Extraction d'ADN de l'microbes de l'intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l'intestin
Summary
Cette vidéo illustre la technique d'extraction d'ADN à partir des espèces de microbes réside dans l'intestin postérieur des termites. La préparation d'une lame de montage humide, ce qui est utile pour visualiser la communauté microbienne intestinale est également illustré, et une tournée à travers les riches en espèces environnement intestinal est donné.
Abstract
Les termites sont parmi les rares animaux connus pour avoir la capacité de subsister uniquement par le bois de consommation. Le tractus intestinal des termites contient une population microbienne dense et riche en espèces qui assiste à la dégradation de la lignocellulose en majorité dans l'acétate, le nutriment clé alimente le métabolisme des termites (Odelson & Breznak, 1983). Au sein de ces populations microbiennes sont des bactéries, les archées méthanogènes et, dans certains termites («inférieure»), eucaryotes protozoaires. Ainsi, les termites sont des sujets d'excellentes recherches pour étudier les interactions entre les espèces microbiennes et les nombreuses fonctions biochimiques qu'ils effectuent au profit de leur hôte. La composition des espèces des populations microbiennes dans les intestins des termites ainsi que des gènes clés impliqués dans divers processus biochimiques a été explorée en utilisant des techniques moléculaires (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Ces techniques dépendent de l'extraction et la purification de haute qualité acides nucléiques à partir de l'environnement intestinal termites. La technique d'extraction décrite dans cette vidéo est une compilation modifiée de protocoles développés pour l'extraction et la purification des acides nucléiques à partir d'échantillons environnementaux (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) et il produit l'ADN à partir de matériaux hindgut termites pouvant servir de modèle pour la réaction en chaîne polymérase (PCR).
Protocol
Discussion
Dans notre expérience, l'ADN extrait des communautés microbiennes des espèces de termites du bois-alimentation, comme nevadensis Zootermopis est suffisamment pur pour le modèle PCR après un tour d'extraction et de purification. Cependant, certains termites comme de la litière et le sol maternel espèces se nourrissant peut avoir une concentration plus élevée d'acides humiques dans leur contenu intestinal et peut nécessiter une purification supplémentaire de l'ADN microbien intestinal. Le rendement d'ADN total d…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | BioSpec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | BioSpec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. USA | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
