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Cancer Research

कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65186
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,2
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

Summary

यह प्रोटोकॉल ट्यूमरोजेनिक प्रक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में निलंबन-बढ़ती कैंसर कोशिकाओं से साइब्रिड पीढ़ी के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

हाल के वर्षों में, माइटोकॉन्ड्रिया और कैंसर के बीच संबंध का पता लगाने के लिए समर्पित अध्ययनों की संख्या में काफी वृद्धि हुई है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया और ट्यूमरजेनिसिस में परिवर्तन से जुड़े लिंक को पूरी तरह से समझने के साथ-साथ ट्यूमर से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल फेनोटाइप की पहचान करने के लिए अभी भी अधिक प्रयासों की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमरजेनिसिस और मेटास्टेसिस प्रक्रियाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न परमाणु वातावरण में ट्यूमर कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभाव को समझना आवश्यक है। इस उद्देश्य के लिए, एक संभावित दृष्टिकोण में तथाकथित साइब्रिड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को एक अलग परमाणु पृष्ठभूमि में स्थानांतरित करना शामिल है। पारंपरिक साइब्रिडाइजेशन तकनीकों में, एमटीडीएनए की कमी वाली एक सेल लाइन (0, परमाणु दाता सेल) को या तो एन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं या प्लेटलेट्स से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ फिर से आबाद किया जाता है। हालांकि, न्यूक्लियेशन प्रक्रिया को कल्चर प्लेट में अच्छे सेल आसंजन की आवश्यकता होती है, एक विशेषता जो आक्रामक कोशिकाओं में कई मामलों में आंशिक रूप से या पूरी तरह से खो जाती है। इसके अलावा, पारंपरिक तरीकों में पाई जाने वाली एक और कठिनाई शुद्ध परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल-प्राप्तकर्ता सेल लाइन से अंतर्जात एमटीडीएनए को पूरी तरह से हटाने को प्राप्त कर रही है, जिससे उत्पन्न साइब्रिड में दो अलग-अलग एमटीडीएनए प्रजातियों की उपस्थिति से बचा जा सकता है। इस काम में, हम एक माइटोकॉन्ड्रियल एक्सचेंज प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ रोडामाइन 6 जी-प्रीट्रीटेड कोशिकाओं के पुनर्जनन के आधार पर निलंबन-बढ़ती कैंसर कोशिकाओं पर लागू होता है। यह पद्धति हमें पारंपरिक दृष्टिकोणों की सीमाओं को दूर करने की अनुमति देती है, और इस प्रकार कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस में माइटोकॉन्ड्रियल भूमिका की समझ का विस्तार करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

ऊर्जा चयापचय को पुन: प्रोग्राम करना कैंसर1 की एक पहचान है जिसे 1930के दशक में ओटो वारबर्ग द्वारा पहली बार देखा गया था। एरोबिक परिस्थितियों में, सामान्य कोशिकाएं ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित करती हैं, जो तब एसिटाइल-सीओए उत्पन्न करती हैं, माइटोकॉन्ड्रियल मशीनरी को ईंधन देती हैं और सेलुलर श्वसन को बढ़ावा देती हैं। फिर भी, वारबर्ग ने प्रदर्शित किया कि, नॉर्मोक्सिक स्थितियों के तहत भी, अधिकांश कैंसर कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस प्रक्रिया से प्राप्त पाइरूवेट को लैक्टेट में परिवर्तित करती हैं, ऊर्जा प्राप्त करने के लिए अपना रास्ता बदलती हैं। इस चयापचय समायोजन को "वारबर्ग प्रभाव" के रूप में जाना जाता है और कुछ कैंसर कोशिकाओं को एरोबिक प्रक्रिया 3,4,5 की तुलना में एटीपी कम कुशलता से उत्पन्न करने के बावजूद, तेजी से विकास और विभाजन के लिए अपनी ऊर्जावान मांगों की आपूर्ति करने में सक्षम बनाता है। हाल के दशकों में, कई कार्यों ने कैंसर की प्रगति में चयापचय रीप्रोग्रामिंग के निहितार्थ का समर्थन किया है। इसलिए, ट्यूमर ऊर्जावान को कैंसर1 के खिलाफ एक दिलचस्प लक्ष्य माना जाता है। ऊर्जावान चयापचय में और आवश्यक अग्रदूतों की आपूर्ति में एक केंद्रीय केंद्र के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया इन सेल अनुकूलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो आज तक, हम केवल आंशिक रूप से समझते हैं।

उपरोक्त के अनुरूप, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) उत्परिवर्तन को इस चयापचय रीप्रोग्रामिंग के संभावित कारणों में से एक के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिससे बिगड़ा हुआ इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) प्रदर्शन6 हो सकता है और यह बताएगा कि कुछ कैंसर कोशिकाएं जीवित रहने के लिए अपने ग्लाइकोलाइटिक चयापचय को क्यों बढ़ाती हैं। दरअसल, यह बताया गया है कि एमटीडीएनए कैंसर कोशिकाओं के भीतर उत्परिवर्तन जमा करता है, कम से कम 50% ट्यूमर7 में मौजूद होता है। उदाहरण के लिए, युआन एट अल द्वारा किए गए एक हालिया अध्ययन ने गुर्दे, कोलोरेक्टल और थायराइड कैंसर में हाइपरम्यूटेड और कटे हुए एमटीडीएनए अणुओं कीउपस्थिति की सूचना दी। इसके अलावा, कई कार्यों से पता चला है कि कुछ एमटीडीएनए उत्परिवर्तन अधिक आक्रामक ट्यूमर फेनोटाइप से जुड़े हैं और कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता में वृद्धि के साथ 9,10,11,12,13,14,15,16 हैं।

कैंसर की प्रगति में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की स्पष्ट प्रासंगिकता के बावजूद, इन उत्परिवर्तनों का अध्ययन और रोग में उनका योगदान वर्तमानमें उपलब्ध प्रयोगात्मक मॉडल और प्रौद्योगिकियों में सीमाओं के कारण चुनौतीपूर्ण रहा है। इस प्रकार, कैंसर रोग के विकास और प्रगति में माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए के वास्तविक प्रभाव को समझने के लिए नई तकनीकों की आवश्यकता है। इस काम में, हम निलंबन-बढ़ते कैंसर कोशिकाओं से ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ रोडामाइन 6 जी-प्रीट्रीटेड कोशिकाओं की पुनरावृत्ति पर आधारित है, जो पारंपरिक साइब्रिडाइजेशन विधियों18,19 की मुख्य चुनौतियों को दूर करता है। यह पद्धति किसी भी नाभिक दाता के उपयोग की अनुमति देती है, भले ही उनकी संबंधित 0 सेल लाइन की उपलब्धता और कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया का हस्तांतरण हो, जो पारंपरिक तकनीकों का पालन करते हुए, एन्यूक्लियेट करना मुश्किल होगा (यानी, गैर-अनुयायीसेल लाइनें)।

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Protocol

नोट: सभी संस्कृति मीडिया और बफर रचनाएँ तालिका 1 में निर्दिष्ट हैं। साइब्रिड पीढ़ी से पहले, दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डीएनए प्रोफाइल दोनों को सेल लाइनों के बीच दोनों जीनोम में आनुवंशिक अंतर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए टाइप किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल 9 2 9 सेल लाइन और इसकी व्युत्पन्न सेल लाइन, एल 9 2 9 डीटी, जो हमारी प्रयोगशाला में अनायास उत्पन्न हुई थी (अधिक जानकारी के लिए13 देखें) का उपयोग किया गया था। ये सेल लाइनें अपने एमटी-एनडी 2 जीन के अनुक्रम में दो अंतर प्रस्तुत करती हैं जिनका उपयोग एमटीडीएनए की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकताहै। इस मामले में, परमाणु पृष्ठभूमि की शुद्धता की पुष्टि एंटीबायोटिक संवेदनशीलता द्वारा की गई थी, क्योंकि, एल 9 2 9 डीटी कोशिकाओं के विपरीत, एल 9 2 9 जेनेटिन के लिए प्रतिरोधी थे।

1. रोडामाइन 6 जी उपचार (प्राप्तकर्ता कोशिकाओं) द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल की कमी।

नोट: सफल साइब्रिड पीढ़ी के लिए पहला कदम प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को पूरी तरह से और अपरिवर्तनीय रूप से समाप्त करना है। इस उद्देश्य के लिए, पहले प्रत्येक सेल लाइन के लिए, रोडामाइन 6 जी के साथ उचित एकाग्रता और उपचार अवधि निर्धारित करना आवश्यक है। यह पर्याप्त एकाग्रता दवा-प्रेरित कोशिका मृत्यु के ठीक नीचे होनी चाहिए (उच्चतम जो उपचार के दौरान कोशिकाओं को नहीं मारता है)। इष्टतम स्थितियों को परिभाषित करने के बाद निम्न कार्य करें.

  1. पूर्ण कल्चर माध्यम का उपयोग करके 6-वेल प्लेट में 10 6 कोशिकाओं को बीज दें (विवरण के लिए तालिका 1 देखें) और सेल लाइन के आधार पर 3-10 दिनों के लिए रोडामाइन6 जी की इष्टतम एकाग्रता के साथ दैनिक रूप से उनका इलाज करें। पारंपरिक सांद्रता 3-10 दिनों के लिए 2 से 5 μg / mLतक होती है 20,21। इस अध्ययन में, एल 9 2 9-व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए, 7 दिनों के लिए 2.5 μg / mL रोडामाइन 6 G चयनित उपचार13,22 था।
  2. कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए, सेल कल्चर माध्यम को 50 μg / mL यूरिडाइन और 100 μg / mL पाइरूवेट के साथ पूरक करें और इसे हर 24 घंटे में नवीनीकृत करें।
  3. उपचार के बाद और संलयन से पहले, रोडामाइन 6 जी-उपचारित कोशिकाओं के माध्यम को रोडामाइन 6 जी के बिना सेल कल्चर माध्यम को पूरा करने के लिए बदलें, और उन्हें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 3-4 घंटे के लिए इस माध्यम में छोड़ दें।
    नोट: रोडामाइन 6 जी विषाक्त प्रभाव अपरिवर्तनीय है, और गैर-कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया वाली कोशिकाओं को20 को ठीक नहीं करना चाहिए। इस प्रकार, उपचार के बाद, जिन कोशिकाओं को कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त नहीं होता है, उन्हें यूरिडाइन-पूरक संस्कृति माध्यम में भी मरना चाहिए। इसलिए, कोई परमाणु चयन आवश्यक नहीं होना चाहिए। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया के बिना रोडामाइन 6 जी-उपचारित कोशिकाओं के एक नियंत्रण संलयन की सिफारिश की जाती है।

2. विस्तार और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव (दाता कोशिकाएं)

  1. लगभग 25 x 10 6 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए रोडामाइन6 जी उपचार के समय अंतराल के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया दाता कोशिकाओं का विस्तार करें।
  2. 7 वें दिन, 50 एमएल ट्यूब में तेजी से बढ़ती कोशिकाओं की कटाई करें और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 520 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र करें। कोशिकाओं को ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 3 x धोएं और आरटी पर 5 मिनट के लिए 520 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा उन्हें तलछट करें। अब से, ठंडे अभिकर्मकों का उपयोग करके और बर्फ पर कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ट्यूबों को रखते हुए, 4 डिग्री सेल्सियस पर माइटोकॉन्ड्रियल निष्कर्षण के सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
  3. तीसरे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक वैक्यूम पंप के साथ युग्मित ग्लास पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल पेलेट वॉल्यूम के 7 गुना के बराबर हाइपोटोनिक बफर की मात्रा में पैक की गई कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर, सेल निलंबन को एक होमोजेनाइज़र ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर सूज ने दें।
  4. होमोजिनाइज़र में 8 से 10 स्ट्रोक करके कोशिका झिल्ली को तोड़ें जो 600 आरपीएम पर घूमने वाले मोटर-चालित मूसल के साथ युग्मित होता है।
    नोट: कोशिका झिल्ली विघटन का चरण सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकता है; इस प्रकार, इसे प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  5. एक आइसोटोनिक वातावरण उत्पन्न करने के लिए सेल सस्पेंशन (7 x सेल पेलेट वॉल्यूम) में हाइपरटोनिक बफर की समान मात्रा जोड़ें।
  6. होमोजेनेट को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 एक्स जी पर एक निश्चित रोटर में सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, नाभिक या बरकरार कोशिकाओं के साथ संदूषण से बचने के लिए, गोली से एक बड़ा मार्जिन छोड़ते हुए सतह पर तैरनेवाला का केवल 3/4 इकट्ठा करें, और इसे दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं। ध्यान दें कि सतह पर तैरनेवाला रखा जाना चाहिए और गोली को छोड़ दिया जाना चाहिए।
  7. माइटोकॉन्ड्रियल अंश (सतह पर तैरनेवाला) को बचाएं। इसे 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए अधिकतम गति (18,000 x ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली को बफर ए के साथ धो लें, दो ट्यूबों की सामग्री को एक में मिलाएं और चरण 2.7 में वर्णित समान स्थितियों में सेंट्रीफ्यूजिंग करें। एक ही प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि सभी सामग्री केवल एक ट्यूब में न हो।
  9. 300 μL बफर ए के साथ एक अतिरिक्त धो लें और ब्रैडफोर्ड परख23 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक साइब्रिडाइजेशन परख के लिए, स्थानांतरण प्रक्रिया के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की इष्टतम मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए (हमारे मामले में, प्रति 106 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के 10-40 μg के बीच एकाग्रता)।
  10. इसके साथ ही, रोडामाइन 6 जी-प्रीट्रीटेड कोशिकाओं को संलयन के लिए तैयार करें, उन्हें 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करके और आरटी पर 5 मिनट के लिए 520 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके।
  11. यह सुनिश्चित करने के लिए कि रिसेप्टर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन उन्मूलन के साथ-साथ दाताओं से ऑर्गेनेल शुद्धिकरण दोनों ठीक से किए गए हैं, 6-वेल प्लेट में पूर्ण संस्कृति माध्यम का उपयोग करके रोडामाइन 6 जी-उपचारित कोशिकाओं और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की एक छोटी संख्या को बीज दें और उन्हें एक महीने तक कल्चर करें ताकि यह जांचा जा सके कि कोई जीवित कोशिका किसी भी कुएं में नहीं रहती है (चित्रा 2)।
  12. समानांतर में, परमाणु प्रोटीन (यानी, लैमिन बीटा, हिस्टोन एच 3, आदि) के इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल अंश में नाभिक दूषित पदार्थों की अनुपस्थिति का मूल्यांकन करें या परमाणु जीन के मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) प्रवर्धन (यानी, एसडीएच, 18 एस आरआरएनए, आदि) द्वारा मूल्यांकन करें।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए, एक लामिनर प्रवाह हुड के तहत काम करने वाली सड़न रोकनेवाली स्थितियों में सभी चरणों को करने की सिफारिश की जाती है।

3. संलयन और साइब्रिड पीढ़ी

  1. संलयन के साथ आगे बढ़ने के लिए, सावधानीपूर्वक पृथक माइटोकॉन्ड्रिया गोली (माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के 10-40 μg) में रोडामाइन 6 जी-उपचारित कोशिकाओं के 106 जोड़ें और 5 मिनट के लिए 520 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें ताकि कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रिया के साथ मिश्रण करने की अनुमति मिल सके।
  2. पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी, 50%) के 100 μL जोड़ें और धीरे से 30 सेकंड के लिए गोली को फिर से निलंबित करें। फिर, एक और 30 सेकंड के लिए अछूते रहने दें।
  3. अंत में, मिश्रण को ताजा पूर्ण सेल कल्चर माध्यम के साथ 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। कुछ दिनों (आमतौर पर 1 सप्ताह) के बाद, ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स को बढ़ना शुरू हो जाना चाहिए (चित्रा 2), क्लोन को जन्म देना जो उनके विश्लेषण से पहले व्यक्तिगत रूप से चयनित या पूल में मिश्रित किया जा सकता है।

4. माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु पृष्ठभूमि दोनों का सत्यापन

नोट: एक बार जब नई सेल लाइन स्थापित हो जाती है और कोशिकाएं तेजी से बढ़ने लगती हैं, तो उनके माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डीएनए की शुद्धता को सत्यापित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, मूल सेल लाइनों को उन्हें पहचानने योग्य बनाने के लिए उनके जीनोम के भीतर विभिन्न उत्परिवर्तन या बहुरूपताओं को आश्रय देना चाहिए।

  1. कुल डीएनए अलगाव
    1. वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट ( सामग्री की तालिका देखें) को नियोजित करके या फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोमिल अल्कोहल निष्कर्षण और अल्कोहल वर्षा24 का उपयोग करके एक मानक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करके साइब्रिड पीढ़ी के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सेल लाइनों के जीनोमिक डीएनए को अलग करें।
  2. एमटीडीएनए मूल्यांकन (चित्रा 3)।
    नोट: एमटीडीएनए की शुद्धता का विश्लेषण करने के लिए अनुक्रमण, प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) विश्लेषण, या एलील-विशिष्ट क्यूपीसीआर जैसी कई तकनीकें की जा सकती हैं। आरएफएलपी द्वारा एमटीडीएनए अनुक्रम भिन्नताओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, अगले प्रोटोकॉल चरणों का पालन करें।
    1. पीसीआर द्वारा न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन वाले एमटीडीएनए टुकड़े को बढ़ाएं।
      1. यहां, एल 92 9 डीटी कोशिकाएं एक एमटी-एनडी 2 जीन (एम .4206 सी > टी) के भीतर 4206 स्थान पर एक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन पेश करती हैं जो एल 9 2 9 कोशिकाओं में अनुपस्थित है। ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स में इस प्रतिस्थापन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, एक मानक प्रोटोकॉल और निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा 397 बीपी टुकड़े को बढ़ाएं: 1) 5'-एएजीसीटीएटीसीजीजी।
        सीसीसीएसीसीसीसीसीजी -3 (स्थिति 3862-3884) और 2) 5 '-टीएएटीसीएएसीजीजी -3' (स्थिति 4236-4258)।
    2. आरएफएलपी द्वारा वांछित न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन की उपस्थिति का विश्लेषण करें, एक विशिष्ट एंडोन्यूक्लिज़ का उपयोग करके जो अनुक्रम परिवर्तन को पहचानता है और दोनों सेल लाइनों के लिए एक अलग कट पैटर्न उत्पन्न करता है।
      नोट: जब L929dt mtDNA संस्करण मौजूद है (4206T), चरण 4.2.1 में प्राप्त एम्पलीकॉन में SSPI के लिए दो प्रतिबंध साइटें होती हैं ( सामग्री की तालिका देखें) जो 306 bp, 52 bp और 39 bp के तीन डीएनए टुकड़े उत्पन्न करती हैं। 52 और 39 बैंड उत्पन्न करने वाली प्रतिबंध साइट बाधित हो जाती है जब वाइल्ड-टाइप (WT) संस्करण C4206 मौजूद होता है, और 91 bp का एक नया बैंड प्रकट होता है। इसलिए, एसएसपीआई के लिए पूर्ण पाचन के लिए एक आंतरिक नियंत्रण विश्लेषण में शामिल है। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पाचन प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस पर की जाती है।
    3. वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिबंध टुकड़ों को अलग करें और बैंड पैटर्न की तुलना करें।
      1. एक बार पाचन हो जाने के बाद, 10% पॉलीक्रिलामाइड-ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए (टीबीई) जैल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्राप्त प्रतिबंध टुकड़ों का विश्लेषण करें (1x TBE संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। आरटी पर 1 घंटे के लिए 1 x टीबीई में एथिडियम ब्रोमाइड के घोल में जेल धुंधला होने के बाद डीएनए टुकड़ों की कल्पना करें (जेल धुंधला समाधान संरचना के लिए तालिका 1 देखें)।
  3. परमाणु डीएनए जीनोटाइपिंग
    नोट: आरएफएलपी विश्लेषण के लिए नियोजित पिछले डीएनए निष्कर्षण नमूने का उपयोग करके परमाणु डीएनए जीनोटाइपिंग की जानी चाहिए।
    1. वाणिज्यिक-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के पूल का उपयोग करके 16 लोकी (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433, और AMEL) को बढ़ाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. पहले से प्राप्त टुकड़ों को अलग करने के लिए आनुवंशिक विश्लेषक का उपयोग करके वैद्युतकणसंचलन करें।
      नोट: एक बार प्रवर्धित होने के बाद, विभिन्न लोकी का विश्लेषण वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक केशिका प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। टुकड़ों को एक वाणिज्यिक बहुलक से भरे 50 सेमी लंबे कैपिलर में अलग किया जाता है। कैथोड और एनोड बफर भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जैसा कि सामग्री की तालिका में दिखाया गया है। वैद्युतकणसंचलन 60 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 19.5 केवी पर किया जाता है।
    3. प्रत्येक प्रवर्धित स्थान के अनुरूप एलील्स निर्धारित करने के लिए जैव सूचना त्मक उपकरणों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. परमाणु डीएनए प्रोफाइल डेटाबेस (तालिका 1) के साथ चरण 4.3.3 में प्राप्त डेटा की तुलना करें, यह जांचने के लिए कि क्या परमाणु डीएनए प्रोफ़ाइल माइटोकॉन्ड्रिया रिसेप्टर सेल लाइन प्रोफाइल (चित्रा 4) से मेल खाती है।

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Representative Results

उपरोक्त प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करने के बाद, एक संरक्षित परमाणु पृष्ठभूमि के साथ एक होमोप्लाज्मिक साइब्रिड सेल लाइन लेकिन एक नए माइटोकॉन्ड्रिया जीनोटाइप के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 1 और चित्रा 2 में योजनाबद्ध में दर्शाया गया है। साइब्रिड्स में मौजूद माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डीएनए की शुद्धता की पुष्टि आरएफएलपी द्वारा की जा सकती है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, और परमाणु डीएनए जीनोटाइपिंग विश्लेषण द्वारा, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है।

यदि माइटोकॉन्ड्रियल स्थानांतरण सफलतापूर्वक किया गया था, तो साइब्रिड सेल लाइन के लिए आरएफएलपी विश्लेषण के साथ प्राप्त परिणामों को प्राप्तकर्ता सेल लाइन की तुलना में अलग-अलग पाचन बैंड पैटर्न दिखाना चाहिए और माइटोकॉन्ड्रिया दाता सेल लाइन के समान होना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, प्रतिबंध एंजाइम को सावधानी से चुना जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि पाचन से प्राप्त बैंड पैटर्न दोनों सेल लाइनों में अलग-अलग हैं। एक उदाहरण चित्रा 3 में दिया गया है, जिसमें डब्ल्यूटी माइटोकॉन्ड्रिया और उत्परिवर्ती माइटोकॉन्ड्रिया (एमयूटी) में एसएसपीआई पाचन के बाद प्राप्त प्रतिबंध टुकड़े दिखाए गए हैं। नई ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल सेल लाइनों के मामले में, प्रतिबंध टुकड़े उनके संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल दाताओं में प्राप्त किए गए समान थे और नाभिक दाता सेल एम्प्लिकॉन के साथ उत्पन्न लोगों से अलग थे। इस प्रकार, यह परख पुष्टि करती है कि माइटोकॉन्ड्रियल विनिमय अपेक्षा के अनुसार किया गया था। ध्यान दें, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से एक नमूना जो पाचन प्रक्रिया के अधीन नहीं था, इस विश्लेषण में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था।

डीएनए परमाणु जीनोटाइपिंग के बारे में, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों में से एक के लिए 16 परमाणु लोकी के विश्लेषण से प्राप्त एक विशिष्ट प्रोफ़ाइल चित्रा 4 में दिखाई गई है। आरएफएलपी के समान, प्रत्येक लोकस के लिए प्राप्त चोटियों की तुलना करके, माइटोकॉन्ड्रिया रिसेप्टर सेल लाइन (परमाणु दाता) से प्राप्त परिणाम उत्पन्न साइब्रिड के साथ मेल खाना चाहिए।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राप्त परिणाम विभिन्न कारकों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। जैसा कि हम प्रोटोकॉल में इंगित करते हैं, कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया की समग्रता को हटाने के लिए सभी सेल लाइनें रोडामाइन 6 जी की समान मात्रा के लिए अतिसंवेदनशील नहीं होती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के चरण 1 से 3 को सारांशित करते हुए, साइब्रिड पीढ़ी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: साइब्रिडाइजेशन प्रोटोकॉल के बाद सेल कल्चर प्लेट के डिजाइन को दिखाते हुए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक नई साइब्रिड सेल लाइन और नियंत्रण (पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और रोडामाइन 6 जी-उपचारित प्राप्तकर्ता कोशिकाओं) को 6-वेल प्लेट में अलग से बीज दिया जाता है। संस्कृति के कुछ दिनों के बाद, साइब्रिड कोशिकाएं बढ़ने लगती हैं, जबकि नियंत्रण कुओं में कोई जीवित कोशिका नहीं रहती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: साइब्रिड्स का आणविक लक्षण वर्णन। (ए) माइटोकॉन्ड्रियल डोनर सेल लाइनों (डब्ल्यूटी और एमयूटी, लेन 3 और 4, क्रमशः) और उनके संबंधित ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल सेल लाइनों (एमयूटी डब्ल्यूटी → लेन 5, औरडब्ल्यूटी एमयूटी → लेन 6) में एम.4206सी>टी उत्परिवर्तन का आरएफएलपी विश्लेषण। एमडब्ल्यू: आणविक भार मार्कर (लेन 1); अनकट: गैर-पचा हुआ पीसीआर उत्पाद (लेन 2)। (बी) डब्ल्यूटी और एमयूटी माइटोकॉन्ड्रिया के लिए पीसीआर उत्पाद के एसएसपीआई प्रतिबंध मानचित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: परमाणु डीएनए पृष्ठभूमि विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम। 16 लोकी के पीसीआर प्रवर्धन और कैपिलर वैद्युतकणसंचलन द्वारा पृथक्करण के बाद प्राप्त परमाणु डीएनए फिंगरप्रिंट का उदाहरण। आंकड़ा एक सेल लाइन के प्रत्येक प्रवर्धित लोकी के लिए विशिष्ट शिखर पैटर्न दिखाता है। परमाणु डीएनए शुद्धता की पुष्टि करने के लिए साइब्रिडाइजेशन प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली दो सेल लाइनों के लिए यह पैटर्न अलग होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मध्यम संयोजन
संपूर्ण संस्कृति माध्यम एल-ग्लैन और पाइरूवेट + एफबीएस (10%) + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) के साथ डीएमईएम उच्च ग्लूकोज
हाइपोटोनिक बफर। 10 mM MOPS, 83 mM सुक्रोज, pH 7.2
हाइपरटोनिक बफर 30 mM MOPS, 250 mM सुक्रोज, pH 7.2
बफर ए 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M सुक्रोज, pH 7.4
TBE (1x) 50 एमएम ट्रिस, 50 एमएम बोरिक एसिड; 1 mM EDTA
जेल धुंधला घोल 1x TBE में 0.75 μg/mL Ethidium ब्रोमाइड।

तालिका 1: बफर और मीडिया संरचना।

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Discussion

चूंकि ओटो वारबर्ग ने बताया कि कैंसर कोशिकाएं अपने चयापचय को स्थानांतरित करती हैं और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम करते हुए "एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस" 3,4 को शक्तिशाली बनाती हैं, इसलिए कैंसर परिवर्तन और प्रगति में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका में रुचि तेजी से बढ़ी है। हाल के वर्षों में, एमटीडीएनए और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन में उत्परिवर्तन को कई कैंसर प्रकारोंकी पहचान के रूप में माना गया है। आज तक, कई अध्ययनों ने विशिष्ट ट्यूमर 6,26,27,28,29,30,31,32 के एमटीडीएनए भिन्नता का विश्लेषण किया है, और अधिग्रहित एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के कुल बोझ को प्रोस्टेट कैंसर 33 जैसे कैंसर में ट्यूमरजेनिसिटी 30 का बायोमार्कर माना गया है।. इसके अनुरूप, जबकि एमटीडीएनए उत्परिवर्तन को कुछ मामलों में ट्यूमर आरंभकर्ता माना जाता है, जैसे कि स्तन 34,35 या अग्नाशय ी36 कैंसर, स्त्री रोग संबंधी विकृतियां 37,38, फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा मेटास्टेस 15,39, या तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया40,41, वे ग्लियोब्लास्टोमा 42 में कम प्रासंगिक प्रतीत होते हैं।

यद्यपि कई कैंसर गंभीर एमटीडीएनए उत्परिवर्तन करते हैं जो स्वस्थ ऊतकों में नहीं पाए जातेहैं और कैंसर की शुरुआत में योगदान कर सकते हैं, अन्य पॉलीमॉर्फिक एमटीडीएनए वेरिएंट पेश करते हैं जो विभिन्न मानव आबादी में आम हैं। ये वेरिएंट हल्के परिवर्तनों को बढ़ावा देते हैं जो परिवर्तनप्रक्रिया शुरू होने के बाद कैंसर सेल अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। किसी भी मामले में, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय परिवर्तन ट्यूमर की प्रगति में शामिल होते हैं, सेल होमियोस्टैसिस के विभिन्न पहलुओं को संशोधित करते हैं जैसे कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन या रेडॉक्स स्थिति44,45,46। हालांकि, जिन तंत्रों द्वारा एमटीडीएनए उत्परिवर्तन और वेरिएंट ट्यूमरजेनिसिस का पक्ष ले सकते हैं, उन्हें अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं में एमटीडीएनए उत्परिवर्तन परमाणु जीन 8,33 में परिवर्तन के साथ सह-अस्तित्व में हो सकते हैं, जिससे यह निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है कि चालक उत्परिवर्तन कौन सा है। अन्य मामलों में, ट्यूमर कोशिकाओं की बायोएनर्जेटिक आवश्यकताओं को एमटीडीएनए कॉपी नंबर47 को संशोधित करके प्राप्त किया जाता है। दूसरी ओर, कुछ मामलों में, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन ट्यूमर कोशिकाओं को विशिष्ट एंटी-ट्यूमरदवाओं के लिए अधिक संवेदनशील बना सकते हैं।

कैंसर के पैथोफिज़ियोलॉजी में एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की भूमिका को पूरी तरह से समझने के लिए, उन पद्धतियों को विकसित करना आवश्यक है जिसमें उत्परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण नियंत्रित परमाणु वातावरण में किया जा सकता है। यह परमाणु जीन के प्रभावों की क्षतिपूर्ति से बचने में मदद कर सकता है जो सेलुलर अनुकूलन को ट्रिगर कर सकते हैं। इस उद्देश्य के लिए, ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स एक उपयुक्त मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। साइब्रिडाइजेशन के पारंपरिक तरीकों में एक एमटीडीएनए क्षीण सेल लाइन (:0 कोशिकाएं) शामिल होती हैं जो नाभिक दाता (और इसलिए, माइटोकॉन्ड्रिया रिसेप्टर) और माइटोकॉन्ड्रिया के दाता के रूप में कार्य करती हैं, आमतौर पर एक एन्यूक्लियेटेड सेल लाइन या प्लेटलेट्स19, जिसमें एमटीडीएनए वेरिएंट या रुचि के उत्परिवर्तन होते हैं। साइब्रिड्स उत्पन्न करने की कोशिश करते समय हल की जाने वाली पहली चुनौती पसंद की परमाणु पृष्ठभूमि को आश्रय देने वाली कोशिकाओं की उपलब्धता है। इन कोशिकाओं के अवशोषण में एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दीर्घकालिक उपचार शामिल है, एक रासायनिक यौगिक जो एमटीडीएनए प्रतिकृति को रोकता है। हालांकि, यह परमाणु जीनोम के भीतर उत्परिवर्तन की पीढ़ी को भी प्रेरित कर सकता है जो अध्ययन किए जाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों के प्रभावों को मुखौटा कर सकता है। इसलिए, इस काम में, हम रोडामाइन 6 जी के साथ उपचार द्वारा नाभिक दाता कोशिका लाइनों में पूरे माइटोकॉन्ड्रिया के उन्मूलन का प्रस्ताव करते हैं, एक दवा जो अपरिवर्तनीय रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुंचाती है और कोशिकाओं को मार देगी जब तक कि ताजा माइटोकॉन्ड्रिया को उनके साइटोप्लाज्म21,22,49 में पेश नहीं किया जाता है।

पारंपरिक साइब्रिड पीढ़ी के तरीकों में एक और चुनौती माइटोकॉन्ड्रियल दाता कोशिकाओं की न्यूक्लियेशन प्रक्रिया से संबंधित है। इस उद्देश्य के लिए, साइटोक्लासिन बी की उपस्थिति में अनुयायी कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, जो साइटोस्केलेटन के विघटन को बढ़ावा देकर एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट18 के अलगाव की अनुमति देता है। यदि कोशिकाएं निलंबन (जैसे हेमेटोलॉजिकल लाइनों) में बढ़ती हैं या सेल-सेल और सेल-बाह्य मैट्रिक्स आसंजन खो देती हैं (जो उच्च मेटास्टैटिक क्षमता50,51,52 वाले लोगों के साथ हो सकती है), तो इस न्यूक्लियेशन प्रोटोकॉल से समझौता किया जाएगा, क्योंकि साइटोप्लास्ट नाभिक को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान प्लेट से अलग हो जाएंगे, जिससे बाद की संलयन प्रक्रिया के लिए उनका पूल काफी हद तक कम हो जाएगा। दोनों चुनौतियों को दरकिनार करने के लिए, हम यहां एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जिसमें पीईजी की उपस्थिति में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया को रोडामाइन 6 जी प्रीट्रीटेड कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है, जो समय की बचत और कुशल21,22,49 साबित हुआ है।

एक बार ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल सेल लाइनें उत्पन्न होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु जीनोम दोनों की शुद्धता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, उनके माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के भीतर अनुक्रम अंतर और अलग-अलग विशेषताओं के साथ दाता सेल लाइनों का चयन करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि एंटीबायोटिक प्रतिरोध या अंतर माइक्रोसेटेलाइट्स। जैसा कि ऊपर वर्णित है, कुछ कैंसर को उनके एमटीडीएनए कॉपी नंबर47 को संशोधित करने की सूचना दी गई है, जो मूल और ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल सेल लाइनों दोनों में एमटीडीएनए लोड का विश्लेषण करने और समान परिस्थितियों में उनके ओएक्सपीएचओएस प्रदर्शन का अध्ययन करने के महत्व को दर्शाता है।

इस प्रक्रिया में छिपे मुख्य नुकसान रोडामाइन 6 जी के साथ माइटोकॉन्ड्रिया उन्मूलन की प्रक्रिया से जुड़े हैं। चयनित न्यूक्लियस डोनर सेल लाइन के लिए दवा एकाग्रता और उपचार के समय की इष्टतम स्थितियों को स्थापित करने के लिए प्रत्येक साइब्रिडाइजेशन प्रयोग से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि रोडामाइन 6 जी एकाग्रता या प्रदर्शनी समय पर्याप्त नहीं है, तो नई सेल लाइन में दो अलग-अलग एमटीडीएनए का योगदान होगा, जो फेनोटाइपिक विश्लेषण में अधिक जटिलता जोड़ देगा। इसके अलावा, यदि समय या खुराक इष्टतम लोगों से अधिक है, तो कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रिया रिपॉपुलेशन के बाद भी जीवित नहीं रहेंगी। अंत में, अटूट कोशिकाओं के साथ संदूषण से बचने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रक्रिया के दौरान सावधान रहना आवश्यक है, जो फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन को बदल सकता है।

तकनीकी कठिनाइयों के बावजूद, ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स की पीढ़ी कैंसर और मेटास्टेसिस प्रक्रियाओं में माइटोकॉन्ड्रियल योगदान को उजागर करने और सेल मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जहां एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करके संभावित एंटीकैंसर उपचार का परीक्षण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को आरएसए, जेएमबी और एए को अनुदान संख्या PID2019-105128आरबी-आई00 और पीएफएस और आरएमएल को PGC2018-095795-बी-आई00 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, दोनों एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033 और अनुदान संख्या B31_20R (आरएसए, जेएमए, और एए) और E35_17R (पीएफएस और आरएमएल) द्वारा वित्त पोषित और गोबिर्नो डी अरागॉन द्वारा वित्त पोषित थे। आरएसए के काम को एसोसिओन एस्पानोला कॉन्ट्रा एल कैंसर (एईसीसी) PRDAR21487SOLE से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक सर्विसियो जनरल डी एपोयो ए ला इन्वेस्टिगासियोन-एसएआई, यूनिवर्सिड डी ज़ारागोज़ा के उपयोग को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750

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कैंसर अनुसंधान अंक 193
कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी
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Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).

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