Detta protokoll beskriver tre<em> Drosophila</em> Beredningar: 1) vuxna hjärnan dissektion, 2) vuxna näthinnan dissektion och 3) utveckla öga disc-hjärna komplex dissekering. Tonvikten läggs på speciella förberedelser tekniker och för levande avbildning, även om alla förberedelser kan användas för fast vävnad immunohistokemi.
Den<em> Drosophila</em> Hjärna och visuella systemet är allmänt används modellsystem för att studera nervsystemets utveckling, funktion och degeneration. Här visar vi tre beredningar av hjärnan och visuella system som omfattar hela skalan från utvecklingsländerna ögat disc-hjärna komplex i utvecklingsländerna puppor till enskilda ögat och hjärnan dissektion från vuxna flugor. Samtliga protokoll är optimerade för den levande kulturen i förberedelserna. Men presenterar vi också förutsättningarna för fixerat immunohistokemi i förekommande fall. Slutligen visar vi lever imaging förutsättningar för dessa preparat med konventionell och resonant 4D konfokala Bildproduktion i en perfusion kammare. Tillsammans utgör dessa protokoll ge en grund för live-avbildning på olika tidsskalor, från funktionell intracellulära analyser i skala minuter till utveckling eller degenerativa processer på skalan av många timmar.
Fluorescerande prober används för avbildning
Här beskriver vi de styrkor och begränsningar av Drosophila visuella systemet förberedelse för ett urval av fluorescerande prober från tre klasser: (1) sonder som läggs till en levande vävnad förberedelse exogent, (2) fluorescerande proteiner som är genetiskt kodade för både live och Fast imaging, (3) fluorescerande färger som läggs till fast vävnad för immunohistokemi.
1. Exogena sonder:
Lysotracker Grön DND-26 eller Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Dessa är kommersiellt tillgängliga fluorescerande membran som släpper igenom ämnen som ackumuleras i starkt försurad fack i cellen, framförallt lysosomer, sen endosomes och autophagosomes. Lysotracker på nanomolära koncentrationer (vi använder vanligtvis 50 nM) penetrerar L3 och P 20% ögat skiva helt på mindre än en minut. Sedan Lysotracker ackumuleras kontinuerligt och utövar ett alkaliseringsmedel effekt, vi bilden på mindre än 5 minuter. I motsats till ögat skivor, tränger Lysotracker inte hjärnan utan avbrott i vävnaden. Dock medger noggrann riva av den yttre membran penetration av ett fåtal celler diameter i synnerven lob.
Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) I motsats till Lysotracker, inte Lysosensor inte ackumuleras i syrad fack, men uppvisar ökad fluorescens vid surt pH. Lysosensor har penetrationen egenskaper som är mycket lik Lysotracker. Vi använder Lysosensor vid en koncentration av 1μM.
2. Genetiskt kodade sonder:
För många Bildproduktion experiment, uttrycker vi gener märkta med olika fluorescerande molekyler som GFP, TagRFP 10 eller pH-känsliga pHluorin 11 under kontroll av de binära Gal4/UAS expressionssystem 12. Gal4-linjer som uttrycker att utveckla fotoreceptorer inkluderar GMR-Gal4 (alla fotoreceptorer) 8 och mDelta0.5-Gal4 (utveckla R4 och R7) 13. Flera subtyp-specifika Gal4-driver linjer existerar som använder olika Rhodopsin initiativtagare 14. Särskilt bra fluorescerande prober i levande avbildning är photoconvertible proteiner. Vi har framgångsrikt använt Dendra2, en monomer grön till röd photoconvertable protein 15. Observera att Dendra2 är avsedd att vara photoconvertible med en 488nm Argon laser linje. Dock kan vi inte uppnå konvertering med synligt blått ljus med hjälp av vår inställning i antingen traditionell eller resonant konfokal skanning läge. Däremot är konvertering med 405nm UV-laser effektiv.
3. Immunohistokemi:
För den fasta vuxna ögat, väljer vi ofta antingen Rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc.) eller anti-Chaoptin (en ljusmätare-specifik antikropp 16) för att visualisera rhabdomeric struktur (Fig. 1A). Ett bra sätt att analysera strukturen lamina patronen är att kombinera anti-chaoptin 16, gliaceller markör anti-ebenholts 17, och anti-sec6 18 (Fig. 1B). Som visas i figur. 3, skiljer denna kombination av antikroppar de stora presynaptiska (chaoptin) och postsynaptiska (sec6) processer samt epiteliala Glia (ebenholts) i lamina 19.
