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Genetics

एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) का उपयोग करके सी एलिगेंस में ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक इनहेरिटेंस का विश्लेषण

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65285
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस में आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग और संबंधित क्रोमैटिन संशोधनों के एपिजेनेटिक वंशानुक्रम का अध्ययन करने के लिए एक आरएनए हस्तक्षेप और सीएचआईपी परख का वर्णन करता है।

Abstract

ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक इनहेरिटेंस (टीईआई) गैर-कोडिंग आरएनए और क्रोमैटिन संशोधनों जैसे कारकों के माध्यम से जीनोम अनुक्रम को बदले बिना जर्मलाइन के माध्यम से जानकारी के संचरण की अनुमति देता है। नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वंशानुक्रम की घटना टीईआई की जांच करने के लिए एक प्रभावी मॉडल है जो इस मॉडल जीव के छोटे जीवन चक्र, आत्म-प्रसार और पारदर्शिता का लाभ उठाता है। आरएनएआई वंशानुक्रम में, आरएनएआई के लिए जानवरों के संपर्क में आने से लक्षित स्थान पर जीन साइलेंसिंग और परिवर्तित क्रोमैटिन हस्ताक्षर होते हैं जो प्रारंभिक ट्रिगर की अनुपस्थिति में कई पीढ़ियों तक बने रहते हैं। यह प्रोटोकॉल जर्मलाइन-व्यक्त परमाणु हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर का उपयोग करके सी एलिगेंस में आरएनएआई वंशानुक्रम के विश्लेषण का वर्णन करता है। जीएफपी को लक्षित करने वाले डबल-फंसे आरएनए को व्यक्त करने वाले जानवरों के बैक्टीरिया को खिलाकर रिपोर्टर साइलेंसिंग शुरू की जाती है। प्रत्येक पीढ़ी में, जानवरों को सिंक्रनाइज़ विकास को बनाए रखने के लिए पारित किया जाता है, और रिपोर्टर जीन साइलेंसिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है। चुनिंदा पीढ़ियों में, आबादी को जीएफपी रिपोर्टर लोकस में हिस्टोन संशोधन संवर्धन को मापने के लिए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) -मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) के लिए एकत्र और संसाधित किया जाता है। आरएनएआई वंशानुक्रम का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और छोटे आरएनए और क्रोमैटिन मार्गों में टीईआई कारकों की जांच करने के लिए अन्य विश्लेषणों के साथ जोड़ा जा सकता है।

