Summary
이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.
Abstract
Photoconvertible 형광 단백질 (PC - 프레임)는 형광의 색깔이 특정 파장의 빛에 노출에 의해 변경될 수있다는 것을 의미한다 "광학 형광펜"기능이있는 형광 단백질의 클래스입니다. 광학 강조는 비침 투 형광 분자의 subpopulation의 마킹 수 있으며, 따라서 하나의 셀 또는 organelles를 추적하기위한 이상적입니다.
효율적인 photoconversion에 대한 중요 매개 변수는 강도와 photoconversion의 빛의 노출 시간입니다. 강도가 너무 낮으면 photoconversion 전혀 발생 느리거나되지 않습니다. 반면에, 너무 강렬하거나 너무 오래 노출이 단백질을 photobleach시키고 photoconversion의 효율성을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜은 방법 PC - FP의 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 정제된 단백질 비말 샘플 준비를위한 절차를 설명합니다. 이 예제 형식은 현미경으로 형광 단백질의 photophysical 동작을 공부 매우 편리합니다. 둘째, 우리는 photoconversion에 대한 현미경을 구성하는 방법을 보여 단백질 비말 샘플을 사용합니다. 그리고 마지막으로, 우리는 mOrange2과 Dronpa와 함께 듀얼 프로브 광 하이라이트를 포함하여 살고 세포에 광학 하이라이트를 수행하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 형광 단백질 비말 샘플 준비
형광 단백질 비말 샘플은 물에 단계에 거주하는 형광 단백질과 1-octanol/water의 에멀젼으로 구성되어 있습니다. 이 유제는 현미경의 응용 프로그램에 대한 현미경 슬라이드와 22mm 광장 커버 유리 사이에 끼워 넣으면됩니다.
- 형광 단백질 비말 샘플을하기 전에 현미경 슬라이드와 커버 안경은 소수성 요원과 함께 세척 및 코팅해야합니다.
- 아세톤 5 분 세탁하여 유리를 청소하고 공기에 의해 건조에 둡니다. (선택, 유리 청소 후 최적의 코팅 결과를 얻기 위해 플라즈마 클리너에서 30 초 동안 처리 수 있습니다.)
- 이 솔루션에서 2 분 동안 배양 아세톤 및 코팅 유리의 2 % methyltrimethoxysilane 솔루션을 준비합니다. 코팅 후 용액에서 유리를 제거하고 공기에 의해 건조에 둡니다. 그런 다음 스프레이 용기에서 70 % 에탄올로 씻어 다시 건조에 둡니다. (선택,이 시점에서 유리는 ° C가 covalently 유리에 코팅을 연결하는 80에서 1 시간 동안 구운 수 있습니다.) 코팅 유리는 적어도 한 달 동안 저장할 수 있습니다.
- 형광 단백질은 E.에서 그의 6 태그 단백질로 정화 아르 대장균 1. 정화 단백질의 흡광도 스펙트럼을 측정하고 인트 버퍼 (150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL 산도 8, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 ~ 0.1의 광학 밀도 주식 희석을 준비, 0.1 % 소 혈청 알부민을 포함 (BSA) . 또한 15 ML 원뿔 관 1 - octanol과 인트 버퍼의 1:1 혼합물 10 ML을 준비하고 적극적으로 섞는다. 혼합 휴가 후 상 분리가 완료될 때까지. 상단 단계 1 - octanol입니다. (주의 : 1 - octanol이 강한 냄새를 가지고 있기 때문에 그것은 1 - octanol과 접촉 제공 모든 폐쇄 폐기물 컨테이너를 사용하는 것이 중요합니다.)
- 유제 피펫 45 μl 1 - octanol과 microfuge 튜브 5 μl 형광 단백질을 만들 수 있습니다. 유제의 형성을 시작하고 다음 sonication 욕조에서 30 초 동안 튜브를 sonicate하여 손가락으로 튜브를 몇 번 누릅니다. 에서는 한편 코팅 현미경 슬라이드를 유리 준비 커버. sonication 후 유제 완전히 뿌연해야합니다. 즉시 코팅 현미경 슬라이드에 튜브의 중간에서 sonication 피펫 4 μl 유제 후 코팅 커버 유리 커버.
- 절차가 완료되면 제대로 유제는 현미경 슬라이드 및 개체 유리 사이에 균등하게 분산합니다. 분 이내에 샘플 직경 변화와 함께 ~ 10 μm의 두께의 형광 방울을 구성, 안정되어야합니다. 가장 큰 방울은 샘플의 중심 가까이에 있으며 작은가 가장자리쪽으로 더 있습니다.
