Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.
Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.
Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de …
Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder NS27501 DKOD. Suporte adicional para este trabalho foi fornecida por uma concessão para a UC Irvine em apoio DKOD através do Programa Professor HHMI.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Concanavalin A | Sigma | C-2010 | To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
Laminin | Sigma | L-2020 | Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
Coverslips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month. | |||
Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
Solution B: HEPES | Buffer | Sigma | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C. |
Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C. |