Introduction

एपिजेनेटिक वंशानुक्रम पीढ़ियों में जीन नियामक जानकारी के संचरण की अनुमति देता है और इसलिए माता-पिता के पर्यावरण या अनुभवों को उनकी संतान को प्रभावित करने की अनुमति दे सकता है। एलिगेंस में, बहिर्जात डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) द्वारा शुरू की गई जर्मलाइन जीन साइलेंसिंग को संतान में कई पीढ़ियों के लिए विरासत में मिला जा सकता है जो मूल ट्रिगर 1,2,3,4 के संपर्क में नहीं आता है। यह प्रक्रिया, जिसे आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वंशानुक्रम कहा जाता है, सी एलिगेंस में कई संबंधित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग घटनाओं में से एक है, जिसमें पिआरएनए-शुरू किए गए मल्टीजेनरेशनल साइलेंसिंग2,5, पैराम्यूटेशन / आरएनएई (आरएनए-प्रेरित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग) 6,7,8, और मल्टीकॉपी सरणी-शुरू साइलेंसिंग9 शामिल हैं, जिनमें छोटे आरएनए और क्रोमैटिन विनियमन मशीनरी के लिए अतिव्यापी लेकिन अलग-अलग आवश्यकताएं हैं।. एलिगेंस एक्सोजेनस आरएनएआई में, डीएसआरएनए को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) में संसाधित किया जाता है जो अपने लक्ष्य एमआरएनए को पहचानने के लिए प्राथमिक आर्गोनॉट प्रोटीन के साथ एक परिसर में कार्य करते हैं। यह लक्ष्यीकरण द्वितीयक एसआईआरएनए के प्रवर्धन की ओर जाता है जो साइटोप्लाज्मिक और परमाणु साइलेंसिंग मार्गों दोनों के माध्यम से एमआरएनए को शांत करने के लिए द्वितीयक आर्गोनॉट्स के साथ जुड़ते हैं। जर्मलाइन-व्यक्त आरएनएआई लक्ष्यों के लिए, परमाणु द्वितीयक आर्गोनॉट एचआरडीई -1 और अतिरिक्त परमाणु आरएनएआई कारक नवजात प्रतिलेख को लक्षित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसक्रिप्शनल दमन और हिस्टोन मिथाइलट्रांसफेरेज़ की भर्ती दमनकारी क्रोमैटिन निशान जमा करने के लिए होती है, जिसमें एच 3 के 9 एम 310 शामिल है। हिस्टोन H3K9me3 RNAI वंशानुक्रम11,12 द्वारा जर्मलाइन-व्यक्त ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) ट्रांसजेन के आनुवंशिक साइलेंसिंग की स्थापना को बढ़ावा देता है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आरएनएआई वंशानुक्रम के लिए एक रिपोर्टर के रूप में जर्मलाइन में जीएफपी-हिस्टोन फ्यूजन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेन का उपयोग करना है और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (सीएचआईपी-क्यूपीसीआर) का उपयोग करके रिपोर्टर ट्रांसजेन लोकस में हिस्टोन संशोधनों में परिवर्तन की परख करना है। यह प्रोटोकॉल रिपोर्टर साइलेंसिंग शुरू करने के लिए एक मानकीकृत प्लेट-आधारित आरएनएआई फीडिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है। यह क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार ('ब्लीचिंग') द्वारा गर्भवती वयस्कों से गर्भाशय भ्रूण में अलग करके पीढ़ियों के बीच जानवरों को पारित करने के लिए एक विस्तृत समयरेखा भी प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा आबादी के उप-समूह में जीएफपी साइलेंसिंग की आवृत्ति की निगरानी के लिए तरीके और प्रतिनिधि डेटा और हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 सीएचआईपी-क्यूपीसीआर के लिए भी वर्णित हैं। रिपोर्टर-आधारित आरएनएआई वंशानुक्रम परख एपिजेनेटिक विनियमन 13,14 में आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की भूमिकाओं को कार्यात्मक रूप से विच्छेदित करने के लिए एक अत्यधिक साध्य प्रणाली प्रदान करते हैं, और ऐसे संवाददाताओं का उपयोग करके आनुवंशिक स्क्रीन ने दोनों जीनों की पहचान की है जो 2,3,15 के लिए आवश्यक हैं और जीन जो 16,17 ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक वंशानुक्रम की अवधि को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करते हैं।

