Summary
Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.
Abstract
Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson & Breznak, 1983). All'interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni ("inferiore") termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall'ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
Protocol
Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA:
- Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer.
- Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo.
- Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy.
Protocollo:
- Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta lavoratore con pinza sterile.
- Trasferire immediatamente il coraggio e contenuto in una sterile, priva di nucleasi tubo contenente 50 microlitri gelida 1x biologia molecolare grado di buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelare i campioni a -20 ° C, o procedere direttamente con omogeneizzazione.
- Trasferire i campioni di intestino e ad un tampone sterile, priva di nucleasi 2 tubi ml con tappo a vite pre-caricato con 500 mg di sterili zirconia / perle di silice (0,1 mm) e 700 ml di tampone 1x TE contenente 1% w / v polivinilpolipirrolidone (PVPP ).
- Aggiungere 50 ml di solfato di sodio al 20% dodecil (SDS) e 500 ml di fenolo ai campioni.
- Omogeneizzare (battito tallone) sul più alto impostazione con tre cicli di 30 omogeneizzazione sec e 30 sec di raffreddamento sul ghiaccio.
- Sedimento materiale insolubile per 1 min a 8.000 x g.
- Purificare 300-microlitri aliquote del acquosa (superiore) strato con colonne Qiagen DNeasy con il metodo descritto per la purificazione lisato grezzo.
- Quantificare contenuto degli acidi nucleici e congelare i campioni a -20 ° C per un uso successivo.
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Discussion
Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. Per le specie di termiti significativamente più piccola o più grande di questa specie, i campioni più o meno può essere necessario per ottenere una quantità analoga di DNA.
Questo metodo può essere facilmente adattato per consentire l'estrazione di RNA. Per l'estrazione di RNA, sostituire 1x reagente RNAprotect Batteri da Qiagen (catlog no. 76.506) per la gelida tampone TE descritto al punto 2 del protocollo. Qiagen RNeasy reagenti e le colonne (catlog no. 74.104) deve essere utilizzato in luogo della procedura di purificazione DNeasy descritto sopra. Come il DNA può essere purificato da RNAprotect stabilizzato campioni e solo 300 ml di ca. 700 microlitri strato acquoso recuperato nel passaggio 7 è necessario per la purificazione degli acidi nucleici, questo metodo può essere utilizzato per recuperare sia il DNA e RNA in parallelo da un singolo campione.
Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall'ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Moré et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