2. photoconversion 실험 설정
다음 절차는 형광 단백질 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 전략이다. 이 절차는 라이브 세포뿐만 아니라 단백질 투석을 위해 적용할 수 있습니다.
- 다음 매개 변수는 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 출발점을 제공합니다 :
40x 1.3NA 기름 침지 목표
이미지 크기 = 512 X 512 픽셀
스캔 확대 = 4
픽셀 시간 = 6 μsec 살기.
Z - 해상도 (핀홀 크기) = 3 μm의 - 이 초기와 photoconverted 형광에 대한 검색 채널뿐만 아니라 "photoconversion 채널"을 구성합니다. 이 예제에서 우리는 오렌지로 붉은 photoconvertible 형광 단백질이다 mOrange2 단백질을 정화 사용합니다. 오렌지 수종은 561 나노미터 여기와 형광이 570 nm의와 630 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. photoconverted 적색 종은 633 나노미터 여기와 형광이 640 nm의와 700 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. "photoconversion 채널"은 488 나노미터 여기를 선택하고 490 nm의와 540 nm의 형광 사이에 수집하십시오. (참고 :. 이미징 photoconversion 채널 엄격하게 필요하지 않습니다)
- 이미징 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정하기 위해 지속적인 검사와 함께 초기 형광을위한 채널을 사용합니다.
- photoconversion 채널을 활성화하고 낮은 레이저 파워를 선택합니다. 이미지에게 시간 저속 시리즈를 시작하고 초기 형광 표백 중요한이 관찰 때까지 점차 photoconversion 레이저를 높일 수 있습니다. 초기 형광 약 75% 표백 때까지 스캔을 계속합니다.
- photoconversion 채널을 비활성화하고 photoconverted 형광에 대한 검색 채널을 활성화합니다. 높은 검출기 이득과 낮은 레이저 파워 이미징을 시작하고 photoconverted 형광이 발견 될 때까지 점차적으로 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다. 일단 당신이 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정할 수 있습니다 photoconverted 형광을 감지.
- 마지막으로 레이저 전원 사용photoconversion뿐만 아니라에 대한 photoconversion의 기간은 최적화해야합니다. photoconversion 레이저 전원을 늘리면, photoconversion의 속도를 가속 것입니다 그러나 너무 많은 레이저의 파워는 단백질 photobleach 것입니다.
- 최적의 photoconversion 레이저 파워와 기간이 결정되고 나면,이 매개 변수는 표준 photobleaching 또는 FRAP 모듈과 "photoconversion 채널"더 이상 필요하지 않습니다를 구성하는 데 사용할 수 있습니다.
3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광 하이라이트
때문에 붉은 이동 스펙트럼 특성, mOrange2 4 각 셀 (organelle) 인구의 선택적 하이라이트 수 있도록 듀얼 프로브 광학 하이라이트를 위해 녹색 형광 단백질 photoswitchable Dronpa와 함께 사용할 수 있습니다.
- 전지는 유리 바닥 MatTek 요리 재배 및 사전 표준 Lipofectamine2000 transfection 1을 사용 영상 24 시간 transfected 있습니다.
- 로 제 2의 설명에 mOrange2 photoconversion에 대한 현미경을 설정합니다.
- Dronpa의 photoswitching에 대한 현미경을 구성합니다. Dronpa 형광은 mOrange2 "photoconversion 채널"(단계 2.2 참조)를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. (참고 : 이미지 Dronpa에 사용되는 레이저 전원을 최소화, 너무 많은 레이저 전원이 Dronpa의 불활 성화를 일으킬 수 있기 때문에.) Dronpa의 photoactivation에 대한 채널을 추가합니다. 우리는 photoactivation 두 - 광자 여기 800 나노미터를 사용하지만, 또한 이것은 405 나노미터 여기를 사용하여 얻을 수 있습니다. 레이저 이미징에 필요한 전력, photoactivation 및 Dronpa 형광 photoinactivation를 결정합니다.
- 주의 : mOrange2의 Photoconversion 및 Dronpa의 불활 성화 모두 488 나노미터 여기에 발생합니다. 때문에 mOrange2 photoconversion에 필요한 높은 레이저 전원 이것은 또한 Dronpa 형광을 inactivate 것입니다. 한편, Dronpa의 불활 성화는 훨씬 낮은 레이저 파워에서 이미 발생하고 상당한 mOrange2 photoconversion없이 수행할 수 있습니다.