Protocol

नोट: एक परख समयरेखा चित्रा 1 में प्रदान की गई है।

1. आरएनएआई नेमाटोड विकास माध्यम (आरएनएआई-एनजीएम) प्लेटों की तैयारी

  1. कोलाई एचटी 115 (डीई 3) जिसमें या तो जीएफपी होता है या ग्लिसरॉल स्टॉक से आरएनएआई वैक्टर को नियंत्रित करता है, जो लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेटों पर 100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक होता है। बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन, आरएनएआई-एनजीएम प्लेटें (1.7% [डब्ल्यू / वी] एगर, 0.3% [डब्ल्यू / वी] एनएसीएल, 0.25% [डब्ल्यू / वी] पेप्टोन, 1 एमएम सीएसीएल2, 5 μg / mL कोलेस्ट्रॉल, 25 mM पोटेशियम फॉस्फेट बफर [पीएच 6.0], 1 mM MgSO4, 25 μg / mL कार्बेनिसिलिन, और 5 mM आइसोप्रोपिल β-d-d-1-थियोगैलेक्टोसाइरानोसाइड [IPTG] के अनुसार तैयारकरें।
    1. परख में प्रत्येक स्ट्रेन के लिए, जीएफपी आरएनएआई (तीन जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के लिए दो प्लेट) और नियंत्रण आरएनएआई (एक जैविक प्रतिकृति) के साथ बीज ति दो आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों के साथ कम से कम छह आरएनएआई-एनजीएम प्लेटें तैयार करें।
    2. प्रकाश से बचाने के लिए प्लेटों को पन्नी के साथ शिथिल रूप से तम्बू करें और सूखने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें।
  3. आरएनएआई-एनजीएम प्लेट डालने के दिन, आरएनएआई बैक्टीरिया के 4 एमएल तरल कल्चर तैयार करें।
    1. बाँझ परिस्थितियों में, एलबी शोरबा के 4 मिलीलीटर एलिकोट को 10 μg / mL टेट्रासाइक्लिन और 100 μg / mL एम्पीसिलीन के साथ कल्चर ट्यूबों में पूरक किया जाता है। प्रत्येक ट्यूब में एलबी एगर प्लेटों से एकल कॉलोनियों को चुनें और 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 16 घंटे तक हिलाते हुए रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों पर बीज आरएनएआई बैक्टीरिया।
    1. रात भर के विकास के बाद, एलबी शोरबा के साथ बैक्टीरिया के 1: 5 कमजोर पड़ने का उपयोग करके संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600) को मापें।
    2. आरएनएआई बैक्टीरिया को एलबी शोरबा का उपयोग करके 2 के सापेक्ष ओडी 600 में पतला करें जो 10 μg / mL टेट्रासाइक्लिन और100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक है।
    3. बाँझ परिस्थितियों में, प्रत्येक आरएनएआई-एनजीएम प्लेट पर नियंत्रण या जीएफपी आरएनएआई बैक्टीरिया के 150 μL जोड़ें।
    4. पन्नी के साथ प्लेटों को तम्बू करें और उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर बैक्टीरिया को कम से कम 24 घंटे तक बढ़ने दें।
      नोट: अप्रयुक्त आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों को अंधेरे में एक सीलबंद कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक उल्टे संग्रहीत किया जा सकता है।

2. आरएनएआई वंशानुक्रम परख शुरू करना: पी 0 पीढ़ी के लिए ब्लीचिंग और प्लेटिंग भ्रूण।

नोट: आरएनएआई इनहेरिटेंस परख शुरू करने से पहले, जीएफपी रिपोर्टर एमजेआईएस 134 [मेक्स -5पी:: जीएफपी-एच 2 बी:: टीबीबी -2 3'यूटीआर] 7 युक्त कीड़े को कम से कम दो पीढ़ियों के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर बिना भूखा बनाए रखा जाना चाहिए।

  1. आरएनएआई वंशानुक्रम परख (चित्रा 1) की शुरुआत से 4 दिन (96 घंटे) पहले, ओपी 50-1 बैक्टीरिया के साथ बीज ति प्रत्येक 35 मिमी मानक एनजीएम प्लेट पर तीन या चार ग्रेविड वयस्कों को चुनें।
    नोट: प्रति स्ट्रेन तीन एनजीएम प्लेटें पर्याप्त हैं। कमजोर प्रजनन क्षमता वाले उपभेदों के लिए, प्रति प्लेट चार से अधिक जानवरों की आवश्यकता हो सकती है।
  2. 4 दिनों के बाद, सुनिश्चित करें कि वयस्क आबादी ने प्लेट पर भ्रूण देना शुरू कर दिया है। ट्राइटन एक्स -100 (टीएक्स -100) (22 एमएम केएच 2 पीओ 4, 42 एमएम एनए2एचपीओ 4, 86 एमएम एनएसीएल,1 एमएम एमजीएसओ 4, 0.01% (वी / वी) टीएक्स -100) के साथ पूरक एम 9 बफर के 800 μ L का उपयोग करके प्लेटों से कीड़े को 1.5 एमएल ट्यूबों में धोएं। धोने और पूल को उसी ट्यूब में दोहराएं।
  3. निम्नानुसार ब्लीचिंग द्वारा भ्रूण को आबादी से अलग करें।
    1. 1.5: 1 वॉल्यूम अनुपात में ब्लीच (6% सोडियम हाइपोक्लोराइट) और 10 एन एनएओएच के साथ एक ब्लीचिंग समाधान तैयार करें। पर्याप्त मात्रा तैयार करें जैसे कि प्रत्येक नमूने के लिए 250 μL का उपयोग किया जा सके।
    2. 1.5-2 मिनट के लिए 1,000 x g पर कीड़े के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, कीड़े 'पेलेट' को परेशान किए बिना 100 μL छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, ट्यूबों को लगभग 2 मिनट के लिए छोड़ा जा सकता है ताकि कीड़े को सांस लेने से पहले व्यवस्थित किया जा सके।
    4. 750 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 650 μL ddH2O जोड़ें।
      नोट: निम्न चरण समय संवेदनशील हैं।
    5. प्रत्येक ट्यूब में 250 μL विरंजन समाधान जोड़ें और टाइमर शुरू करें।
    6. हर 1-2 मिनट में, ट्यूबों को अच्छी तरह से भंवर करें। 5 मिनट के बाद, वयस्कों के क्षरण की निगरानी के लिए स्टीरियोस्कोप के तहत कीड़े की जांच करें।
    7. जब तक कीड़े पूरी तरह से घुल न जाएं और केवल भ्रूण न रह जाएं, तब तक भंवर जारी रखें। तुरंत ट्यूबों को 1.5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: ब्लीचिंग आम तौर पर 6-7 मिनट के भीतर पूरी हो जाती है, लेकिन जारी भ्रूण (40x) का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त आवर्धन पर एक स्टीरियोस्कोप के तहत निगरानी की जानी चाहिए। कीड़े को एक विस्तारित अवधि के लिए ब्लीच में न छोड़ें, क्योंकि यह भ्रूण से समझौता करेगा।
    8. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और लगभग 50-100 μL छोड़ दें। धोने के लिए TX-100 के साथ M9 बफर का 1 मिलीलीटर जोड़ें और भंवर द्वारा मिलाएं। सेंट्रीफ्यूज को 1.5-2 मिनट के लिए 1,000 x g पर फिर से धोएं और कम से कम दो बार धोएं।
    9. सतह पर तैरनेवाले को अंतिम धोने से एस्पिरेट करें और ट्यूब में लगभग 100 μL छोड़ दें। भंवर द्वारा मिलाएं। प्रत्येक ट्यूब से पिपेट 2 μL दो बार लेबल ग्लास स्लाइड पर। प्रति माइक्रोलीटर भ्रूण की एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए टैली काउंटर का उपयोग करके भ्रूण की गणना करें।
      नोट: कई उपभेदों की प्रतिकृति की गणना करने के लिए कई ठंढे कुओं के साथ स्लाइड का उपयोग यहां किया जा सकता है। गिनती स्लाइड को धोया और पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  4. अर्ध-सिंक्रनाइज़ जनसंख्या वृद्धि शुरू करने के लिए, प्रत्येक आरएनएआई-एनजीएम प्लेट पर 250 भ्रूण युक्त मात्रा को मिलाएं और पिपेट करें। प्रत्येक प्रतिकृति के लिए दो प्लेटों का उपयोग करें। तरल को अवशोषित होने दें।
  5. आरएनएआई के साथ इलाज किए गए पी 0 पीढ़ी के लिए, 4 दिनों (96 घंटे) (भ्रूण से वयस्कता तक) के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। समय जीनोटाइप के साथ भिन्न हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: आरएनएआई वंशानुक्रम परख योजनाबद्ध। आरएनएआई-एनजीएम प्लेट तैयार करने और आरएनएआई वंशानुक्रम परख सेटअप के लिए प्रस्तावित समयरेखा। गर्भवती वयस्कों को दिन -4 पर एनजीएम प्लेटों पर ओपी 50-1 के साथ बीज दिया जाता है। 4 दिनों के बाद, वयस्क संतान को ब्लीच किया जाता है और भ्रूण को आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। पी 0 पीढ़ी 21 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए आरएनएआई के संपर्क में है। एक बार जब कीड़े वयस्कता तक पहुंच जाते हैं, तो प्रतिकृतियों को ब्लीचिंग द्वारा पारित किया जाता है और प्रत्येक पीढ़ी में जर्मलाइन जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए स्कोर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. जर्मलाइन जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए प्रत्येक पीढ़ी को पासिंग और स्कोरिंग

नोट: स्कोरिंग की सुविधा के लिए, कीड़े को पंक्तिबद्ध करने के लिए रैखिक लकीरों के साथ अगारोस पैड बनाने के लिए एक विनाइल रिकॉर्ड का उपयोग करें। इस विधि को रिवेरा गोमेज़ और श्वार्ज़स्टीन19 से अनुकूलित किया गया था।

