यह प्रोटोकॉल तीन वर्णन<em> ड्रोसोफिला</em> तैयारी: 1) वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन, 2) वयस्क रेटिना विच्छेदन और 3) डिस्क मस्तिष्क आँख परिसरों विच्छेदन के विकास. जोर विशेष तैयारी तकनीकों और रहते इमेजिंग के लिए शर्तों पर रखी है, हालांकि सभी तैयारियाँ तय ऊतक immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
<em> ड्रोसोफिला</em> मस्तिष्क और दृश्य प्रणाली व्यापक रूप से मॉडल सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं neuronal विकास कार्य, और अध: पतन का अध्ययन. यहाँ हम मस्तिष्क के तीन तैयारियाँ और दृश्य प्रणाली है कि विकासशील pupae में विकसित आंख डिस्क मस्तिष्क जटिल से व्यक्तिगत और वयस्क मक्खियों से मस्तिष्क विच्छेदन आँख रेंज को कवर दिखा. सभी प्रोटोकॉल तैयारियाँ रहते संस्कृति के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. हालांकि, हम यह भी तय ऊतक immunohistochemistry जहां लागू के लिए शर्तों को प्रस्तुत करते हैं. अंत में, हम इन छिड़काव कक्ष में पारंपरिक और गुंजयमान 4D confocal रहते इमेजिंग का उपयोग की तैयारी के लिए रहते इमेजिंग शर्तों दिखा. साथ में, इन प्रोटोकॉल अलग अलग समय के कई घंटे के पैमाने पर विकास या अपक्षयी प्रक्रियाओं मिनट के पैमाने पर कार्यात्मक intracellular assays से लेकर तराजू पर रहते इमेजिंग के लिए एक आधार प्रदान करते हैं.
प्रतिदीप्त इमेजिंग के लिए खेतों में प्रयुक्त किए गए जांच
यहाँ हम तीन वर्गों से फ्लोरोसेंट जांच के चयन के लिए ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली तैयारी की शक्तियों और सीमाओं का वर्णन: (1) जांच है कि एक जीवित ऊतक exogenously तैयारी के लिए जोड़ रहे हैं, (2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि आनुवंशिक रूप से दोनों रहते हैं और के लिए इनकोड किया गया है तय इमेजिंग, (3) फ्लोरोसेंट रंजक है कि immunohistochemistry के लिए तय ऊतक करने के लिए जोड़ रहे हैं.
1. Exogenous जांच:
Lysotracker DND-26 या DND 99 लाल ग्रीन (Invitrogen इंक) इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं फ्लोरोसेंट झिल्ली पारगम्य यौगिकों कि सेल, सबसे प्रमुखता lysosomes में मजबूती acidified डिब्बों में जमा है, देर endosomes, और autophagosomes . Nanomolar सांद्रता (हम आम तौर पर 50 एनएम का उपयोग) पर Lysotracker कम से कम एक मिनट में पूरी तरह से L3 और पी 20% आँख डिस्क प्रवेश. के बाद से लगातार Lysotracker जम जाता है और कम से कम 5 मिनट में एक alkalizing प्रभाव, हम छवि डाल रही है. आँख डिस्क के विपरीत, Lysotracker ऊतकों के विघटन के बिना मस्तिष्क घुसना नहीं करता है. हालांकि, बाहरी झिल्ली के फाड़ सावधान ऑप्टिक पालि में कुछ सेल diameters के प्रवेश की अनुमति देता है.
Lysosensor DND Lysotracker करने के लिए इसके विपरीत में 189 (Invitrogen इंक), Lysosensor acidified डिब्बों में नहीं जमा करता है, लेकिन प्रदर्शन अम्लीय pH में प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है. Lysosensor पैठ विशेषताओं है कि बहुत Lysotracker करने के लिए इसी तरह की हैं है. हम 1μM की एकाग्रता पर Lysosensor का उपयोग करें.
2. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच:
कई रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हम GFP, 10 TagRFP या पीएच संवेदनशील द्विआधारी Gal4/UAS अभिव्यक्ति 12 प्रणाली के नियंत्रण के तहत 11 pHluorin जैसे विभिन्न फ्लोरोसेंट अणु के साथ टैग जीनों व्यक्त करते हैं. लाइनों है कि विकासशील photoreceptors में व्यक्त करते हैं Gal4 – जीएमआर (सभी photoreceptors) Gal4 8 और (R4 और R7 के विकास) mDelta0.5 – Gal4 13 शामिल हैं. कई विशिष्ट Gal4-subtype ड्राइवर लाइनों उपयोग करें कि अलग Rhodopsin 14 प्रमोटरों मौजूद हैं. रहते इमेजिंग में विशेष रूप से उपयोगी फ्लोरोसेंट जांच photoconvertible प्रोटीन होते हैं. हम सफलतापूर्वक Dendra2, एक monomeric हरी लाल photoconvertable 15 प्रोटीन का इस्तेमाल किया है. ध्यान दें कि Dendra2 के लिए photoconvertible 488nm आर्गन लेजर पंक्ति का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. हालांकि, हम करने के लिए रूपांतरण प्राप्त करने के लिए दिखाई नीले प्रकाश या तो पारंपरिक या गुंजयमान confocal स्कैनिंग मोड में हमारे सेट अप का उपयोग कर का उपयोग करने में असमर्थ हैं. इसके विपरीत, 405nm यूवी लेजर के साथ रूपांतरण कुशल है.
3. Immunohistochemistry:
तय वयस्क आँख के लिए, हम अक्सर या तो rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc,) या विरोधी Chaoptin (एक फोटोरिसेप्टर विशिष्ट एंटीबॉडी 16) का चयन करने के लिए rhabdomeric संरचना (चित्र 1A) कल्पना. लामिना कारतूस संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छा तरीका करने के लिए 16 विरोधी chaoptin, glial मार्कर 17 विरोधी आबनूस, और 18 विरोधी sec6 (चित्र 1 बी ) गठबंधन है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 3, एंटीबॉडी के इस संयोजन के प्रमुख (chaoptin) presynaptic और postsynaptic (sec6) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 19 लामिना में उपकला glia आबनूस () अलग प्रक्रियाओं .
कोडांतरण छिड़काव चैंबर
रहते इमेजिंग के लिए, हम है कि ऊतक तैयारी के बिना परेशान समाधान की धीमी गति से आदान – प्रदान की अनुमति देता है एक छिड़काव कक्ष को रोजगार. छिड़काव चैम्बर विधानसभा के एक प्रदर्शन वीडियो में शामिल है और schematically चित्रा 2 में दिखाया गया है. छिड़काव चैम्बर के विधानसभा छवि में सचित्र है. 2A. नमूना से अधिक गैसकेट पहले बिछाने से शुरू, और फिर विधानसभा के साथ जारी रखने के रूप में दिखाया गया है. पाल बांधने की रस्सी के प्रयोजन के आधार और चैम्बर के ढक्कन, एक स्थान है जो अंदर ऊतक और सील है जिसके माध्यम से समाधान बहेगा के बीच एक जगह बनाने के लिए है. गैस्केट के अंदर जगह (समाधान यहाँ प्रवेश करती है) इनलेट, ऊतक प्रस्तुत करने का, और दुकान के माध्यम से जो समाधान कक्ष पत्ते शामिल करना चाहिए. पाल बांधने की रस्सी के दो सुविधाओं के महत्वपूर्ण हैं: पहले, मस्तिष्क के लिए काफी मोटी गैसकेट अभी तक काफी पतली है एक उच्च संकल्प के साथ लेंस इमेजिंग की अनुमति चाहिए. आदर्श गैसकेट मोटाई सेट अप विशिष्ट मानकों पर निर्भर करता है. दूसरा, गैस्केट में एक पायदान एक कम्पार्टमेंट है कि नमूना (चित्र 2B) से संपर्क के बिना एक बुलबुले के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है.
