Summary
本协议描述了三个
Abstract
“
Protocol
1。简介
在这段视频中，我们将演示如何准备实时成像与感光细胞的焦点免疫组织化学 ，果蝇的大脑和视网膜。首先，我们将展示如何准备的大脑解剖。下一步，我们将演示进行免疫组化常用的两种基本解剖，现场准备的基础上。这两种制剂是成人的大脑和眼睛解剖。下一步，我们将展示用于实时成像强调实时成像感光器以及它们的使用成人和发育中的大脑的解剖。最后，我们将描述怎样的形象活组织，并采用谐振共聚焦显微镜实时成像显示一些例子。
2。夹层准备
- 为了获得良好的解剖，你需要锋利的镊子。使用锐化块或非常细的砂纸（1500），每边轻轻地传递镊子来回，直到入不敷出在细点。我们使用一个标准的磨刀石。我们将不包括这里的锐化技术，但需要注意的是尖锐的钳现场解剖的基本。我们增强在每次解剖钳。
- 对于成人的大脑解剖，苍蝇，以CO 2垫麻醉他们，并整理出所需的基因型。蛹的解剖，只需达到进入瓶中，并与您的镊子小心取出蛹，要小心，以避免破坏蛹的情况下。
- 与水浸湿Kimwipe。您将使用在解剖，以消除碎片从您的镊子。一个立体舞台上位置的解剖盘和填充HL3解决方案 1 。在HL3将进行全部清扫，以确保该组织仍然活着，健康在解剖过程。此外，我们使用一个夹层的菜，有一个Sylgard底部覆盖，以保护在解剖钳。
- 现在，准备修复解决方案，如果您计划执行免疫组织化学。广场180μLHL3成500μL的离心管。添加37％的甲醛20μL获得3.7％的甲醛溶液。
- 最后，适当的手的位置是很重要的，良好的解剖。良好的手的位置，您的镊子将稳定和能够控制的，细微的动作。首先，将你的拇指侧的镊子。直降等，手指的尖端在于在上面，然后把食指。现在停留在中指一侧一侧的镊子，解剖盘和移动。你的拇指和中指，使菜的身体接触。休息时你的拇指和中指上的菜，厂房显微镜舞台上你的手腕。通过这种方式，你有三点种植坚决表面上在解剖和现在有可能使镊子非常微妙的操纵。这种技术可能会觉得有点尴尬，但通过练习，你很快就会掌握的大脑解剖。
3。成人的大脑
- 在CO 2垫，东方成人飞腹侧与远离你的手头部。抢头正下方的胸部。如果做得好，腿和喙将延长。一个立体下观察时，与您钳抢延长长鼻删除头部。丢弃的身体和淹没头部。重新聚焦到淹没头。整个剥离，将执行下的解决方案。到头部与钳在任何时候，这是非常重要。否则，头部将float和难以检索。如果头移动在夹层中的重点，只需移动到焦平面不调整显微镜。这看似简单的任务，可能很难在第一，但保持你的头在焦点将随着时间的推移变得更容易。
- 第一撕裂的长鼻和眼睛之间的结缔组织开始清扫。同时，在任何时候都至少有一个钳坚决眼睛撕裂。一定镊子脚趾下方的视网膜或角质层，以避免损坏大脑的下方。左，右交替，使用您的镊子撕离视网膜，朝后脑勺工作。撕毁了视网膜会增加成功的机会，椎板剥离附着在整个视叶。继续围绕的后脑勺，流泪，一路上的角质层。撕裂通过另一只眼睛，开始拉远角质层。只要你抓住的角质层，你知道，你是不是破碎的大脑！考虑到这一点，继续拉角质层和视网膜，直到大脑透露。
- 一旦大脑是可见的，你就可以开始删除气管连接到大脑（图1A）。继续拉在气管和角质层，直到大脑是孤立的。此时，你应该重新调整你的菜吨的底部他其余的步骤。除去剩余的气管因为你的大脑在一夜之间抗体清洗，否则可能会浮动。成像感光终端，它是可取的保留椎板，但您需要删除的视网膜，其中包含的胞体和强烈autofluorescent颜料。要做到这一点，小心地将在浓密的色素细胞仍然不破坏椎板。这是一个更精细的技能和需要练习。
- 成人的大脑，可以保持几个小时甚至数天或使用条件下，我们将讨论在第6活着。进行免疫组化，成人的大脑现在已经准备好要固定甲醛（2）使用P20的pipetteman设置到5μL移动成人的大脑你已经准备到固定的解决方案。继续20分钟，成人的大脑解剖，产量4-10大脑。保留一个额外的40分钟的大脑修复，但此期间可能会有所不同最优的主要抗体染色。去除甲醛溶液和洗脑筋400μL含有PBS和0.4％TritonX - 100，以下简称为PBS，海卫一的解决方案，每5分钟的3倍。在彻底清洗修复方案后，你可以增加抗体的解决方案。
4。成人眼
- 为成人大脑中所述，开始剥离。淹没头和重新定位，在显微镜后，撕裂长鼻和眼睛之间的结缔组织开始。上面的长鼻，从眼睛分开的角质层。现在，单独从眼睛下方的角质层，走向的后脑勺。一个镊子，抓住中心的后脑勺。另一方面，抓住眼球拉。让眼睛定居的菜的底部（图1B）。椎板仍然可能会被贴在眼睛上，可在这个时候使用完全保存完好的感光细胞的终端的实时成像。要继续与实时成像感光细胞组织，去到4.5节。接下来的三节解释固定眼免疫组化。
- 免疫组化，移动到固定的解决方案使用的是P20的pipetteman设置到5μL的眼睛。继续解剖共10分钟的成人眼睛。保留在一个额外的30分钟的修复的眼睛。删除的修复方案和进行清洗，如在成人大脑解剖中所述。
- 如果希望最终图像的眼睛ommatidial结构的椎板现在必须拆除。返回固定的眼睛，您的解剖盘，并消除任何可能仍附在气管或脂肪细胞。下一步，而眼外的一个钳，删除与其他层。它应该在一块脱落，露出cellbodies下方（图1B）。小心只抢椎板！否则，你的风险分离从视网膜的光感受器。
- 使用P20的pipetteman，移动眼睛400uL PBS，海卫一在500uL管。轻轻摇动在4℃过夜，以除去autofluorescent从红色颜料的光感受器。翌日，你可以丢弃的洗涤液，并增加抗体的解决方案。
- 实时成像成人的眼睛，我们只使用pharate成蝇，即前不久后期蛹羽化。在这个阶段，机构在剥离椎板终端分开的感光细胞。
- Pharate成人蛹有良好定义的翅膀，眼睛，和角质层通过蛹的情况下可见。选择一个蛹和删除前蛹的情况下部分露出头部区域。小心取出，此外包围发展中国家飞薄的内膜。抓斗钳和拉头的基地。丢弃蛹的休息，同时保持头部淹没。
- 按照免疫组织化学眼清扫证明。 pharate成年阶段，然而，感光细胞机构将分离更容易从椎板，让您的形象依偎在视网膜上的细胞机构。此外，椎板仍然视叶，让您远端椎板形象。如果你想形象近端椎板可以看出，其中的感光终端墨盒，然后执行椎板贴在眼睛上更强烈的成人蝇眼清扫。
5。眼睛光盘脑复合物
- 在20％以上的蛹发展（20％）的眼睛光盘实时成像在我们的实验室已成为最喜爱的，因为这比较大的发展细胞单层容易观察使用共聚焦显微镜。
- 要选择一个20％的蛹，为马氏管，一个绿点出现蛹的情况下之下，并避免蛹，有一个“黑暗的身体”4 。选择一个P 20％的蛹，淹没它在您的解剖盘在HL3后，小心取出蛹麻袋的前部，小心不穿透薄薄的内膜。抓住内膜与您的镊子，并拉开。
- 通过发布的内容仔细搜索，发现发育中的大脑和眼睛的光盘还相当突出（图1C）。眼睛光盘脑复杂变态在这个阶段是很容易分离。隔离的大脑解剖盘底部。仔细分离视神经叶的中央大脑。视神经叶/眼磁盘将用于实时成像。
6。实时成像：在显微镜
- 如果您希望只有一个或两个解决方案的时间在短期内的图像，你可以在玻片上的形象您的组织。在这种情况下，第一涂层表面，使用制造商的指示与Sylgard准备的幻灯片。放置在幻灯片中20μLHL3。您的解剖组织运输HL3额外20μL到幻灯片。组织绝不能暴露在空气中。此外，任何压力或应变移液器处理或溶液的表面张力必须避免。
- 实时成像，组织必须以最小的处理和联系坐稳。我们安全的位置大脑使用水聚合手术胶GluShield通过一个电极中的应用，这种技术经常用于胚胎电5准备。获得像拉电生理记录的玻璃电极。断绝提示GluShield使用口产生负压，并填写结束。仅折断足够的电极，胶可能进入。现在，使用正压申请下降了HL3少量的胶水的Sylgard。现在，迅速成立组织上胶，保持实时成像所需的方向。现在可以使用一个浸水镜头成像。如果你想添加一个膜渗透性染料，你可以将它添加到洗澡，而成像。