  1. माइक्रोवेव में गर्म करके एक छोटे फ्लास्क में डीडीएच2ओ में एगारोस को घोलकर 1% (डब्ल्यू / वी) एगारोस तैयार करें। एक हलचल पट्टी जोड़ें और पन्नी के साथ कवर करें। यदि पिघल रहा है, तो हिलाते हुए 200 डिग्री सेल्सियस पर एक हॉटप्लेट पर अगारोस गर्म करें। एक बार पिघलने के बाद, गर्मी को 80 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
  2. टीएक्स -100 के साथ एम 9 बफर के 800 μL का उपयोग करके एनजीएम प्लेटों से कीड़े को 1.5 एमएल ट्यूब में धोएं। सभी गर्भवती वयस्कों को हटाने के लिए प्लेटों को दो बार धोएं। स्टीरियोस्कोप के तहत प्लेटों की जांच करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि जानवरों को कुशलता से एकत्र किया गया है।
  3. ट्यूबों को 1.5-2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें या कीड़े को 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने दें। सतह पर तैरने वाला पदार्थ एस्पिरेट करें और कीड़े 'पेलेट' को परेशान किए बिना 100 μL छोड़ दें।
  4. कीड़े को बढ़ाने के लिए अगारोस पैड निम्नानुसार तैयार करें।
    1. ग्लास पाश्चर पिपेट (संकीर्ण छोर टूटने के साथ) का उपयोग करके विनाइल रिकॉर्ड (पहले19 वर्णित) पर पिघले हुए 1% (डब्ल्यू / वी) एग्रोस की एक बूंद रखें।
    2. एक ग्लास स्लाइड को ओरिएंट करें ताकि रिकॉर्ड पर लाइनें या तो क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर हों और स्लाइड को अगारोस की बूंद पर जल्दी से रखें। रिकॉर्ड से ग्लास स्लाइड को हटाने से पहले लगभग 30 सेकंड प्रतीक्षा करें।
      नोट: यदि कई जीनोटाइप स्कोर कर रहे हैं, तो एक स्लाइड पर एक बड़ा एगारोस पैड बनाना और ब्लेड का उपयोग करके इसे आधे में काटना उपयोगी हो सकता है।
  5. कीड़े को अगारोस पैड पर माउंट करें।
    1. स्टीरियोस्कोप के तहत, अगारोस पैड में लगभग 5 μL 5 mM लेवामिसोल जोड़ें। लेवामिसोल कमजोर पड़ने को हर हफ्ते ताजा बनाया जाना चाहिए।
    2. कीड़े के ट्यूबों को धीरे से फ्लिक करें और 5-10 μL कीड़े को अगारोस पैड पर स्थानांतरित करें। आंख से कीड़े की संख्या का अनुमान लगाएं क्योंकि उन्हें जोड़ा जा रहा है ताकि प्रति प्रतिकृति लगभग 40 कीड़े हों।
    3. आसान स्कोरिंग के लिए आईलैश पिक का उपयोग करके पंक्तियों में कीड़े को पंक्तिबद्ध करें। एक ग्लास कवरस्लिप जोड़ें।
      नोट: इस तरह से लगाए गए जानवरों के साथ स्लाइड सूखने से पहले कई घंटों तक रह सकती है।
  6. स्लाइड ्स स्कोर करने से पहले ब्लीचिंग प्रोटोकॉल (चरण 2.3 देखें) का उपयोग करके शेष जानवरों से भ्रूण को अलग करें। 35 मिमी एनजीएम प्लेटों पर प्लेट 250 भ्रूण ओपी 50-120 के साथ बीजित हैं। एक बार तरल अवशोषित हो जाने के बाद, प्लेटों को उल्टा करें और उन्हें 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस कर दें।
  7. जीएफपी फिल्टरसेट के साथ फ्लोरेसेंस स्टीरियोस्कोप का उपयोग करें। टैली काउंटर का उपयोग करके प्रत्येक प्रतिकृति के लिए स्लाइड पर जीएफपी पॉजिटिव और जीएफपी नकारात्मक कीड़े की संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।
    नोट: जीएफपी पॉजिटिव कीड़े में उनके जर्मलाइन और गर्भाशय में भ्रूण में परमाणु जीएफपी अभिव्यक्ति होगी। जीएफपी नकारात्मक कीड़े की जर्मलाइन फ्लोरेसिस नहीं होगी, हालांकि, जैसा कि जीएफपी बाद की पीढ़ियों में वापस मुड़ना शुरू कर देता है, प्रतिदीप्ति मंद हो सकती है। किसी भी ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए अतिरिक्त गैर-ट्रांसजेनिक कृमि उपभेदों को माउंट करना सहायक हो सकता है।
  8. ब्लीचिंग द्वारा जनसंख्या को पारित करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है, लगभग हर 4 दिन (96 घंटे) 21 डिग्री सेल्सियस पर। वैकल्पिक रूप से, पासिंग सुविधा के लिए वैकल्पिक 3-दिन/4-दिवसीय शेड्यूल पर किया जा सकता है। यदि बारी-बारी से छोटी पासिंग पीढ़ियों के लिए एक अतिरिक्त ~ 50 भ्रूण प्लेट करें, क्योंकि 72 घंटे के बाद भ्रूण की कम उपज हो सकती है।
    नोट: पी0 पीढ़ी के पासिंग समय को 4 दिनों के पोस्ट-प्लेटिंग भ्रूण पर सुसंगत रखें।

