Summary
וידאו זה מדגים את הטכניקה להפקת DNA של זנים של חיידקים במעי האחורי תושב טרמיטים. ההכנה של שקופית הר רטוב, אשר הוא שימושי עבור לדמיין את הקהילה חיידקים במעיים מודגם גם, סיור דרך הסביבה, מינים עשיר הבטן הוא נתון.
Abstract
הטרמיטים הם בין החיות כמה שידוע יש את היכולת להתקיים אך ורק על ידי עץ רב. בדרכי המעיים טרמיטים מכיל אוכלוסייה צפופה של חיידקים מינים עשיר המסייע השפלה של lignocellulose בעיקר לתוך אצטט, מרכיב מפתח תדלוק מטבוליזם טרמיטים (Odelson & Breznak, 1983). בתוך אלה אוכלוסיות חיידקים הם חיידקים קדומים methanogenic, ובחלק ("נמוך") טרמיטים, אוקריוטים פרוטוזואה. לפיכך, טרמיטים הם נושאי מחקר מעולה לחקר יחסי הגומלין בין מינים של חיידקים ושל פונקציות ביוכימיים רבים שהם מבצעים לטובת המארחות. הרכב זנים של אוכלוסיות חיידקים במעיים טרמיטים וכן הגנים המרכזיים המעורבים בתהליכים ביוכימיים שונים נחקר תוך שימוש בטכניקות מולקולריות (Kudo et al, 1998;. Schmit-וגנר et al, 2003;. Salmassi & לידבטר, 2003). טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (מור et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).
Protocol
סיכום פרוצדורלי להפקת שלם במעי טרמיטים DNA:
- טרמיטים צ'יל על הקרח, להסיר במעיים באמצעות פינצטה סטרילי ולייצב דגימות המעיים במאגר.
- Homogenize דגימות PVPP / SDS / חיץ פנול.
- תמצית ולטהר דנ"א lysate גולמי באמצעות Qiagen עמודות DNeasy.
פרוטוקול:
- על קרח, להסיר את האומץ של כת טרמיטים עובד באמצעות מלקחיים סטרילית.
- מיד להעביר את אומץ התכנים צינור סטרילי nuclease חינם, המכיל 50 μL קר כקרח 1x ביולוגיה מולקולרית כיתה TE חיץ (1 mM טריס-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). להקפיא דגימות -20 ° C, או להמשיך ישירות עם homogenization.
- העברת דגימות המעי חיץ צינור סטרילי, nuclease ללא מ"ל 2 בורג כתרים טעון מראש עם 500 מ"ג של zirconia / סיליקה חרוזים סטרילית (0.1 מ"מ) ו - 700 μl של חיץ TE 1x המכיל 1% w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
- הוסף 50 μl של סולפט 20% נתרן dodecyl (SDS) ו - 500 μl של פנול על דגימות.
- Homogenize (פעימה חרוז) על הגדרת הגבוהה ביותר באמצעות שלושה מחזורים של 30 שניות homogenization ו 30 שניות של מצמרר על הקרח.
- משקעים חומר מסיס 1 דקות ב 8000 x גרם.
- לטהר 300 μl aliquots של השכבה (העליון) מימית עם עמודות Qiagen DNeasy בשיטה המתוארת לטיהור lysate גולמי.
- לכמת תוכן חומצות גרעין דגימות להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מניסיוננו, DNA המופק הקהילות מיקרוביאלי של עץ האכלה מינים טרמיטים כמו nevadensis Zootermopis טהור מספיק עבור תבנית PCR לאחר סבב אחד של מיצוי וטיהור. עם זאת, כמה טרמיטים כגון האכלה, המלטה ואדמה האכלה המינים יכולה להיות ריכוז גבוה של חומצות humic של תוכן המעיים שלהם והן עשויות לחייב טיהור נוסף של ה-DNA של חיידקים במעיים. התשואה DNA הכולל את הקרביים של 5 עובדים צ'nevadensis הוא בטווח של 10-30 מיקרוגרם. עבור מינים טרמיטים משמעותית קטן או גדול יותר ממין זה, דגימות יותר או פחות עשוי להיות נחוץ כדי להשיג סכום דומה של ה-DNA.
שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאם כדי לאפשר מיצוי RNA. להפקת RNA, תחליף 1x חיידקים מגיב RNAprotect מ Qiagen (קטלוג מוצרים לא. 76,506) עבור למאגר TE קר כקרח המתואר בשלב 2 של הפרוטוקול. Qiagen ריאגנטים RNeasy ועמודות (קטלוג מוצרים לא. 74,104) יש להשתמש במקום הליך הטיהור DNeasy שתוארו לעיל. כמו DNA יכול להיות מטוהרים מן RNAprotect מיוצב דגימות רק 300 μL של כ. 700 שכבה מימית μL לאחזר בשלב 7 נדרשת עבור טיהור חומצות גרעין, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לאחזר הן DNA ו-RNA במקביל ממדגם אחד.
טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (יותר et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