- 我们使用一个共振扫描共聚焦显微镜，可减少漂白6以上的时间或交换解决方案的长期完全或多次成像，我们用它连接到一个蠕动泵灌注室（哈佛IC30共焦成像室）快速成像慢慢perfuses活组织培养液（图2A）。恒定的液体交换和最小GluShield接触的运动，减少扁平化的组织已观察了较长时期的时间7。请注意，发育时间段的成像，眼脑光盘复杂，需要保持不变，并应尽量避免接触胶水。
- 使用下降了Sylgard是剃光呈现薄和平面涂盖玻片。免除到盖玻片和胶水活组织的Sylgard中心20μLHL3。生成垫片，使气泡室通过不活组织暴露在空气中（图2B）。垫片应足够厚，以避免破碎的组织，但薄足以使组织共聚焦显微镜镜头，我们在我们的设置使用250微米。组装灌注室，注意保持完全淹没在任何时候都组织。最初开始灌注率接近每分钟使用蠕动泵100μL。这个速度是相当快垫片的厚度取决于定义室高度。成像上的小时刻度，您可能需要添加20 - 羟基和抗生素，但不抗真菌，并执行在低得多的速度大约每分钟加入10μl灌注。最后，我们到培养液中，供应灌注腔泡沫的氧气。
7。代表性的成果：
在我们的视频协议结束时，我们使用在第5节的准备，在发展中国家感光细胞实时成像的例子。这种准备利用果蝇的转基因细胞特异性表达荧光记者。在所示的例子中，两个荧光记者表示下控制特定的感光- GMR - Gal4的驱动程序8：膜标签myrRFP和内体标记2xFYVE - GFP 9。双通道3D的70x70x17.5μm的边界框和一个137x137x700nm（512x512x26）的体素大小的数据集，每1分钟。影片中展示了在这个4D数据集，揭示了胞内体的贩运和囊泡融合事件的动态，随着时间的推移选定的平面。代表固定的组织准备工作的眼睛和椎板的图像如图所示。 3。
Discussion
用于成像的荧光探针
在这里，我们描述了果蝇视觉系统准备从三个类荧光探针的选择的长处和局限性：（1）探针被添加到一个活组织编制外生的;（2）现场和基因编码的荧光蛋白固定成像;（3）添加到固定的免疫组织化学组织的荧光染料。
1。外感探头：
Lysotracker绿色免打扰- 26或红DND - 99（Invitrogen公司，公司），这些均为市售透水膜的荧光化合物积累在细胞中，最突出的溶酶体强烈酸化车厢，后期内涵体和自噬。在纳摩尔浓度（我们通常使用50纳米）Lysotracker完全渗透在不到一分钟的L3和P +20％眼光盘。由于Lysotracker不断积累，对碱性的影响，我们的形象，在不到5分钟。相反的眼睛光盘，Lysotracker不渗透不破坏组织大脑。然而，细心的外膜撕裂允许几个细胞直径在视神经叶的渗透。
Lysosensor DND - 189对比Lysotracker（Invitrogen公司，公司），Lysosensor不会积聚在酸化车厢，但在酸性的展品增加荧光。 Lysosensor已渗透的特点是非常相似Lysotracker的。我们使用浓度为1μmLysosensor。
2。基因编码的探头：
对于许多实时成像实验中，我们表达GFP，TagRFP 10或pH敏感pHluorin 11的二进制Gal4/UAS表达系统 12控制下的各种荧光分子标记的基因。 GAL4 -线，在发展中的光感受器表达包括GMR - Gal4的（感光器）和mDelta0.5 Gal4的（R4和R7的开发）13。几个亚型特异性Gal4的驱动线存在使用不同的视紫红质的推动者14。特别有用的荧光探针实时成像photoconvertible蛋白质。我们已经成功地使用Dendra2，单体绿色到红色photoconvertable蛋白质15。请注意，Dendra2使用488nm氩激光线的设计是photoconvertible。然而，我们无法实现转换，使用蓝色可见光，无论是传统的或共振的共焦扫描模式设置。相比之下，405纳米的紫外激光的转换效率。
3。免疫组化：
对于固定的成人的眼睛，我们往往会选择罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen公司，公司）或抗Chaoptin（一个光感受器特异性抗体 16）以可视化rhabdomeric的结构（图1A ）。分析椎板墨盒结构的一个好方法是要结合反chaoptin 16，胶质标记反乌梅17，和反sec6 18（图1B）。如图所示。 3，这种结合的抗体区分的（chaoptin）主要突触前和突触后（sec6）进程以及上皮细胞的神经胶质细胞中的19层（乌木）。