Montering av perfusion avdelningen
För levande avbildning, använder vi en genomblödning kammare som gör att långsamma utbyte av lösningar utan att störa den vävnad förberedelse. En demonstration av perfusionen kammare montering ingår i video och schematiskt visas i figur 2. Montering av perfusionen kammaren visas i fig. 2A. Börja med att lägga packningen över provet först, och sedan fortsätta med monteringen som visas. Syftet med packningen är att skapa ett utrymme mellan botten av kammaren och locket, ett utrymme där vävnad är förseglade och genom vilken lösning som kommer att flöda. Utrymmet inne i packningen måste innehålla inloppet (lösning in här), vävnaden prep, och utloppet genom vilken lösning som lämnar kammaren. Två funktioner i packningen är kritiska: Först måste packningen vara tillräckligt tjock för hjärnan men tunt nog att tillåta avbildning med hög upplösning lins. Den idealiska packningen tjocklek beror på set-up-specifika parametrar. För det andra ger ett hack i packningen ett fack som gör att en bubbla att passera utan att kontakta prov (Fig. 2B).
Imaging vid Mikroskop
Vi använder en 63x (bländare 1,3) glycerin nedsänkning objektiv för perfusion kammare eller en 63x vattennedsänkningsprovning objektivet direkt i substratet i en bild. Glycerin linser ger mer arbetsavstånd än olja linser. Vi använder en resonant scanning konfokalmikroskop som skannar i mycket snabbare takt än en vanlig scanner (8000 Hz kontra 1400 Hz, respektive). Resonant scanning gör 3-dimensionella inspelningar med tiden vid snabbER bildhastighet. Dessutom, snabbare scanna hastighet avsevärt minska laser fototoxicitet 6 som är ett stort bekymmer för upprepade genomsökningar av levande vävnad. En balans av laser intensitet och PMT spänning (vinst) måste uppnås för att maximera signal samtidigt minimera buller och fotoblekning. En viktig ytterligare övervägande är att mängden av laser påverkan på en viss region bestäms av upplösning och zoom. Till exempel är en region i valet skannas på samma upplösning på 256×256, zoom 2x per 512×512, zoom 1x, men den maximalt möjliga Bildproduktion hastighet är 4 gånger snabbare på 256×256, zoom 2x. För att spela in aktiviteten av snabbrörliga intracellulära fack, har vi spelade framgångsrikt med följande inställningar: 5 bilder per z-stack med en hastighet av ett z-stack per 10 sekunder med en skanningshastighet på 8000 Hz och 2x linje genomsnitt. För långa avbildning sessioner på skalan timmar minskar vi ofta bildfrekvensen till en per flera minuter och välja större områden som beredningen är mer sannolikt att skifta.
Drosophila Visual System Anatomi
Figur 3 visar anatomi Drosophila vuxna ögat (Fig. 3A), den vuxna hjärnan (Fig. 3B), och 20% -25% PUPP-ögon-skiva / hjärnans komplexa (Fig. 3C). Figur 3A visar vuxna ögat både med och utan lamina och fett bifogade celler. Under den vuxna ögat dissektion,, laminan, som är i mitten av ögat inbäddat i en skål bildas av ljusmätare cellen organ (till vänster) måste avlägsnas utan att störa cellens organ under (höger). För den vuxna hjärnan dissektion ska man kunna skilja de photoreceptor cellen organ, lamina, synnerven lob, centrala hjärnan, och luftstrupe (Fig. 3B). Den fotoreceptorer och luftstrupe måste tas bort för denna dissektion samtidigt som lamina bifogas optisk lob. För att underlätta identifieringen av 20-25% PUPP-ögon-skiva / hjärnan komplex, är en levande bild som presenteras i figur 3C.
Figur 1. (A) vuxna hjärnan. (B) vuxna ögat. (C) 20% -25% PUPP-eye-disc/brain komplex.
Figur 2. (A) perfusion kammare montering och (B) packningen positionering i förhållande till provet.
Figur 3. (A) Vuxen rhabdomere färgning med anti-chaoptin. (B) Vuxen lamina färgning med anti-chaoptin (grön, fotoreceptorer), anti-ebenholts (röd, Glia) och sec6 (blå, interneuron).
Detta arbete har finansierats med bidrag från Welch Foundation (I-1657) och NIH (RO1EY18884). PRH är en Eugene McDermott Scholar inom biomedicinsk forskning.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | ||
GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | ||
20-Hydroxyecdysone | Sigma | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment: