Summary
في الوضع الطبيعي للتجزيء التحت خلوية خلايا الثدييات على coverslips المجهر يسمح التصور من توطين البروتين.
Abstract
ويقترن ثيقا لتوطين وظيفة البروتين البروتين. على الرغم من تقييد بعض البروتينات لموقع معين أو مقصورة التحت خلوية ، العديد من البروتينات موجودة في عدد السكان نشرها بحرية في التبادل الحر مع مجموعة من السكان دون أن يرتبط بشكل وثيق مع ملك التحت خلوية معينة أو هيكل في تجزيء التحت خلوية الموقع يسمح التصور من ويمكن تقسيم البروتين تكشف أيضا البروتين الفرعي لتوطين السكان الذين هياكل محددة. على سبيل المثال ، يمكن إزالة بروتينات هيولي قابلة للذوبان والبروتينات النووية التي عقدت رابطة فضفاضة تكشف مستقرة لبعض عوامل النسخ مع لونين. يمكن هضم لاحقة من الحمض النووي في بعض الحالات تكشف بالتعاون مع شبكة من البروتينات والرناوات التي تسمى مجتمعة سقالة النووية أو مصفوفة النووية.
نحن هنا وصف الخطوات المطلوبة خلال تجزيء في الوضع الطبيعي للخلايا الثدييات وغير ملتصقة ملتصقة على اساس coverslips المجهر. ويمكن تحقيق التصور البروتين باستخدام أجسام مضادة معينة أو البروتينات الفلورية والانصهار المجهري مضان. الأضداد و / أو الأصباغ الفلورية والتي تكون بمثابة علامات للمقصورات محددة أو هياكل تسمح ليتم تعيينها توطين البروتين بالتفصيل. تجزيء في الموقع ويمكن أيضا أن يقترن الغربية النشاف لمقارنة كميات من البروتين موجودة في كل جزء. ويمكن هذا النهج بسيطة تكشف البيوكيميائية الجمعيات التي لم يتم كشفها إلا ستبقى.
Protocol
أولا التحضير للتجزيء
هذا المقطع يصف إعداد بولي - L - يسين coverslips المجهر المغلفة والمرفق من الخلايا قبل التجزئة. يمكن إذا اقتضى الأمر أن تكون الخلايا transfected عابر مع ناقلات بروتين تعبير إما قبل أو بعد المرفق.
A. إعداد بولي - L - يسين coverslips المغلفة
- يعد حل 1mg/ml بولي - L - يسين في الماء المقطر.
- coverslips معطف نظيفة مع بولي يسين - L التي تفرخ لهم في حل ما لا يقل عن 1 ساعة على منصة هزاز عند 22 درجة مئوية.
- غسل coverslips المغلفة مع الماء المقطر المعقم مرتين واتبع مع غسل واحد مع الايثانول 96 ٪.
- الهواء الجاف coverslips المغلفة على قطعة من ورق الترشيح والاحتفاظ بها في وعاء جاف لاستخدامها في المستقبل (الجاف مرة واحدة يمكن أن تكون مكدسة منها).
باء الخلايا المرتبطة coverslips
غير ملتصقة الخلايا (وهنا نستخدم خلايا K562)
- مكان ساترة بولي - L - يسين المغلفة في بئر في لوحة 6 - جيدا مع السطح المطلي مواجهة.
- K562 البذور في مناطق ذات كثافة الخلايا من الخلايا 7x10 5 / Dulbecco جيدا في متوسطة والنسور التعديل (DMEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) ، و PS (البنسلين 100units/ml ، 100mg/ml الستربتوميسين). ويمكن في حالة الخلايا K562 أن يؤديها ترنسفكأيشن عابرة باستخدام electroporation (cuvettes electroporation 0.4cm مع 1x10 7 200μl الخلايا في وسائل الإعلام في 250V / 975μF) قبل البذر الخلايا.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2.
- مخزنة من أجل المتوسط وقبالة غسل الخلايا مرتين مع الفوسفات الجليد الباردة المالحة (PBS).
- اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية.
ملتصق الخلايا (وهنا نستخدم خلايا كوس - 7)
- وضع علامة ساترة غير المصقول في بئر في لوحة 6 - جيدا.
- prewarmed يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
- فصل الخلايا عن طريق هضم مع التربسين (0.03 ٪ EDTA ، 0.25 ٪ التربسين) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 5 دقائق. فمن المهم عدم الإفراط في هضم الخلايا ووقف عملية الهضم بمجرد الخلايا الفردية عائمة في الغالب موجودة.
- توقف عملية الهضم من خلال زرع خلايا في مناطق ذات كثافة الخلايا 3x10 5 / جيد في لوحة 6 - جيدا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ وباريس سان جيرمان (البنسلين 100 وحدة / مل ، والستربتوميسين 100ug/ml 292ug/ml L - الجلوتامين) يوم coverslips العادي. الخلايا الملتصقة بشكل جيد عموما نعلق على coverslips المجهر العادي ، ومع ذلك ، يمكن استخدام بولي - L - يسين coverslips المغلفة إذا لزم الأمر.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. ويمكن في حالة كوس - 7 خلايا يتم تنفيذ ترنسفكأيشن عابرة باستخدام Fugene 6 (روش) إذا لزم الأمر وترك الخلايا لاستعادة لمدة 24 ساعة أخرى في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- تخلصي من المتوسط وغسل خلايا مرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
- اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية.
II. التحت خلوية تجزيء
كسر في الموقع يتم تنفيذ وفقا لالتخطيطي هو مبين في الشكل (1) ويستند على الطريقة الموصوفة سابقا 5 مع التعديلات المذكورة سابقا في 7 و بروتوكول المفصلة أدناه. فمن المستحسن لنقل coverslips إلى لوحة 6 - جيدا بعد كل خطوة جديدة تجزيء إزالة ساترة قبل إزالة السائل. على الرغم من أن هناك حاجة سوى أربعة coverslips التصوير ، وهناك حاجة إضافية لإنتاج coverslips كله استخراج الخلايا والكسور مصفوفة النووية للغرب النشاف إذا كان هذا هو المراد تنفيذها بالتوازي.
- إعداد وتصفية العازلة الهيكل الخلوي (CSK) : PIPES 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM 2 ، 1MM EGTA. وينبغي CSK العازلة الطازجة يوم تجزئة.
- يمكن إذا لزم الأمر يمكن استخدام خلايا من ساترة لإعداد كامل لاستخراج الخلايا الغربية التنشيف برفق عن طريق وضع 200ul TES العازلة (1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مباشرة على ساترة واحتضان ل1 أو 2 دقيقة في 22 درجة مئوية. يمكن ثم استخراج الخلايا كلها تتم إزالة البروتينات وعجلت بإضافة 250ul من 1M (NH 4) 2 SO 4 وتفرخ على الجليد حتى عينات أخرى غربية جاهزة.
- غسل coverslips المتبقية مع 1ml الجليد الباردة PBS مرتين حتى 22 درجة مئوية بحلول إمالة لوحة 6 جيدا مرتين أو ثلاث مرات.
- إزالة الخلايا ساترة تمثل كلها ونقلها إلى لوحة 6 - جيدا الطازجة. اتبع مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
- إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية.
- استخراج البروتينات السيتوبلازمية النووية ، وعقد فضفاضة عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.1 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وعلى احتضانالثلج لمدة 1 دقيقة.
- إزالة استخراج حشوية ، وعقد فضفاضة النووية ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
- غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية.
- إزالة ساترة تمثل المواد النووية التي عقدت بإحكام ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
- إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم استخراج البروتينات التي عقدت بإحكام عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.5 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وتفرخ على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- إزالة استخراج عقد بإحكام ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
- غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية.
- إزالة ساترة تمثل جزءا لونين والمتابعة مع تثبيت الخلايا المناعية والبروتوكول مضان.
- إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم ضع 200ul CSK عازلة + 100ug/ml من الدناز وأنا على coverslips المتبقية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة انتزاع لونين ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
- غسل coverslips مع الثلج الباردة PBS مرتين في 22 درجة مئوية بحلول إمالة 6 جيدا للصفيحة.
- إزالة ساترة تمثل جزءا مصفوفة النووية ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
- يمكن إذا لزم الأمر يمكن إزالة البروتينات المصفوفة من مصفوفة ساترة إضافية للغرب النشاف باستخدام 200ul TES العازلة كما هو موضح في الخطوة 2.
- يجب طرد عينات لطخة غربية في 13000 دورة في الدقيقة في المقعد العلوي في microcentrifuge 4 درجات مئوية ، والكريات معلق في تحميل 40ul العازلة SDS (62.5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 ، 2 ٪ SDS (ث / ت) ، 50 ملي DTT ، 10 ٪ الجلسرين ، 0.01 ٪ زرقة البروموفينول (ث / ت)) قبل تحليل SDS - PAGE.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتجزيء التحت خلوية في الموقع. الهيكل الخلوي العازلة (CSK) ويتكون من أنابيب 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM 2 ، 1MM EGTA. TES العازلة يتكون من 1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس - 7.4 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك.
III. تثبيت الخلية والومضان المناعي
- إضافة بلطف 1ml من 4 ٪ الفورمالديهايد / PBS إلى كل ساترة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
- إضافة 400ul X-100/PBS تريتون من 0.1 ٪ إلى احتضان كل ساترة وعلى 22 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
- إضافة 400ul من الأبقار مصل الزلال 3 ٪ PBS / (BSA) ، واحتضان على 22 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحد من احتمال تلوين الخلفية.
- يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
- 100ul بدلا من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني مباشر على احتضان وساترة في 22 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وينبغي أن تضعف الأضداد الابتدائية والثانوية في برنامج تلفزيوني على التركيز المطلوب. هذا قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل جسم المستخدم.
- يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
- 200ul مكان الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني واحتضان عند 22 درجة مئوية بعيدا عن الضوء لمدة 1 ساعة.
- يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
- كل جبل ساترة (خلايا لأسفل) على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام Vectashield المتوسطة المتزايدة التي تحتوي على دابي (4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد).
- يمسح الزائدة المتوسطة المتزايدة من مختلف أنحاء ساترة باستخدام منشفة ورقية ، واحتضان الشريحة على 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة بعيدا عن الضوء.
- إصلاح ساترة إلى الشريحة الزجاجية باستخدام طلاء الأظافر واضحة الاكريليك.
- يبقي بعيدا عن الضوء الشرائح قبل التصور بواسطة المجهر مضان.
رابعا. ممثل النتائج
الشكل 2. تم إصلاح تجزئة التحت خلوية من الخلايا COS - 7 غير transfected. مجزأ كوس - 7 مع الخلايا باستخدام الفورمالدهيد وimmunostained α - تويولين ، H1 - α هيستون أو α امين - A / C الأضداد مترافق لTRITC تلتها المعاملة مع تصاعد المتوسط تحتوي على دابي . تم الحصول على الصور مع عدسة العين عدسة 63x 10x والهدف باستخدام المجهر مبائر ايكا. وكانت نواة الخلية تصور باستخدام مجموعة تصفية دابي بينما في نفس المجال الخلايا ملطخة الأضداد علامة وتصور باستخدام مجموعة TRITC التصفية.
الشكل 3. ويرتبط البروتين GFP - 6E2 الانصهار مع مصفوفة النووية. التحت خلوية من الخلايا تجزيء - 7 كوس تعبر عن انصهار بروتين تتكون من بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تنصهر لفيروس الورم الحليمي البشري (HPV) نوع 6E2 البروتين (GFP - 6E2). وكانت نواة الخلية عبر تصور تلطيخ دابي بينما توطين GFP - 6E2 في الخلايا transfected كان تصور مباشرة عن طريق مضان GFP. وكان امين A / C - α تصور به لامين A / C مترافق الأجسام المضادة لTRITC ومجموعة TRITC التصفية. دمج الصور تكشف عن أن يرتبط بعض من البروتين GFP - 6E2 مع مصفوفة النووية (اللوحة السفلية اليمنى). تم الحصول على الصور كما هو موضح في الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مشترك المشاكل والاقتراحات :
وفقدت كل أو معظم الخلايا أثناء الغسل. ويجب غسل خلال الخطوات تضاف السوائل ببطء الى جانب لوحة 6 - جيدا تجنب ساترة. وبالمثل ، ينبغي إزالة السوائل من خلال إمالة لوحة pipetting بعناية وببطء قبالة السوائل الزائدة. ويمكن زيادة التصاق الخلية باستخدام بولي - L - يسين coverslips المغلفة.
ليس الدنا الجينومي هضمها تماما. بالنسبة لبعض أنواع الخلايا قد هضم أنا الدناز الخطوة تحتاج إلى تمديد و / أو زيادة تركيز أنا الدناز من أجل تحقيق الإزالة الكاملة من الحمض النووي الجيني.
تثبيت القطع والتجزيء. ومن المهم أن نلاحظ أن بعض البروتينات يمكن relocalize أثناء التثبيت أو تجزيء 6. البروتينات يمكن أن أفرج عنه من اضطراب نواة التالية من الغشاء النووي على سبيل المثال ربط المواقع التي لولاها يكون موجودا في المقصورات يفصل جيدا. ويمكن تقليل هذه الآثار عن طريق مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام وسائل التثبيت مختلفة على سبيل المثال باستخدام بارافورمالدهيد بدلا من الفورمالديهايد. يمكن أن يعيش التصوير الخلية يكون من المفيد أيضا للخلايا كله لا يقل عن 3.
تناسب هذه التقنية في الكشف عن البروتينات الانصهار GFP. ومع ذلك ، فمن المهم التأكيد على أن هذا البروتين الانصهار يتصرف بطريقة مشابهة للبروتين معلم. من المهم أيضا أن تؤكد من خلال المعايرة التي أعربت عن البروتينات في مستويات مماثلة منذ أكثر من التعبير عن البروتين يمكن أن يغير جذريا من الباطن توطين الخلوية.
تطبيقات هذه التقنية :
هذا الأسلوب غير مستغلة يسمح تحديد بروتين التعريب مع الإشارة إلى علامات جيدة تتميز المجالات التحت خلوية مختلفة أو هياكل والتطبيقات عبر العديد من مجالات بيولوجيا الخلية. على سبيل المثال ، عرض العديد من عوامل النسخ توزيع معقدة مع التعريب إلى السيتوبلازم ، nucleoplasm عقد فضفاضة ، لونين و / أو النووية مصفوفة 1،2،4. يمكن التوطين في كل من هذه المجالات تؤثر على وظيفة البروتين وكذلك دوران البروتين والتعديلات اللاحقة لمتعدية.
البروتين يمكن أن يشترك في الترجمة إلى مجالات محددة مثل المصفوفة النووية توفر نظرة ثاقبة وظيفة البروتين. ويمكن إعادة توطين البروتين استجابة لإشارات محددة و / أو التعبير عن البروتينات شريك أيضا تسليط الضوء على 1،4 وظيفة البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai وNazefah عبد الحميد ممتنون للحكومة التايلاندية الملكية وحكومة ماليزيا على التوالي للحصول على الدكتوراه المنح الدراسية. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة ويلكوم ترست منحت لمشروع PSJ والروضة. ونحن ممتنون أيضا لجامعة بريستول مرفق Bioimaging ولفسون.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