组装灌注腔
实时成像，我们采用了灌注腔慢交换的解决方案，允许在不扰民的组织准备。灌注室组装示范，包括视频和示意图如图2所示。大会灌注室如图所示。 2A。开始铺设垫片首先在试样，然后继续与组装，如图所示。垫片的目的是创建一个室的基础和盖子，在里面的组织是密封的空间，并通过该解决方案将流之间的空间。空间内的垫片必须包括入口（这里的解决方案进入），组织准备，并通过该解决方案离开会议厅的插座。垫片的两个特性是至关重要的：首先，垫圈必须足够厚的大脑还薄，足以让一个高分辨率的镜头成像。理想的垫片的厚度取决于设置特定的参数。其次，在垫片的缺口提供了一个隔间，让泡沫，通过无接触标本（图2B）。
显微镜的成像
我们用一个63X（光圈1.3）的甘油浸没透镜灌注室或直接进入幻灯片上的培养基中一个63X的水浸泡镜头。甘油的镜头提供多油镜头的工作距离。我们使用一个共振扫描共聚焦显微镜扫描快得多的速度比传统的扫描仪（8000赫兹与1400赫兹），分别。共振扫描可随着时间的推移的快速三维录音ER帧速率。此外，更快的扫描速度显着降低激光光毒性6这是一个主要关注的活组织反复扫描。激光强度和PMT电压（增益）的平衡，必须实现最大化的信号，同时最大限度地降低了噪声和漂白。一个重要的进一步审议，激光影响某一区域上的金额是由分辨率和变焦决定。例如，选择的地区是在相同的分辨率在256x256的，变焦2X 1X变焦，512 × 512扫描，但最大可能的实时成像速度快4倍，在256 × 256，放大2倍。为了记录快速移动的细胞内的车厢的活动，我们已经成功地记录了以下设置：在一率5％的Z - Stack帧，每10秒的Z - Stack与8000赫兹和2X线平均扫描速度。对于长成像会议上的小时刻度，我们通常会降低帧速率以每几分钟，选择面积较大的地区，准备更可能转向。
果蝇视觉系统解剖学
图3显示了解剖果蝇成人眼（图3A），成人的大脑（图3B），以及20％-25％的蛹眼盘/脑复杂（图3C）。图3A显示椎板和附着的脂肪细胞和无成人的眼睛。在成人眼清扫术，椎板，依偎在由感光细胞机构（左）组成的一个碗眼的中心，必须删除，而不会干扰下（右）的胞体。成人大脑解剖，应该能够分辨感光细胞组织，椎板，视叶，中央的大脑，和气管（图3B）。需要删除，同时使视神经叶椎板剥离的光感受器和气管。为了帮助确定在20-25％的蛹眼盘/大脑复杂，是一个实时影像图3C。
图1（A）成人的大脑。 （二）成人眼。 （三）20％-25％蛹eye-disc/brain复杂。
图2：（一）灌注室大会和（二）垫片定位相对标本。
图3：（一）成人rhabdomere染色用抗chaoptin 。 （二）使用反chaoptin（绿色，感光器），反乌梅（红色，神经胶质细胞），并sec6（蓝色，interneurons）成人椎板染色。
Acknowledgments
这项工作是由韦尔奇基金会（I - 1657年）和美国国立卫生研究院（RO1EY18884）的赠款支持。公屋是尤金麦克德莫特在生物医学研究的学者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | |
| GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | |
| 20-Hydroxyecdysone | Sigma-Aldrich | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment:
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References
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