- mOrange2의 photoconversion 및 Dronpa의 photoswitching에 대한 매개 변수가 설정되면, 듀얼 프로브 광학 하이라이트는 다음 단계를 통해 이루어진다. 첫째, 낮은 전력 488 나노미터 여기로보기의 전체 분야에서 Dronpa 형광을 inactivate. 둘째, 관심과 높은 전력 488 나노미터 여기로 photoconvert의 mOrange2의 영역을 선택합니다. 마지막으로, Dronpa 형광을 활성화하기 위해 관심 영역을 선택합니다.
4. 대표 결과
그림 1. 비말 샘플 준비.) 제대로 준비 비말 샘플. B) 샘플 코팅 현미경 슬라이드와 커버 유리없이 준비했습니다. C) 샘플 0.1 % BSA를 추가하지 않고 준비.
그림 2. mOrange2 단백질을 포함하는 mOrange2 photoconversion에 photoconversion 레이저 파워와 기간의 효력. 싱글 방울이 지속적으로 488 NM 레이저 파워의 다른 양의 사용 photoconverted되었습니다. photoconversion에 사용된 상대 레이저의 파워는 10 % (고체), 25 % (점선), 그리고 100 % (점선)되었습니다. A) 오렌지 형광 종. B) Photoconverted 적색 형광 종.
그림 3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광학 강조. mitochondria에있는 핵 및 녹색 형광의 오렌지 형광을 보여주는 photoconversion 전에 mOrange2 - 히스톤 H2B 및 Dronpa - 미토을 표현) 세포. B) Dronpa 형광은 mOrange2의 최소한 photoconversion가 발생, 낮은 전력 488 나노미터 여기로 잠수를 탔다. C) mOrange2은 높은 전력 488 나노미터 여기로 적색으로 photoconverted되었습니다. D) Dronpa 형광 다시 800 nm의 2 광자 여기을 사용하여 전환되었습니다. 패널 차등 간섭 대비 이미지와 함께 형광 이미지를 오버레이합니다.
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Discussion
정화 형광 단백질 비말 샘플 속도론 및 photoconversion의 속도론을 photobleaching 공부 예를 들어, 형광 단백질의 특성에 대한 photophysical 매우 편리한 샘플 형식입니다. 매우 작은 비말 볼륨 (~ 20 picoliter) photobleaching과 쿠베트 기반 시스템에서 수행하기 어려울 수 있습니다 photoconversion 실험, 용이하게합니다. 또한, 같은 비말 샘플이 이상적으로 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 현미경을 설정하는 데 적합합니다 여기에 표시됩니다. 소수성 코팅 및 BSA의 존재는 단일 방울을 얻기 위해 중요합니다. 코팅하지 않고 방울은 유리 표면 중 하나에 대한 숙청 되야하는 경향과 BSA의 부재에있는 형광 단백질은 형광의 후광 (그림 1)를 작성, 1-octanol/water 인터페이스에 축적하는 경향이있다.
형광 단백질 photoconversion들은 종종 하나도 photoconverted 종이를 따르십시오 수있는 장점과 함께, photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)의 대안으로 간주된다. 그러나, 그 photoconversion 사용된 레이저 전원을 매우 의존 고려하는 것이 중요합니다. 너무 photoconversion 레이저 전원 또는 너무 오래 노출함으로써 photoconverted 형광 반응의 양 (그림 2)를 감소 않고 photoconversion보다 photobleaching하게됩니다.
mOrange2과 photoconverted 종의 붉은 이동 스펙트럼 특성은 녹색 형광 광 형광펜과 듀얼 프로브 광 하이라이트을 허용합니다. 이것도 여기에 시연 photoswitchable 형광 단백질 (Dronpa), 또는 예를 들어 PA - GFP를위한 양자 택일 photoactivatable 형광 단백질 수 있습니다. Dronpa 하나가 실험의 시작 부분에서 그 존재를 확인할 수있는 장점이 있습니다. 반면에, Dronpa의 사용은 모든 Dronpa 형광 먼저 inactivated 수 있기 때문에, 광학 하이라이트를 복잡하게하고, Dronpa 형광이 점차적으로 이미징하는 동안 꺼져있다는 사실. 이러한 합병증은 PA - GFP를 사용할 때 덜 심오하지만, photoactivation 이전 PA - GFP의 존재를 확인하는 것이 더 어려울 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 DNA를 제공하는 마이크 W. 데이비슨 (플로리다 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 건강 부여 GM72048 (전자 파동 탐색)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microsope slides | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| methyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