माइक्रोस्कोप में इमेजिंग
हम छिड़काव या किसी स्लाइड पर मध्यम संस्कृति में सीधे एक 63x पानी विसर्जन लेंस कक्ष के लिए एक 63x (1.3 एपर्चर) ग्लिसरीन विसर्जन लेंस का उपयोग करें. ग्लिसरीन लेंस तेल लेंस से अधिक काम दूरी प्रदान करते हैं. हम एक गुंजयमान स्कैनिंग confocal खुर्दबीन जो एक पारंपरिक स्कैनर (8000 हर्ट्ज बनाम 1400 हर्ट्ज, क्रमशः) की तुलना में बहुत तेजी से दरों पर स्कैन का उपयोग करें. गूंजनेवाला स्कैनिंग समय के साथ तेजी से 3 आयामी रिकॉर्डिंग की अनुमति देता हैएर फ्रेम दरों. इसके अलावा, तेजी से स्कैन की गति काफी कम लेजर 6 phototoxicity जो जीवित ऊतक के दोहराया स्कैन के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है . लेजर की तीव्रता और PMT वोल्टेज (लाभ) का एक संतुलन के लिए संकेत को अधिकतम जबकि कम से कम शोर और photobleaching हासिल किया जाना चाहिए. एक महत्वपूर्ण आगे विचार है कि किसी दिए गए क्षेत्र पर लेजर प्रभाव की राशि संकल्प और ज़ूम के द्वारा निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, पसंद का एक क्षेत्र 512×512, 1x ज़ूम के रूप में एक ही संकल्प 256×256, ज़ूम 2x पर स्कैन है, अभी तक ज़्यादा से ज़्यादा संभव रहते इमेजिंग गति 256×256 में 4 गुना तेजी से है, 2x ज़ूम. जल्दी से intracellular डिब्बों बढ़ने की गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हम सफलतापूर्वक निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ दर्ज की गई है: एक की दर पर z ढेर 5 प्रति तख्ते 8000 हर्ट्ज और 2x लाइन औसतन एक स्कैन गति के साथ प्रति 10 सेकंड Z-ढेर. घंटे के पैमाने पर लंबे इमेजिंग सत्र के लिए, हम अक्सर कई मिनट प्रति फ्रेम दर को कम और बड़े क्षेत्रों का चयन के रूप में तैयारी और अधिक के लिए बदलाव की संभावना है.
ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली की शारीरिक रचना
चित्रा 3 ड्रोसोफिला वयस्क आंख (छवि 3A), वयस्क मस्तिष्क (3B छवि), और 20% -25% pupal आँख / डिस्क मस्तिष्क जटिल (छवि -3 सी) के शरीर रचना विज्ञान से पता चलता है. चित्रा 3A दोनों के साथ और लामिना और वसा जुड़ी कोशिकाओं के बिना वयस्क आंख दिखाता है. वयस्क आँख विच्छेदन के दौरान, लामिना, जो फोटोरिसेप्टर सेल निकायों (बाएं) द्वारा गठित एक कटोरी में बसे आँख के केंद्र में है, के नीचे (सही) सेल निकायों में बाधा पहुँचा के बिना हटा दिया जाना चाहिए. वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन के लिए, एक फोटोरिसेप्टर सेल निकायों, लामिना, ऑप्टिक पालि, केंद्रीय मस्तिष्क, और ट्रेकिआ (छवि 3B) का भेद करने में सक्षम होना चाहिए. photoreceptors और ट्रेकिआ इस विच्छेदन के लिए हटा दिया जाना चाहिए जबकि ऑप्टिक पालि से जुड़ी लामिना छोड़ने. 20-25% pupal आँख जटिल / डिस्क मस्तिष्क की पहचान में सहायता करने के लिए, एक जीवित छवि चित्रा 3C में प्रस्तुत किया है.
चित्रा 1 (ए) वयस्क मस्तिष्क. (बी) वयस्क आँख. (सी) 20% -25% pupal eye-disc/brain जटिल.
चित्रा 2 (ए) परफ्यूज़न चैम्बर विधानसभा और (बी) गैसकेट नमूना करने के लिए सापेक्ष स्थिति.
चित्रा 3 (ए) वयस्क rhabdomere विरोधी chaoptin का उपयोग धुंधला हो जाना. (बी) वयस्क लामिना (हरे, photoreceptors) विरोधी chaoptin, विरोधी आबनूस (लाल, glia), और sec6 (नीले, interneurons) का उपयोग कर धुंधला हो जाना.
यह काम वेल्श (मैं 1657) फाउंडेशन और NIH (RO1EY18884) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. PRH जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक यूजीन McDermott विद्वान है.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | ||
GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | ||
20-Hydroxyecdysone | Sigma | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment: