Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65186
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,2
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

Abstract

בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.

Introduction

תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעשורים האחרונים, עבודות רבות תמכו במשמעות של תכנות מחדש של חילוף החומרים בהתקדמות הסרטן. לפיכך, אנרגיית הגידול נחשבת למטרה מעניינת נגד סרטן1. כמרכז מרכזי בחילוף חומרים אנרגטי ובאספקת מבשרים חיוניים, מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בהסתגלויות התאים הללו, שעד היום אנו מבינים רק באופן חלקי.

בהתאם לאמור לעיל, מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) הוצעו כאחד הגורמים האפשריים לתכנות מחדש מטבולי זה, אשר עלול להוביל לפגיעה בביצועי שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC)6 ויסבירו מדוע תאים סרטניים מסוימים משפרים את חילוף החומרים הגליקוליטי שלהם כדי לשרוד. ואכן, דווח כי mtDNA צובר מוטציות בתוך תאים סרטניים, להיות נוכח לפחות 50% של גידולים7. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על ידי יואן ואחרים דיווח על נוכחות של מולקולות mtDNA hypermutated וקטוע בסרטן הכליות, המעי הגס ובלוטת התריס8. יתר על כן, עבודות רבות הוכיחו כי מוטציות מסוימות mtDNA קשורות לפנוטיפ גידול אגרסיבי יותר ולעלייה בפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 9,10,11,12,13,14,15,16.

למרות הרלוונטיות לכאורה של הגנום המיטוכונדריאלי בהתקדמות הסרטן, המחקר של מוטציות אלה ותרומתן למחלה היה מאתגר בשל מגבלות במודלים ובטכנולוגיות הניסוי הזמינות כיום17. לכן, יש צורך בטכניקות חדשות כדי להבין את ההשפעה האמיתית של DNA מיטוכונדריה על התפתחות מחלות סרטן והתקדמותן. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף, המבוסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת, המתגבר על האתגרים העיקריים של שיטות גישור מסורתיות18,19. מתודולוגיה זו מאפשרת שימוש בכל תורם גרעינים ללא קשר לזמינות קו תאי ρ0 המתאים להם ולהעברת מיטוכונדריה מתאים אשר, בעקבות הטכניקות המסורתיות, יהיה קשה לחנך (כלומר, קווי תאים שאינם דבקים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו13 למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization13. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.

1. דלדול מיטוכונדריאלי על ידי טיפול רודאמין 6G (תאים מקבלים)

הערה: הצעד הראשון ליצירת ציבריד מוצלח הוא ביטול מוחלט ובלתי הפיך של תפקודי המיטוכונדריה בתאים המקבלים. לשם כך, יש צורך לקבוע בעבר, עבור כל קו התא, את הריכוז המתאים ואת משך הטיפול עם רודאמין 6G. ריכוז נאות זה צריך להיות מעט מתחת למוות תאי הנגרם על ידי תרופות (הגבוה ביותר שאינו הורג את התאים במהלך הטיפול). בצע את הפעולות הבאות לאחר הגדרת התנאים האופטימליים.

  1. זרעו 106 תאים בצלחת של 6 בארות באמצעות מדיום תרבית שלם (ראו טבלה 1 לפרטים) וטפלו בהם מדי יום עם הריכוז האופטימלי של רודמין 6G במשך 3-10 ימים, בהתאם לקו התא. ריכוזים מסורתיים נעים בין 2 ל 5 מיקרוגרם / מ"ל במשך 3-10 ימים20,21. במחקר זה, עבור תאים שמקורם ב-L929, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל רודאמין 6G במשך 7 ימים היה הטיפול שנבחר13,22.
  2. כדי לשמור על התאים בחיים, להשלים את מדיום תרבית התאים עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של אורידין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של פירובט ולחדש אותו כל 24 שעות.
  3. לאחר הטיפול ולפני האיחוי, לשנות את התווך של תאים שטופלו ברודמין 6G כדי להשלים את תרבית התאים מדיום ללא רודאמין 6G, ולהשאיר אותם בתווך זה במשך 3-4 שעות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
    הערה: ההשפעה הרעילה של רודמין 6G היא בלתי הפיכה, ותאים עם מיטוכונדריה לא מתפקדים לא אמורים להתאושש20. לכן, לאחר הטיפול, תאים שאינם מקבלים מיטוכונדריה פונקציונלית צריכים למות אפילו בתווך תרבית בתוספת אורידין. לכן, אין צורך בברירה גרעינית. עם זאת, מומלץ לבצע איחוי מבוקר של תאים שטופלו ברודקמין 6G ללא מיטוכונדריה.

2. הרחבה ובידוד מיטוכונדריאלי (תאי תורם)

  1. הרחיבו את תאי תורם המיטוכונדריה במהלך פרק הזמן של הטיפול ברודמין 6G כדי להשיג סביב 25 x 106 תאים.
  2. ביום השביעי, קצרו תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי בצינור של 50 מ"ל ואספו אותם באמצעות צנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים 3x במי מלח חוצצי פוספט קר (PBS) ושקעו אותם בצנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. מעתה ואילך, בצע את כל השלבים של מיצוי מיטוכונדריאלי ב 4 ° C, באמצעות ריאגנטים קרים ושמירה על צינורות עם תאים או מיטוכונדריה על קרח.
  3. לאחר הצנטריפוגה השלישית, יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי שאיפה באמצעות פיפטה מזכוכית המוצמדת למשאבת ואקום ולהשהות מחדש את התאים הארוזים בנפח של חיץ היפוטוני השווה לפי 7 מנפח כדורי התא. לאחר מכן, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור homogenizer ולתת לתאים להתנפח על ידי דגירה אותם על קרח במשך 2 דקות.
  4. שברו את קרומי התא על ידי ביצוע 8 עד 10 פעימות בהומוגנייזר המחובר למזיק מונע מנוע המסתובב ב-600 סל"ד.
    הערה: השלב של הפרעה בקרום התא עשוי להשתנות בין סוגי תאים; לכן, זה צריך להיות מותאם עבור כל סוג התא.
  5. הוסף את אותו נפח של חיץ היפרטוני לתרחיף התא (פי 7 מנפח כדורי התא) כדי ליצור סביבה איזוטונית.
  6. מעבירים את ההומוגנאט לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו ברוטור קבוע ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, אספו רק 3/4 מהסופרנאטנט שמשאיר שוליים גדולים מהכדורית, כדי למנוע זיהום בגרעין או בתאים שלמים, והעבירו אותו לצינור אחר. חזור על אותו תהליך פעמיים. שימו לב שיש לשמור את הסופרנאטנט ולהשליך את הכדור.
  7. שמור את החלק המיטוכונדריאלי (supernatant). העבר אותו לצינורות 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) למשך 2 דקות ב- 4 ° C.
  8. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה המועשרת במיטוכונדריה עם חיץ A, תוך שילוב התוכן של שני הצינוריות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.7. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
  9. בצע שטיפה נוספת עם 300 μL של חיץ A וכמת את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות בדיקת ברדפורד23. עבור כל בדיקת cybridization, יש לקבוע את הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה עבור הליך ההעברה (במקרה שלנו, ריכוז בין 10-40 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל 106 תאים).
  10. במקביל, הכינו את התאים המטופלים ברודמין 6G לאיחוי על ידי איסופם בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. שים לב שהגלולה מקבלת צבע ורוד ניאון עקב טיפול ברודמין 6G.
  11. כדי להבטיח שגם ביטול תפקוד המיטוכונדריה בתאי הקולטן וגם טיהור אברונים מתורמים בוצעו כראוי, זרעו מספר קטן של תאים שטופלו ברודמין 6G ובודדו מיטוכונדריה באמצעות מדיום התרבית המלא בצלחת של 6 בארות ותרבו אותם במשך חודש כדי לבדוק שלא נותרו תאים ששרדו באף אחת מהבארות (איור 2).
  12. במקביל, להעריך את היעדר מזהמי גרעינים בחלק המיטוכונדריאלי על ידי זיהוי חיסוני של חלבונים גרעיניים (כלומר, למין בטא, היסטון H3 וכו ') או על ידי הגברה כמותית של תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של גן גרעיני (כלומר, SDH, 18S rRNA, וכו ').
    הערה: כדי למנוע זיהומים, מומלץ לבצע את כל השלבים בתנאים אספטיים בעבודה תחת מכסה מנוע זרימה למינרית.

3. היתוך ויצירת סייבריד

  1. כדי להמשיך עם האיחוי, הוסיפו בזהירות 106 תאים שטופלו ברודמין 6G לגלולת המיטוכונדריה המבודדת (10-40 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי) וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתערבב עם המיטוכונדריה.
  2. הוסף 100 μL של פוליאתילן גליקול (PEG, 50%) והשהה בעדינות את הגלולה למשך 30 שניות. לאחר מכן, לאפשר לנוח ללא פגע עוד 30 שניות.
  3. לבסוף, מעבירים את התערובת לצלחת בת 6 בארות עם מדיום תרבית תאים שלמה טרייה ומניחים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. לאחר כמה ימים (בדרך כלל שבוע אחד), ציברידים טרנסוכונדריאליים אמורים להתחיל לגדול (איור 2), מה שמוליד שיבוטים שניתן לבחור בנפרד או לערבב בבריכה לפני הניתוח שלהם.

4. אימות הרקע המיטוכונדריאלי והגרעיני

הערה: לאחר שקו התאים החדש התבסס והתאים מתחילים לגדול באופן אקספוננציאלי, יש לאמת את טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שלהם. לפיכך, קווי התאים המקוריים צריכים להכיל מוטציות או פולימורפיזמים שונים בתוך הגנום שלהם כדי להפוך אותם לניתנים לזיהוי.

  1. בידוד DNA מוחלט
    1. לבודד את הדנ"א הגנומי של כל קווי התאים המשמשים לייצור ציבריד על ידי שימוש בערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית (ראה טבלת חומרים) או על ידי ביצוע פרוטוקול סטנדרטי באמצעות מיצוי אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל ומשקעים אלכוהוליים24.
  2. הערכת mtDNA (איור 3)
    הערה: ניתן לבצע מספר טכניקות, כגון ריצוף, ניתוח פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), או qPCR ספציפי לאלל, כדי לנתח את טוהר mtDNA. כדי לאשר את נוכחותם של וריאציות רצף mtDNA על ידי RFLP, בצע את שלבי הפרוטוקול הבאים.
    1. להגביר מקטע mtDNA המכיל את שינוי הנוקלאוטידים על ידי PCR.
      1. כאן, תאי L929dt מציגים מוטציה mtDNA במיקום 4206, בתוך גן mt-Nd2 (m.4206C>T) שחסר בתאי L929. כדי לאשר את נוכחותו של תחליף זה בציברידים הטרנסוכונדריאליים, להגביר קטע 397 bp על ידי PCR באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ואת הפריימרים הבאים: 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3' (עמדות 3862-3884) ו-2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (עמדות 4236-4258).
    2. לנתח את נוכחותו של החלפת הנוקלאוטידים הרצויה על ידי RFLP, באמצעות אנדונוקלאז ספציפי המזהה את שינוי הרצף ומייצר דפוס חיתוך שונה עבור שני קווי התא.
      הערה: כאשר קיים וריאנט mtDNA L929dt (4206T), האמפליקון המתקבל בשלב 4.2.1 מכיל שני אתרי הגבלה עבור SspI (ראה טבלת חומרים) המייצרים שלושה מקטעי DNA של 306 bp, 52 bp ו- 39 bp. אתר ההגבלה שמייצר את התדרים 52 ו-39 משתבש כאשר קיימת גרסת ה-Wild-type (WT) C4206, ומופיעה להקה חדשה של 91 bp. לכן, בקרה פנימית לעיכול מלא עבור SspI נכלל בניתוח. תגובת העיכול מבוצעת ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות היצרן.
    3. הפרידו את מקטעי ההגבלה על ידי אלקטרופורזה והשוו את תבנית הפס.
      1. לאחר ביצוע העיכול, נתח את קטעי ההגבלה המתקבלים על ידי אלקטרופורזה בג'לים 10% polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) (ראה טבלה 1 עבור הרכב TBE 1x). הפעל את האלקטרופורזה ב- 80 V למשך שעה אחת ב- RT. דמיין את מקטעי ה- DNA לאחר צביעת ג'ל בתמיסה של אתידיום ברומיד ב- 1x TBE למשך 15 דקות ב- RT (ראה טבלה 1 להרכב תמיסת צביעת ג'ל).
  3. גנוטיפ DNA גרעיני
    הערה: גנוטיפ DNA גרעיני חייב להתבצע באמצעות דגימת מיצוי ה- DNA הקודמת ששימשה לניתוח RFLP.
    1. הגבר 16 אתרים (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ו- AMEL) באמצעות מאגר של אוליגונוקלאוטידים ספציפיים למסחר (ראה טבלת חומרים).
    2. לבצע אלקטרופורזה באמצעות מנתח גנטי על מנת להפריד את השברים שהתקבלו בעבר.
      הערה: לאחר הגברתם, המוקדים השונים מנותחים על ידי אלקטרופורזה באמצעות מערכת קפילרית (ראה טבלת חומרים). השברים מופרדים בקפילר באורך 50 ס"מ המלא בפולימר מסחרי. מאגרי קתודה ואנודה זמינים גם הם באופן מסחרי, כפי שמוצג בטבלת החומרים. אלקטרופורזה מבוצעת ב 19.5 kV במשך 20 דקות ב 60 ° C.
    3. השתמש בכלים ביואינפורמטיים כדי לקבוע את האללים המתאימים לכל מוקד מוגבר (ראה טבלת חומרים).
    4. השוו את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.3.3 עם מסד הנתונים של פרופיל הדנ"א הגרעיני (טבלה 1), כדי לבדוק אם פרופיל הדנ"א הגרעיני תואם לפרופיל קו התא של קולטן המיטוכונדריה (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור 3, ועל-ידי ניתוח גנוטיפ של דנ"א גרעיני, כפי שמוצג באיור 4.

אם העברת המיטוכונדריה נעשתה בהצלחה, התוצאות שהתקבלו בניתוח RFLP עבור קו תאי הסייבריד חייבות להראות דפוסי עיכול שונים בהשוואה לקו התאים המקבל וזהים לקו התאים של תורם המיטוכונדריה. לשם כך, יש לבחור בקפידה את אנזים ההגבלה, ולוודא כי דפוסי הפס המתקבלים מהעיכול שונים בשני קווי התא. דוגמה אחת ניתנת באיור 3, שבו מוצגים מקטעי הגבלה המתקבלים לאחר עיכול SspI במיטוכונדריה WT ובמיטוכונדריה מוטנטית (MUT). במקרה של קווי התאים הטרנסטוכונדריאליים החדשים, מקטעי הגבלה היו זהים לאלה שהתקבלו בתורמים המיטוכונדריאליים שלהם בהתאמה ושונים מאלה שנוצרו עם אמפליקונים של תאי תורם גרעינים. לפיכך, בדיקה זו מאשרת כי חילופי המיטוכונדריה בוצעו כצפוי. יש לציין כי דגימה מתאי הנמען שלא הייתה נתונה להליך העיכול נכללה בניתוח זה כבקרה שלילית.

בנוגע לגנוטיפ גרעיני של דנ"א, פרופיל טיפוסי שהתקבל מניתוח של 16 אתרים גרעיניים עבור אחד מקווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה מוצג באיור 4. בדומה ל- RFLP, על ידי השוואת הפסגות המתקבלות עבור כל לוקוס, התוצאות המתקבלות מקו תאי קולטן המיטוכונדריה (תורם גרעיני) צריכות להתאים לציבריד שנוצר.

חשוב לציין כי התוצאות המתקבלות עשויות להשתנות בהתאם לגורמים שונים. כפי שאנו מציינים בפרוטוקול, לא כל קווי התאים רגישים לאותה כמות של רודאמין 6G להסרת מכלול המיטוכונדריה הפונקציונלית.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של יצירת ציברידים, המסכם את שלבים 1 עד 3 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצוג סכמטי המראה את העיצוב של לוח תרבית התאים לאחר פרוטוקול הציברידגיזציה. קו תאי ציבריד חדש ובקרות (מיטוכונדריה מבודדים ותאים מקבלים שטופלו ברוהדמין 6G) נזרעים בנפרד בצלחת בת 6 בארות. לאחר מספר ימים של תרבית, תאי סייבריד מתחילים לגדול, בעוד שלא נותרו תאים ששרדו בבארות הבקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון מולקולרי של ציברידים. (A) ניתוח RFLP של מוטציית m.4206C>T בקווי תאי תורם מיטוכונדריאלי (WT ו-MUT, נתיבים 3 ו-4, בהתאמה) וקווי התאים הטרנסוכונדריאליים שלהם בהתאמה (MUT WT → נתיב 5 ו-WTMUT → נתיב 6). MW: סמן משקל מולקולרי (נתיב 1); לא חתוך: מוצר PCR לא מעוכל (נתיב 2). (B) מפות הגבלת SspI של מוצר PCR עבור מיטוכונדריה WT ו-MUT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של ניתוח רקע דנ"א גרעיני. דוגמה לטביעת אצבע של DNA גרעיני המתקבלת לאחר הגברה PCR של 16 מוקדים והפרדה על ידי אלקטרופורזה קפילרית. האיור מציג את תבנית השיא האופיינית עבור כל מוקד מוגבר של קו תא. דפוס זה חייב להיות שונה עבור שני קווי התאים המשמשים בפרוטוקול cybridization כדי לאשר את טוהר ה- DNA הגרעיני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בינוני הרכב
מדיום תרבות שלם DMEM גלוקוז גבוה עם L-Gln ופירובט + FBS (10%) + פניצילין-סטרפטומיצין (1x)
חיץ היפוטוני 10 מ"מ MOPS, 83 מ"מ סוכרוז, pH 7.2
חיץ היפרטוני 30 mM MOPS, 250 mM סוכרוז, pH 7.2
חיץ א' 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M סוכרוז, pH 7.4
TBE (1x) 50 מ"מ טריס, 50 מ"מ חומצה בורית; 1 מ"מ EDTA
תמיסת צביעת ג'ל 0.75 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד ב-1x TBE

טבלה 1: מאגרים והרכב מדיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה הונחו כסימני היכר של סוגי סרטן רבים25. עד כה, מחקרים רבים ניתחו את השונות mtDNA של גידולים ספציפיים 6,26,27,28,29,30,31,32, והנטל הכולל של מוטציות mtDNA נרכשות נחשב סמן ביולוגי של גידוליות 30 בסרטן כגון סרטן הערמונית 33. בהתאם לכך, בעוד שמוטציות mtDNA נחשבות ליוצרות גידול במקרים מסוימים, כגון בסרטן השד 34,35 או סרטן הלבלב 36, ממאירויות גינקולוגיות 37,38, גרורות באדנוקרצינומה של הריאות 15,39, או לוקמיה מיאלואידית חריפה 40,41, נראה שהן פחות רלוונטיות בגליובלסטומות 42.

למרות שסוגי סרטן רבים מכילים מוטציות mtDNA חמורות שאינן נמצאות ברקמות בריאות43 ויכולות לתרום להתחלת סרטן30, אחרים מציגים גרסאות mtDNA פולימורפיות הנפוצות באוכלוסיות אנושיות שונות. וריאנטים אלה מקדמים שינויים מתונים יותר שיכולים להיות חשובים להסתגלות התאים הסרטניים לאחר תחילת תהליך הטרנספורמציה30. בכל מקרה, מוטציות mtDNA ושינויים במטבוליזם המיטוכונדריאלי מעורבים בהתקדמות הגידול, ומשנים היבטים שונים של הומאוסטזיס התא כגון ייצור מיני חמצן תגובתי או מצב חמצון-חיזור44,45,46. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם מוטציות וגרסאות mtDNA יכולות להעדיף גידולים עדיין אינם מובנים לחלוטין. חוץ מזה, מוטציות mtDNA בתאים סרטניים עשויות להתקיים יחד עם שינויים בגנים גרעיניים 8,33, מה שמקשה לקבוע מהי המוטציה המניעה. במקרים אחרים, הדרישות הביו-אנרגטיות של תאי הגידול מושגות על ידי אפנון עותק mtDNA מספר47. מצד שני, במקרים מסוימים, מוטציות mtDNA יכולות להפוך את תאי הגידול לרגישים יותר לתרופות ספציפיות נגד גידולים48.

כדי להבין באופן מלא את התפקיד של מוטציות mtDNA בפתופיזיולוגיה של סרטן, יש צורך לפתח מתודולוגיות שבהן מיטוכונדריה מוטציה ניתן לנתח בסביבה גרעינית מבוקרת. זה יכול לעזור למנוע השפעות מפצות של גנים גרעיניים שיכולים לעורר הסתגלות תאית. לשם כך, ציברידים טרנסוכונדריאליים מייצגים מודל מתאים. שיטות מסורתיות של cybridization כוללות קו תאים מדולדל mtDNA (ρ0 תאים) הפועלים כתורם גרעינים (ולכן, קולטן מיטוכונדריה) ותורם של מיטוכונדריה, בדרך כלל קו תאים enucleated או טסיות19, הנושא את גרסאות mtDNA או מוטציות מעניינות. האתגר הראשון שיש לפתור כאשר מנסים לייצר ציברידים הוא זמינותם של תאי ρ0 בעלי הרקע הגרעיני הנבחר. ההשגה של תאים אלה כרוכה בטיפול ארוך טווח עם אתידיום ברומיד, תרכובת כימית המעכבת שכפול mtDNA. עם זאת, זה יכול גם לגרום ליצירת מוטציות בתוך הגנום הגרעיני שיכול להסוות את ההשפעות של השינויים המיטוכונדריאליים להיחקר. לכן, בעבודה זו, אנו מציעים לחסל מיטוכונדריה שלמים בשורות תאים תורמים גרעיניים על ידי טיפול ברודמין 6G, תרופה שפוגעת באופן בלתי הפיך במיטוכונדריה ותהרוג את התאים אלא אם כן יוכנסו מיטוכונדריה טריים לציטופלסמה21,22,49.

אתגר נוסף בשיטות מסורתיות לייצור ציברידים קשור לתהליך האנוקלציה של תאי התורם המיטוכונדריאלי. לשם כך, תאים דבקים הם צנטריפוגות בנוכחות cytochalasin B, אשר מאפשר בידוד של ציטופלסטים enucleated18 על ידי קידום חוסר הארגון של השלד cytoskeleton. אם תאים גדלים בתרחיף (כגון קווים המטולוגיים) או איבדו היצמדות מטריקס תא-תאי וחוץ-תאי (מה שעשוי לקרות לאלה עם פוטנציאל גרורתי גבוה יותר50,51,52), פרוטוקול אינקולציה זה ייפגע, מכיוון שציטופלסטים יתנתקו מהצלחת במהלך הצנטריפוגה כדי להסיר את הגרעינים, ובמידה רבה יצמצמו את המאגר שלהם להליך האיחוי הבא. כדי לעקוף את שני האתגרים, אנו מציעים כאן פרוטוקול שבו מיטוכונדריה מבודדים מתמזגים עם תאים שטופלו מראש ברודמין 6G בנוכחות PEG, שהוכח כחסכוני בזמן ויעיל21,22,49.

ברגע שקווי התאים הטרנסטוכונדריאליים נוצרים, חיוני להעריך את טוהר הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. לכן, חיוני לבחור שורות תאי תורם עם הבדלי רצף בתוך הדנ"א המיטוכונדריאלי שלהם ועם מאפיינים מובחנים, כגון עמידות לאנטיביוטיקה או מיקרו-לוויינים דיפרנציאליים. כפי שתואר לעיל, דווח כי חלק מסוגי הסרטן מווסתים את עותק mtDNA מספר47 שלהם, מה שמעיד על החשיבות של ניתוח עומס mtDNA הן בקווי תאים מקוריים והן בקווי תאים טרנסוכונדריאליים ולימוד ביצועי ה- OXPHOS שלהם בתנאים דומים.

המלכודות העיקריות החבויות בהליך זה קשורות לתהליך חיסול המיטוכונדריה עם רודמין 6G. לכל ניסוי cybridization יש להקדים בדיקות כדי לקבוע את התנאים האופטימליים של ריכוז התרופה ואת זמן הטיפול עבור קו התאים התורם גרעין נבחר. אם ריכוז הרודמין 6G או זמן האקספוזיציה אינם מספיקים, לקו התאים החדש תהיה תרומה של שני mtDNA שונים, מה שיוסיף מורכבות רבה יותר לאנליזה הפנוטיפית. יתר על כן, אם הזמן או המינון עולים על אלה האופטימליים, התאים לא ישרדו גם לאחר אכלוס מחדש של המיטוכונדריה. לבסוף, חיוני להיות זהירים במהלך תהליך בידוד המיטוכונדריה על מנת למנוע זיהום עם תאים לא שבורים, אשר יכול לשנות את האפיון פנוטיפי.

למרות הקשיים הטכניים, הדור של cybrids transochondrial הוא כלי רב עוצמה כדי לפענח את התרומה המיטוכונדריאלית לסרטן וגרורות תהליכים וליצור מודלים תאיים שבו טיפולים אנטי סרטניים פוטנציאליים באמצעות מיטוכונדריה כמטרה טיפולית ניתן לבדוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Tags

חקר הסרטן גיליון 193
יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., … More

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter