dans HL3 pour s'assurer que le tissu reste vivante et en bonne santé lors de la procédure de dissection. Aussi, nous utilisons un plat dissection qui a une couverture inférieure de Sylgard pour protéger pince lors de la dissection.
- Maintenant, préparez la fixation solution si vous prévoyez d'effectuer immunohistochimie. 180μL Lieu de HL3 dans un microtube 500μL. Ajouter 20 pi de formaldéhyde à 37% pour obtenir une solution de formaldéhyde de 3,7%.
- Enfin, la position des mains est important pour les dissections bon. Avec la position bonne main, votre pince sera stable et capable de contrôler les mouvements subtils. D'abord, placez la pince sur le côté de votre pouce. Puis mettre l'index droit vers le bas de sorte que le bout du doigt repose sur le dessus. Maintenant reste le côté de la pince sur le côté de votre doigt du milieu et de passer à l'antenne de dissection. Prenez contact physique avec le plat de votre pouce et le majeur. Tout en se reposant de votre pouce et le majeur sur le plat, plantez votre poignet sur la platine du microscope. De cette façon, vous avez trois points fermement plantés sur des surfaces lors de la dissection et il est maintenant possible de faire des manipulations très subtiles de la pince. Cette technique peut sembler un peu bizarre au début, mais avec la pratique, vous allez bientôt être un maître de dissections cerveau.
3. Cerveau adulte
- Sur le CO 2 pad, orienter un adulte volée face ventrale avec la tête loin de votre main. Prenez le thorax juste en dessous de la tête. Si c'est fait correctement, les jambes et le proboscis se prolonger. Pendant l'affichage dans un stéréoscope, prenez la trompe étendue avec votre pince pour enlever la tête. Jeter le corps et plonger la tête. Recentrer sur la tête immergée. La dissection sera entièrement réalisée sous solution. Il est très important de tenir sur la tête avec une pince à tout moment. Sinon, la tête va flotter et sont difficiles à récupérer. Si la tête se déplace pas au point lors de la dissection, il suffit de revenir s'installer dans le plan focal sans ajuster le microscope. Cette tâche apparemment simple peut être difficile au début, mais en gardant la tête dans accent sera devenu plus facile au fil du temps.
- Commencez d'abord par la dissection de déchirer le tissu conjonctif entre les trompe et les yeux. Larme à travers l'oeil tout en tenant fermement avec au moins une pince à tout moment. Soyez certain que la pointe de la pince est tout juste sous la rétine ou cuticule, pour éviter d'endommager le dessous du cerveau. Alternativement à gauche et à droite, utilisez votre pince pour arracher la rétine, en travaillant vers l'arrière de la tête. Arrachement de la rétine va augmenter les chances que la lame reste attaché à la lobe optique au long de cette dissection. Continuer à l'arrière de la tête, déchirant la cuticule le long du chemin. Larme à travers les yeux d'autres et de commencer écartant cuticule. Tant que vous êtes saisissant cuticule, vous savez que vous n'êtes pas écraser le cerveau! Dans cet esprit, continuer à tirer la cuticule et de la rétine suite jusqu'à ce que le cerveau est révélé.
- Une fois que le cerveau est visible, vous pouvez commencer à retirer la trachée rattachés au cerveau (figure 1A). Continuez à tirer sur la trachée et les cuticules jusqu'à ce que le cerveau est isolé. À ce stade, vous devriez recentrer vers le bas de votre plat pour tIl étapes restantes. Retirez la trachée reste parce que votre cerveau peut autrement flottent au cours lave d'anticorps pendant la nuit. Pour l'imagerie des terminaux de photorécepteur, il est souhaitable de conserver la lame, mais vous devez retirer la rétine, qui contient les corps cellulaires et des pigments vivement autofluorescente. Pour ce faire, tirez délicatement au reste touffue et pigmentées cellulaires sans endommager la lame. C'est une compétence plus fine et de la pratique.
- Le cerveau adulte peut être maintenu en vie pendant des heures voire des jours à l'aide des conditions que nous allons discuter dans la section 6. Pour l'immunohistochimie, le cerveau adulte est maintenant prêt à être fixé dans du formol. 2 Utilisez un pipetteman P20 mis à 5uL pour déplacer le cerveau adulte à la solution de fixation vous avez déjà préparé. Continuer à disséquer les cerveaux adulte pour 20 minutes, ce qui devrait donner 4-10 cerveau. Laisser les cerveaux de correctif pour un 40 minutes supplémentaires, mais cette durée peut varier pour la coloration des anticorps primaire optimale. Retirer la solution de formaldéhyde et laver les cerveaux 3 fois pendant 5 minutes chacun dans 400μL d'une solution contenant du PBS et 0,4% TritonX-100, ci-après dénommé PBS-Triton. Après avoir complètement lavage de la solution de correction, vous pouvez ajouter la solution d'anticorps primaire.
