Summary
Dieses Video zeigt die Technik zur Gewinnung von DNA aus den Arten von Mikroben mit Wohnsitz in der Termite Enddarm. Die Herstellung eines Nasspräparat Rutsche, die nützlich für die Visualisierung der gut mikrobiellen Gemeinschaft ist, ist auch dargestellt, und eine Tour durch die artenreiche gut Umfeld gegeben ist.
Abstract
Termiten gehören zu den wenigen Tieren bekannt, dass die Fähigkeit, allein bestehen durch den Verzehr von Holz haben. Die Termitendarm Trakt enthält eine dichte und artenreiche mikrobiellen Population, die in den Abbau von Lignocellulose unterstützt überwiegend in Acetat, der Schlüssel Nährstoff Betankung Termiten Stoffwechsel (Odelson & Breznak, 1983). Innerhalb dieser mikrobiellen Populationen sind Bakterien, methanogenen Archaea und in einigen ("lower") Termiten, Protozoen eukaryotische. So werden Termiten ausgezeichnete Versuchspersonen für die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroben-Spezies und den zahlreichen biochemischen Funktionen, die sie durchführen, um den Nutzen ihrer Gastgeber. Die Artenzusammensetzung der mikrobiellen Populationen in Termiten guts sowie wichtige Gene in verschiedenen biochemischen Prozessen beteiligt wurde erforscht mit Hilfe molekularer Techniken (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Diese Techniken sind abhängig von der Extraktion und Reinigung von hochwertigen Nukleinsäuren aus der Termitendarm Umwelt. Die Extraktion Technik in diesem Video beschrieben wird, eine modifizierte Zusammenstellung von Protokollen für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Umweltproben (Mor et al, 1994 entwickelt;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) und sie produziert DNA von Termiten Enddarm Material für die Verwendung als Vorlage für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).
Protocol
Zusammenfassung des Verfahrens für die Termiten ganzen Darm DNA-Extraktion:
- Gefühlt Termiten auf Eis zu entfernen gut mit einer sterilen Pinzette und stabilisieren gut Proben in Puffer.
- Homogenisieren Proben in PVPP / SDS / Phenol-Puffer.
- Extrahieren und zu reinigen DNA aus Rohlysat mit Qiagen DNeasy Spalten.
Protokoll:
- Auf Eis, entfernen Sie die Eingeweide aus Arbeiter Kaste Termiten mit einer sterilen Pinzette.
- Sofort überweisen Sie den Mut und die Inhalte in einen sterilen, Nuklease-freies Röhrchen mit 50 uL eiskaltem 1x Molekularbiologie TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze-Proben bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt mit der Homogenisierung.
- Übertragen Sie die gut Proben und Puffer, um eine sterile, Nuklease-freies 2 ml Schraube Röhrchen vorinstalliert mit 500 mg sterile Zirkonoxid / Silica-Kugeln (0,1 mm) und 700 ul 1x TE-Puffer mit 1% w / v Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ).
- Dann werden 50 ul 20% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 500 ul Phenol zu den Proben.
- Homogenisieren (bead beat) auf die höchste Einstellung mit drei Zyklen von 30 sec homogenisiert und 30 sec von Kühlen auf Eis.
- Sediment unlösliches Material für 1 min bei 8.000 x g.
- Purify 300-ul Aliquots der wässrigen (oberste) Schicht mit Qiagen DNeasy Spalten mit der Methode für Rohlysat Reinigung beschrieben.
- Quantify Nukleinsäure Inhalt und frieren die Proben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung.
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Discussion
Nach unserer Erfahrung ist die DNA aus der mikrobiellen Lebensgemeinschaften von Holz-Fütterung Termitenart wie Zootermopis nevadensis extrahiert rein genug für die PCR-Vorlage nach einer Runde der Extraktion und Reinigung. Jedoch können einige Termiten, wie Wurf-Fütterung und Boden-Fütterung Arten haben eine höhere Konzentration an Huminsäuren in ihren Darminhalt und kann zusätzliche Reinigung des Darms mikrobielle DNA erfordern. Die gesamte DNA-Ausbeute aus dem Bauch von 5 Z. nevadensis Arbeiter liegt im Bereich von 10-30 pg. Für Termitenart deutlich kleiner oder größer als diese Art, können mehr oder weniger Proben erforderlich, um eine ähnliche Menge an DNA zu erhalten.
Diese Methode kann leicht angepasst, um die RNA-Extraktion zu ermöglichen. Für die RNA-Extraktion, Ersatz 1x RNAprotect Bakterien-Reagenz von Qiagen (CATLOG Nr. 76.506) für den eiskalten TE-Puffer in Schritt 2 des Protokolls beschrieben. Qiagen RNeasy Reagenzien und Spalten (CATLOG Nr. 74.104) sollten an die Stelle der DNeasy Reinigung oben beschriebene Verfahren verwendet werden. Als DNA kann aus RNAprotect-stabilisierten Proben gereinigt werden und nur 300 ul der rund. 700 ul wässrige Schicht in Schritt 7 abgerufen wird benötigt für die Aufreinigung von Nukleinsäuren, diese Methode verwendet werden, um sowohl DNA als auch RNA in parallel aus einer einzigen Probe abgerufen werden.
Diese Techniken sind abhängig von der Extraktion und Reinigung von hochwertigen Nukleinsäuren aus der Termitendarm Umwelt. Die Extraktion Technik in diesem Video beschrieben wird, eine modifizierte Zusammenstellung von Protokollen für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Umweltproben (Moré et al, 1994 entwickelt;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) und sie produziert DNA von Termiten Enddarm Material für die Verwendung als Vorlage für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
