이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Photoconvertible 형광 단백질 (PC - 프레임)는 형광의 색깔이 특정 파장의 빛에 노출에 의해 변경될 수있다는 것을 의미한다 "광학 형광펜"기능이있는 형광 단백질의 클래스입니다. 광학 강조는 비침 투 형광 분자의 subpopulation의 마킹 수 있으며, 따라서 하나의 셀 또는 organelles를 추적하기위한 이상적입니다.
효율적인 photoconversion에 대한 중요 매개 변수는 강도와 photoconversion의 빛의 노출 시간입니다. 강도가 너무 낮으면 photoconversion 전혀 발생 느리거나되지 않습니다. 반면에, 너무 강렬하거나 너무 오래 노출이 단백질을 photobleach시키고 photoconversion의 효율성을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜은 방법 PC - FP의 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 정제된 단백질 비말 샘플 준비를위한 절차를 설명합니다. 이 예제 형식은 현미경으로 형광 단백질의 photophysical 동작을 공부 매우 편리합니다. 둘째, 우리는 photoconversion에 대한 현미경을 구성하는 방법을 보여 단백질 비말 샘플을 사용합니다. 그리고 마지막으로, 우리는 mOrange2과 Dronpa와 함께 듀얼 프로브 광 하이라이트를 포함하여 살고 세포에 광학 하이라이트를 수행하는 방법을 보여줍니다.
프로토콜
1. 형광 단백질 비말 샘플 준비
형광 단백질 비말 샘플은 물에 단계에 거주하는 형광 단백질과 1-octanol/water의 에멀젼으로 구성되어 있습니다. 이 유제는 현미경의 응용 프로그램에 대한 현미경 슬라이드와 22mm 광장 커버 유리 사이에 끼워 넣으면됩니다.
- 형광 단백질 비말 샘플을하기 전에 현미경 슬라이드와 커버 안경은 소수성 요원과 함께 세척 및 코팅해야합니다.
- 아세톤 5 분 세탁하여 유리를 청소하고 공기에 의해 건조에 둡니다. (선택, 유리 청소 후 최적의 코팅 결과를 얻기 위해 플라즈마 클리너에서 30 초 동안 처리 수 있습니다.)
- 이 솔루션에서 2 분 동안 배양 아세톤 및 코팅 유리의 2 % methyltrimethoxysilane 솔루션을 준비합니다. 코팅 후 용액에서 유리를 제거하고 공기에 의해 건조에 둡니다. 그런 다음 스프레이 용기에서 70 % 에탄올로 씻어 다시 건조에 둡니다. (선택,이 시점에서 유리는 ° C가 covalently 유리에 코팅을 연결하는 80에서 1 시간 동안 구운 수 있습니다.) 코팅 유리는 적어도 한 달 동안 저장할 수 있습니다.
- 형광 단백질은 E.에서 그의 6 태그 단백질로 정화 아르....
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토론
정화 형광 단백질 비말 샘플 속도론 및 photoconversion의 속도론을 photobleaching 공부 예를 들어, 형광 단백질의 특성에 대한 photophysical 매우 편리한 샘플 형식입니다. 매우 작은 비말 볼륨 (~ 20 picoliter) photobleaching과 쿠베트 기반 시스템에서 수행하기 어려울 수 있습니다 photoconversion 실험, 용이하게합니다. 또한, 같은 비말 샘플이 이상적으로 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 현미경을 설정하는 데 적합합니다 여기에 표시됩니다. 소수성 코팅 및 BSA의 존재는 단일 방울을 얻기 위해 중요합니다. 코팅하지 않고 방울은 유리 표면 중 하나에 대한 숙청 되야하는 경향과 BSA의 부재에있는 형광 단백질은 형광의 후광 (그림 1)를 작성, 1-octanol/water 인터페이스에 축적하는 경향이있다.
형광 단백질 photoconversion들은 종종 하나도 photoconverted 종.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 DNA를 제공하는 마이크 W. 데이비슨 (플로리다 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 건강 부여 GM72048 (전자 파동 탐색)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 현미경 슬라이드 | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm 커버 글라스 | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| methyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek 디쉬 | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
참고문헌
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
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재인쇄 및 허가