4. Oeil pour adultes
- Commencez cette dissection comme décrit pour le cerveau adulte. Après submergeant la tête et le recentrage du microscope, commencer par déchirer le tissu conjonctif entre les trompe et les yeux. Au-dessus de la trompe, séparée la cuticule de l'œil. Maintenant, séparer la cuticule de la face inférieure de l'œil, en travaillant vers l'arrière de la tête. Avec une pince, saisir le centre de l'arrière de la tête. Avec l'autre, attraper l'oeil et tirez. Autoriser l'œil à se déposer au fond du plat (Fig. 1B). Le limbe seront probablement encore attachée à l'œil et peut être utilisé pour l'imagerie en direct de bornes de cellules photoréceptrices complètement intact en ce moment. Pour continuer avec l'imagerie en direct de corps cellulaires des photorécepteurs, allez à la section 4.5. Les trois sections suivantes expliquent immunohistochimie oeil fixe.
- Pour l'immunohistochimie, de déplacer l'œil à la fixation solution en utilisant un pipetteman P20 mis à 5uL. Poursuivre la dissection des yeux d'adulte pour un total de 10 minutes. Laissez les yeux dans les fixer pour 30 minutes supplémentaires. Retirer la solution fixer et réaliser lave comme décrit dans la dissection du cerveau adulte.
- Si vous souhaitez finalement l'image de la structure de l'oeil ommatidial la lame doit être retiré maintenant. Retourner le regard fixé à votre plat disséquer et enlever toutes les cellules trachée ou la graisse qui peuvent encore être fixé. Ensuite, tout en maintenant l'extérieur de l'œil avec une pince, retirer la lame avec l'autre. Il faut se détacher en un seul morceau, ce qui expose l'cellbodies dessous (Fig. 1B). Soyez prudent de saisir la lame seulement! Sinon, vous risquez de détacher les photorécepteurs de la rétine.
- L'utilisation d'un pipetteman P20, bouger les yeux à 400uL PBS-Triton dans un tube 500uL. Doucement les roches à 4 degrés durant la nuit pour enlever le pigment rouge de la autofluorescente photorécepteurs. Le jour suivant, vous pouvez jeter la solution de lavage et ajouter une solution d'anticorps primaire.
- Pour l'imagerie en direct de yeux d'adulte, nous n'utilisons que les mouches adultes pharate, c'est à dire les nymphes stade tardif, peu avant l'éclosion. A ce stade, les corps cellulaires des photorécepteurs séparés à partir de terminaux dans la lamina lors de la dissection.
- Adulte Pharate nymphes ont des ailes bien définies, les yeux, et la cuticule visibles à travers la coque de nymphose. Sélectionnez une nymphe et retirez la partie antérieure de la coque de nymphose pour exposer la région de la tête. Retirer délicatement la membrane interne mince qui renferme en outre à la volée en développement. Prenez la base de la tête avec votre pince et tirez. Jeter le reste de la nymphe tout en gardant la tête immergée.
- Procédez comme démontré dans la dissection des yeux pour l'immunohistochimie. Au stade adulte pharate, cependant, les corps cellulaires des photorécepteurs se détache plus facilement de la lame, vous permettant de l'image du corps cellulaire niché dans la rétine. En outre, la lame reste attaché au lobe optique, vous permettant de l'image de la lamina distale. Si vous souhaitez l'image de la lamina proximale, où les cartouches terminale photorécepteur peut être vu, puis effectuer la dissection oeil sur une mouche adulte, où la lame est plus fortement attaché à l'œil.
5. Développer l'œil-cerveau disque complexes
- Le disque oeil en développement au développement des pupes de 20% (P 20%) est devenu un favori pour l'imagerie vivre dans notre laboratoire, en raison de cette seule couche de cellules en développement relativement important est facilement observable par microscopie confocale 3.
- Pour sélectionner une nymphe de 20%, cherchez l'tubes de Malpighi, un point vert apparaît sous la nymphe le cas, et d'éviter les nymphes qui ont un «corps noir» 4. Après avoir sélectionné un submerger P 20% nymphe, il en HL3 dans votre plat de disséquer et enlever soigneusement une partie antérieure du sac pupe, en faisant attentionde ne pas pénétrer la membrane interne mince. Saisissez la membrane interne avec votre pince et tirez.
- Soigneusement rechercher dans le contenu publié à trouver le cerveau en développement et les disques yeux qui sont assez importants (Fig. 1C). L'œil de disque cérébrale complexe est facilement séparé à ce stade de la métamorphose. Isoler le cerveau au fond du plat à dissection. Soigneusement séparés le cerveau central du lobe optique. L'optique du lobe / œil disque sera utilisé en imagerie en temps réel.
6. En direct d'imagerie: A la loupe
- Si vous souhaitez l'image pour une courte période de temps dans seulement un ou deux solutions, vous pouvez l'image de votre tissu sur une lame de verre. Dans ce cas, préparer la diapositive en première couche de la surface avec l'aide de Sylgard les instructions du fabricant. Placer 20 pi HL3 dans le milieu de la diapositive. Transport de vos tissus disséqués dans 20 ul supplémentaires de HL3 à la diapositive. Le tissu doit jamais être exposé à l'air. En outre, tout le stress ou la souche de la manipulation pipette ou tension superficielle solution doit être évitée.
- Pour l'imagerie en direct, le tissu doit être solidement fixé avec un minimum de manipulation et de contact. Nous solidement la position du cerveau en utilisant l'eau GluShield polymérisation de la colle chirurgicale appliquée à travers une microélectrode, une technique couramment utilisée pour les préparations embryonnaires pour électrophysiologie 5. Procurez-vous un verre de l'électrode comme ceux tirés des enregistrements électrophysiologiques. Brisez la pointe et de remplir la fin avec GluShield utilisant une pression négative générée par la bouche. Casser juste assez de l'électrode qui colle peut entrer. Vous pouvez maintenant utiliser une pression positive d'appliquer une petite quantité de colle sur la Sylgard dans une goutte de HL3. Maintenant, rapidement mis le tissu sur la colle, le maintien de l'orientation désirée pour l'imagerie en direct. Une lentille d'eau d'immersion peuvent désormais être utilisés pour l'imagerie. Si vous voulez ajouter un colorant membrane perméable, vous pouvez l'ajouter au bain tout en imagerie.
- Nous utilisons un microscope à balayage confocal résonance qui permet d'imagerie rapide avec 6 réduits photoblanchiment. Pour l'imagerie sur de longues périodes de temps ou d'échanger des solutions complètement ou plusieurs fois, nous utilisons une chambre de perfusion (Harvard IC30 imagerie confocale de chambre) qui se connecte à une pompe péristaltique qu'il perfuse lentement solution de culture sur les tissus vivants (figure 2A). Mouvement de change constant et de liquide de contact GluShield minimale de réduire l'aplatissement du tissu qui a été observé sur de plus longues périodes de temps 7. Notez que pour l'imagerie des périodes de temps de développement, l'œil-cerveau disque complexe doit rester intact et devrait avoir un contact minimal avec la colle.
- Utiliser une lamelle recouverte d'une goutte de Sylgard qui est rasé pour le rendre mince et plat. Distribuer 20 pi HL3 sur le centre de la lamelle et coller les tissus vivants à l'Sylgard. Générer un joint qui va permettre aux bulles de passer à travers la chambre sans exposer les tissus vivants à l'air (figure 2B). Le joint doit être assez épaisse pour éviter d'écraser le tissu, mais assez mince pour porter le tissu proche de l'objectif du microscope confocal, nous utilisons 250μm dans notre configuration. Assemblez la chambre de perfusion, en faisant attention de garder le tissu complètement submergé en tout temps. Commencez la perfusion initialement à un taux proche de 100 ul par minute en utilisant une pompe péristaltique. Cette vitesse est assez rapide en fonction de l'épaisseur du joint qui définit la hauteur de la chambre. Pour l'imagerie à l'échelle des heures, vous pouvez avoir besoin d'ajouter 20 hydroxyecdysone et antibiotiques, mais pas antifongiques, et effectuer la perfusion à une vitesse beaucoup plus faible autour de 10 ul par minute. Enfin, l'oxygène que nous bulles dans le milieu de culture qui alimente la chambre de perfusion.
7. Les résultats représentatifs:
A la fin de notre protocole de vidéo, nous montrent un exemple pour l'imagerie vivent dans des cellules photoréceptrices de développement en utilisant la préparation présenté dans la section 5. Cette préparation prend avantage de la drosophile transgénèse à la cellule-expriment spécifiquement aux journalistes fluorescentes. Dans l'exemple illustré, deux journalistes fluorescentes sont exprimés sous le contrôle du photorécepteur spécifique GMR-Gal4 pilote 8: la membrane-taggés myrRFP et le marqueur endosomal 2xFYVE-GFP 9. Deux canaux ensembles de données 3D avec une boîte englobante de 70x70x17.5μm et une taille de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) ont été obtenues toutes les 1 min. Le film montre un plan sélectionné au fil du temps dans ce jeu de données 4D qui révèle la dynamique du trafic intracellulaire des endosomes et des événements de fusion des vésicules. Images représentant des préparations de tissu fixe de l'œil et de la lame sont présentés sur la Fig. 3.
Discussion
Sondes fluorescentes utilisés pour l'imagerie
Nous décrivons ici les forces et les limites de la préparation drosophile système visuel pour une sélection de sondes fluorescentes de trois classes: (1) Les sondes qui sont ajoutés à une préparation des tissus vivants de manière exogène, (2) les protéines fluorescentes qui sont génétiquement codés pour les deux vivent et imagerie fixe; (3) des colorants fluorescents qui sont ajoutés aux tissus fixés pour l'immunohistochimie.
1. Sondes exogènes:
Lysotracker vert MDN-26 ou Red MDN-99 (Invitrogen, Inc) Ce sont disponibles dans le commerce fluorescentes membrane perméable à des composés qui s'accumulent dans les compartiments fortement acidifié dans la cellule, le plus en évidence les lysosomes, endosomes tardifs, et autophagosomes. Lysotracker à des concentrations nanomolaires (nous utilisons généralement 50 nm) pénètre le disque L3 et P oeil 20% totalement en moins d'une minute. Depuis Lysotracker s'accumule en permanence et exerce un effet alcalinisant, nous avons l'image en moins de 5 minutes. Contrairement aux disques oeil, Lysotracker ne pénètrent dans le cerveau sans perturbation du tissu. Cependant, attention déchirure de la membrane externe permet la pénétration d'un diamètre de quelques cellules dans le lobe optique.
Lysosensor MDN-189 (Invitrogen, Inc) Contrairement à Lysotracker, Lysosensor ne s'accumule pas dans les compartiments acidifié, mais présente augmentation de fluorescence à pH acide. Lysosensor a des caractéristiques de pénétration qui sont très semblables à Lysotracker. Nous utilisons Lysosensor à une concentration de 1 uM.
2. Sondes génétiquement codés:
Pour de nombreuses expériences d'imagerie vivons, nous expriment les gènes marqués avec différentes molécules fluorescentes comme la GFP, TagRFP 10 ou le pHluorin sensibles au pH 11 sous le contrôle du système Gal4/UAS expression binaire 12. Gal4-lignes qui expriment dans les photorécepteurs de développement comprennent GMR-Gal4 (tous les photorécepteurs) 8 et mDelta0.5-Gal4 (développement R4 et R7) 13. Plusieurs sous-types spécifiques Gal4-pilote lignes existent qui utilisent différents promoteurs Rhodopsin 14. Particulièrement utile sondes fluorescentes dans l'imagerie en direct sont des protéines photoconvertible. Nous avons utilisé avec succès Dendra2, un monomère verte à rouge protéines photoconvertable 15. Notez que Dendra2 est conçu pour être photoconvertible utilisant un laser Argon 488nm ligne. Cependant, nous sommes incapables de réaliser la conversion en utilisant une lumière bleue visible à l'aide de notre set-up en mode de numérisation conventionnelles ou de résonance confocale. En revanche, la conversion avec le laser UV 405nm est efficace.
3. Immunohistochimie:
Pour l'œil adulte fixe, nous avons souvent le choix entre la rhodamine phalloïdine (Invitrogen, Inc) ou anti-Chaoptin (un anticorps spécifique des photorécepteurs 16) pour visualiser la structure rhabdomeric (figure 1A). Une bonne façon d'analyser la structure cartouche limbe est de combiner anti-chaoptin 16, le marqueur glial anti-ébène 17, et anti-sec6 18 (Fig 1B). Comme le montre la Fig. 3, cette combinaison d'anticorps qui distingue les grands présynaptique (chaoptin) et post-synaptiques (sec6) des processus ainsi que la GLIA épithéliales (ébène) dans la lamina 19.
Assemblage de la chambre de perfusion
Pour l'imagerie en direct, nous employons une chambre de perfusion qui permet l'échange lente de solutions sans déranger la préparation des tissus. Une démonstration de l'assemblage chambre de perfusion est inclus dans la vidéo et schématisé à la figure 2. Assemblée de la chambre de perfusion est illustré dans la Fig. 2A. Commencez par la pose du joint sur le premier échantillon, et ensuite poursuivre l'assemblage, comme indiqué. Le but de la garniture est de créer un espace entre la base de la chambre et le couvercle, un espace à l'intérieur duquel le tissu est scellé et à travers lequel la solution de flux. L'espace à l'intérieur du joint doit inclure l'entrée (solution pénètre ici), la préparation des tissus, et la sortie à travers laquelle la solution quitte la chambre. Deux caractéristiques de la garniture sont essentiels: d'abord, le joint doit être suffisamment épaisse pour que le cerveau encore assez mince pour permettre l'imagerie avec une lentille à haute résolution. L'épaisseur du joint idéal dépend de configuration des paramètres spécifiques. Deuxièmement, une encoche dans le joint fournit un compartiment qui permet une bulle de passer à travers sans contact avec l'échantillon (figure 2B).
Imagerie au microscope
Nous utilisons un 63x (ouverture 1,3) lentille à immersion de glycérine pour la chambre de perfusion ou d'une lentille d'eau par immersion 63x directement dans le milieu de culture sur une diapositive. Glycérine lentilles fournir plus de travail à distance que les lentilles de pétrole. Nous utilisons un microscope à balayage confocal à résonance qui scanne à des taux beaucoup plus rapide qu'un scanner conventionnel (8000 Hz 1400 Hz par rapport, respectivement). Resonant permet la numérisation en 3 dimensions des enregistrements au fil du temps au fastdes taux de trame ER. En outre, les vitesses de numérisation plus rapide de réduire considérablement la phototoxicité laser 6 qui est une préoccupation majeure pour les scans répétés de tissus vivants. Un équilibre entre l'intensité du laser et la tension PMT (gain) doit être réalisé afin de maximiser le signal, tout en minimisant le bruit et photoblanchiment. Une considération importante est que la quantité d'impact laser sur une région donnée est déterminée par la résolution et le zoom. Par exemple, une région de choix est scanné à la même résolution à 256x256, un zoom 2x au 512x512, un zoom 1x, mais la vitesse maximale possible d'imagerie en direct est 4 fois plus rapide à 256x256, un zoom 2x. Pour enregistrer l'activité de déplacer rapidement des compartiments intracellulaires, nous avons réussi a enregistré avec les paramètres suivants: 5 images par Z-stack au rythme d'un Z-stack par 10 secondes avec une vitesse de balayage de 8000 Hz et moyenne gamme 2x. Pour les sessions d'imagerie longue à l'échelle de l'heure, nous avons souvent de réduire le taux de trame à un pour plusieurs minutes et choisissez grands domaines comme la préparation est plus susceptible de changement.
Anatomie drosophile Visual System
La figure 3 montre l'anatomie de l'œil adulte drosophile (figure 3A), le cerveau adulte (figure 3B), et les 20% -25% des yeux nymphe disque / complexe du cerveau (figure 3C). La figure 3A illustre l'œil adulte à la fois avec et sans la lame et les cellules graisseuses en annexe. Lors de la dissection des yeux des adultes, le limbe, qui est au centre de l'oeil niché dans une cuvette formée par les corps cellulaires des photorécepteurs (à gauche), doit être retiré sans perturber les corps cellulaires en dessous (à droite). Pour la dissection du cerveau adulte, on doit être capable de distinguer les corps cellulaires des photorécepteurs, la lame, le lobe optique, le cerveau central, et de la trachée (figure 3B). Les photorécepteurs et de la trachée ont besoin d'être retiré pour cette dissection, tout en laissant la lame attachée au lobe optique. Pour aider à l'identification de l'œil à 20-25% du disque / cerveau nymphe complexe, une image en direct est présenté dans la figure 3C.
Figure 1. Cerveau adulte (A). Œil adulte (B). (C) 20% -25% nymphe eye-disc/brain complexes.
Figure 2. (A) Assemblée chambre de perfusion et (B) joint positionnement par rapport à l'échantillon.
La figure 3 (A). Coloration adultes rhabdomere utilisant des anticorps anti-chaoptin. (B) coloration lamina adultes utilisant des anticorps anti-chaoptin (vert, les photorécepteurs), anti-ébène (rouge, cellules gliales), et sec6 (bleu, interneurones).
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Welch (I-1657) et le NIH (RO1EY18884). PRH est un chercheur Eugene McDermott dans la recherche biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | |
| GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | |
| 20-Hydroxyecdysone | Sigma-Aldrich | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment:
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References
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