4. CHIP के लिए पशु संग्रह

नोट: जानवरों की संख्या और समय तनाव, विकास ता्मक चरण, एपिटोप, और इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) लक्ष्यों की संख्या पर निर्भर करता है। नीचे दिए गए उदाहरण में, तीन आईपी के लिए जानवरों को इकट्ठा करें: एच 3 के 9 एम 3, हिस्टोन एच 3, और आईजीजी नियंत्रण। CHIP प्रोटोकॉल Askjaer et al.21 से अनुकूलित किया गया था।

  1. सीएचआईपी नमूना संग्रह से पहले, आरएनएआई वंशानुक्रम परख की पिछली पीढ़ी को अतिरिक्त तीन एनजीएम प्लेटों (प्रति प्रतिकृति कम से कम चार प्लेटों) द्वारा विस्तारित करें। 21 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए बढ़ो।
  2. भ्रूण को अलग करने के लिए गुरुत्वाकर्षण वयस्कों को ब्लीच करें (चरण 2.3 देखें)।
  3. प्रत्येक तनाव के लिए, 14 प्लेटों (250 प्रति प्लेट) पर लगभग 3,500 भ्रूण प्लेट करें और युवा वयस्क अवस्था में 21 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों तक बढ़ते रहें।
  4. जानवरों को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों में धोएं जिसमें 0.01% (वी / वी) टीएक्स -100 (पीबीएस / टीएक्स) होता है। 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एस्पिरेट करें और जानवरों को एक ट्यूब में एक स्ट्रेन से पूल करें और कम से कम 1 एमएल पीबीएस / टीएक्स के साथ तीन बार धोएं।
  5. 1,000 μL पर एस्पिरेट करें, मिश्रण करने के लिए इनवर्ट करें, और 3 μL में जानवरों की संख्या को तीन बार गिनें (चरण 2.3.9 देखें)।
  6. जानवरों की एकाग्रता की गणना करें और फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग के लिए एक नई ट्यूब में 3,000 जानवरों के अनुरूप मात्रा स्थानांतरित करें।
  7. सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा कृमि गोली की मात्रा का कम से कम 10 गुना है।

5. फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग

सावधानी: वाष्प जोखिम को रोकने के लिए फ्यूम हुड में फॉर्मलाडेहाइड के साथ काम करें।

  1. कीड़े युक्त ट्यूब में फॉर्मलाडेहाइड (1.8% अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। 6 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाएं।
  2. तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें। प्रयोग को इस चरण में रोका जा सकता है और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  3. क्रॉसलिंक किए गए नमूने को 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान वाले वाटरबाथ में पिघलाएं और कमरे के तापमान पर 16 मिनट के लिए घुमाएं।
  4. 1.25 एम ग्लाइसिन को 125 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 5 मिनट के लिए घुमाएं।
    नोट: चुंबकीय मोती क्षालन तक, नमूने को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और बर्फ-ठंडे बफर का उपयोग करें।
  5. 3 मिनट के लिए 1,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। हर बार 1 एमएल पीबीएस / टीएक्स के साथ तीन बार धोएं। 1 एमएल रिसस्पेंशन बफर (150 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस-केओएच [पीएच 7.5], 1 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड [ईडीटीए], 0.01% टीएक्स -100, प्रोटीज इनहिबिटर [एक टैबलेट प्रति 5 एमएल]) के साथ दो बार धोएं।
  6. अंतिम धोने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त बफर छोड़ दें कि कुल मात्रा पेलेट वॉल्यूम का कम से कम तीन गुना और न्यूनतम ~ 100 μL है।

6. सोनिकेशन

नोट: सोनिकेशन पैरामीटर सोनिकेटर और पशु चरण के प्रकार और मॉडल पर निर्भर करते हैं। नमूना मात्रा और एकाग्रता, चालू / बंद अंतराल, चक्रों की संख्या और पावर सेटिंग जैसे मापदंडों को अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, सोनिकेशन के समय के दौरान, प्रोटीन परख का उपयोग करके कृमि लाइसिस की निगरानी करें और निर्धारित करें कि एकाग्रता कब पठार तक पहुंचती है। इसके अलावा, जब जीनोमिक डीएनए का औसत कतरनी आकार डीएनए के वैद्युतकणसंचलन द्वारा लगभग 200-1,000 बीपी होता है, तो 1.5% अगारोस / ट्रिस-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई) जेल पर क्रॉसलिंकिंग रिवर्सल के बाद शुद्ध किया जाता है।

  1. पिछले चरण से नमूने की मात्रा को मापें। पॉलीस्टाइनिन सोनिकेशन ट्यूब में 90-120 μL मिलाएं और एलिकोट करें।
  2. 2x डिटर्जेंट (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.2% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.7% सरकोसिल) युक्त रीसस्पेंशन बफर की एक समान मात्रा जोड़ें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 50% शक्ति पर एक वॉटरबाथ सोनिकेटर में सोनिकेट करें। धीरे से पाइपिंग द्वारा मिलाएं। अतिरिक्त 7 मिनट के लिए सोनिकेशन दोहराएं।
  4. सोनिकेटेड लाइसेट को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। डिटर्जेंट के बिना रिसस्पेंशन बफर के 0.5 वॉल्यूम जोड़ें (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA) (उदाहरण के लिए, नमूने के 200 μL में 100 μL बफर जोड़ें)।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। लाइसेट सुपरनैटेंट रखें और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक लाइसेट की सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन परख करें। यह कदम बड़ी नमूना मात्रा या अंतर-परख तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, ऊपर वर्णित जानवरों की संख्या को मानकीकृत करना यहां वर्णित नमूना मात्रा के लिए अच्छी तरह से काम करता है, क्योंकि क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित क्रोमैटिन / डीएनए की उपज के साथ बेहतर सहसंबंध है।

7. इम्यूनोप्रेसिटेशन

नोट: लाइसेट की मात्रा और एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी और चुंबकीय मोतियों की मात्रा को स्केल करें।

  1. लाइसेट सुपरनैटेंट को चार भागों में विभाजित करें: प्रत्येक आईपी के लिए तीन समान वॉल्यूम और इनपुट के रूप में एक आईपी की मात्रा का 10% (उदाहरण के लिए, आईपी # 1 का 100 μL, आईपी # 2 का 100 μL, आईपी # 3 का 100 μL, इनपुट का 10 μL)। आईपी लाइसेट को 200 μL पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें और इनपुट लाइसेट को 1.5 एमएल ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. उपयुक्त आईपी नमूने में एंटी-एच 3 के 9 एम 3 एंटीबॉडी, एंटी-हिस्टोन एच 3 एंटीबॉडी, या आईजीजी के 0.5 μg जोड़ें। रोटेशन के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन, प्रोटीन जी-लेपित चुंबकीय मोतियों के 9 μL प्रति आईपी को एक एकल 1.5 एमएल ट्यूब में ले जाएं। मोतियों को 1 एमएल एफए -150 (150 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस-केओएच [पीएच 7.5], 1 एमएम ईडीटीए, 1% टीएक्स -100, 0.1% सोडियम डीऑक्सीकोलेट) के साथ दो बार धोएं।
  4. एफए -150 बफर में चुंबकीय मोतियों को ऊपर चरण 7.3 में स्टॉक से ली गई मूल मात्रा में पुन: निलंबित करें। प्रत्येक आईपी में 7.5 μL जोड़ें। रोटेशन के साथ 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

8. धोने और क्षालन

नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि चुंबकीय मोती सूख न जाएं, पिछले धोने के बाद प्रत्येक वॉश या क्षालन बफर को जल्दी से जोड़ें।

  1. मोतियों को धोने के लिए हर बार निम्नलिखित बफर समाधानों के 0.2-1 एमएल का उपयोग करें। धोने के लिए मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर इकट्ठा करें। रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक वॉश को इनक्यूबेट करें। नीचे दिए गए आदेश का पालन करें।
    1. एफए -150 के साथ दो बार धोएं।
    2. एक बार FA-1M (FA-150 के साथ 1 M NaCl) से धो लें।
    3. एक बार FA-0.5M (FA-150 के साथ 0.5 M NaCl) से धो लें। एक नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. एक बार TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% सोडियम डीऑक्सीकोलेट) से धो लें।
    5. TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 0.005% IGEPAL CA-630) के साथ दो बार धोएं।
      नोट: कमरे के तापमान पर नमूना प्रसंस्करण जारी रखें जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
  2. अंतिम वॉश बफर को एस्पिरेट करें। चुंबकीय मोतियों को 50 μL CHIP क्षालन बफर (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [SDS]) के साथ पुन: निलंबित करें और 1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. थर्मोमिक्सर में 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इल्यूट को प्रत्येक मिनट के लिए 1,000 आरपीएम पर मिश्रण के साथ मिलाएं।
  4. एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों को इकट्ठा करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. एक और 50 μL CHIP क्षालन बफर के साथ क्षालन दोहराएं। कुल 100 μL के लिए सुपरनैटेंट पूल करें। क्रॉसलिंकिंग और डीएनए एल्यूशन को रिवर्स करने के लिए आगे बढ़ें, जैसा कि नीचे बताया गया है।

9. रिवर्स क्रॉसलिंकिंग और डीएनए क्षालन

  1. इनपुट लाइसेट नमूने को पिघलाएं। सीएचआईपी क्षालन बफर के साथ 100 μL तक शीर्ष।
  2. प्रत्येक आईपी और इनपुट नमूने में RNase A के 16.5 μg जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 40 μg Proteinase K जोड़ें और 2 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. नमूने को कमरे के तापमान पर ठंडा करें और स्पिन-कॉलम किट के साथ डीएनए को शुद्ध करें।

10. क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया सेटअप और रन

नोट: प्राइमर, प्रतिक्रिया सेटअप और थर्मोसाइकलर पैरामीटर को उपयोग में क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए निर्माता की सिफारिशों से मेल खाने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए।

  1. जीएफपी आरएनएआई रिपोर्टर और एच 3 के 9 एम 3 सकारात्मक और नकारात्मक संवर्धन नियंत्रण क्षेत्रों को लक्षित करने वाले प्राइमर सेट तैयार करें। प्राइमर पिघलने का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस है। प्राइमर अनुक्रमों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. इनपुट डीएनए के लिए, चार चार गुना सीरियल कमजोर पड़ने (जैसे, 1: 5, 1: 20, 1: 80, 1: 320) बनाएं।
    नोट: अधिक प्रतिक्रियाओं की अनुमति देने के लिए आईपी डीएनए का उपयोग सीधे या पतला (जैसे, 1: 2 या 1: 3) किया जा सकता है। कमजोर पड़ने की उपयुक्तता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि क्यूपीसीआर प्रदर्शन प्रभावित हो सकता है।
  3. एक पीसीआर प्लेट पर एक प्राइमर सेट के अनुरूप सभी प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करें। प्रत्येक इनपुट डीएनए कमजोर पड़ने और प्रत्येक आईपी डीएनए नमूने के लिए तकनीकी डुप्लिकेट प्रतिक्रियाएं सेट करें। प्रत्येक 10 μL प्रतिक्रिया में इनपुट या आईपी डीएनए (या नियंत्रण के रूप में क्षालन बफर), QPCR मास्टर मिश्रण (1x अंतिम एकाग्रता), फॉरवर्ड प्राइमर और रिवर्स प्राइमर (प्रत्येक प्राइमर के लिए 400 एनएम अंतिम एकाग्रता) का 1.5 μL होता है।
  4. एक वास्तविक समय थर्मोसाइकलर पर, निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: प्रारंभिक विकृतीकरण: 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; प्रवर्धन और प्रतिदीप्ति का पता लगाना: एक प्लेट पढ़ने के साथ 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र; अंतिम विस्तार: 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; पिघल वक्र: 0.5 डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि में 60 डिग्री सेल्सियस से 90 डिग्री सेल्सियस तक, प्रति कदम 5 एस।

11. प्रवर्धन दक्षता का निर्धारण और उत्पाद विशिष्टता की पुष्टि करना

  1. इनपुट डीएनए कमजोर पड़ने के प्रत्येक सेट के लिए, चार डेटा बिंदुओं को एक्स-अक्ष पर [लॉग 10 (1/तनुकरण)] और वाई-अक्ष पर [इनपुट सीक्यू] के साथ प्लॉट करें। सबसे अच्छी फिट की रेखा की ढलान निर्धारित करें।
  2. प्रवर्धन दक्षता की गणना करें। आदर्श प्राइमर सेट को लगातार 95% -100% दक्षता प्रदर्शित करनी चाहिए।
    Equation 1
  3. जांचें कि सभी प्रतिक्रियाओं में एक तेज पिघला-वक्र शिखर होता है और एक ही प्राइमर सेट के साथ प्रतिक्रियाओं में समान पिघलने का तापमान होता है। कई चोटियां या अलग-अलग पिघलने का तापमान गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का संकेत दे सकता है।
  4. वैकल्पिक रूप से, उत्पाद बैंड आकार को सत्यापित करने के लिए कमरे के तापमान पर मानक 2% एगारोस / टीएई जेल पर प्रतिक्रियाएं चलाएं।

12. इनपुट के प्रतिशत की गणना

  1. इनपुट तनुकरण कारक की गणना करें। चूंकि आईपी लाइसेट वॉल्यूम का 10% इनपुट के रूप में बचाया गया था, इसलिए इनपुट डीएनए के 1: 5 कमजोर पड़ने के लिए कमजोर पड़ने वाला कारक 50 है।
  2. आईपी कमजोर पड़ने कारक का निर्धारण करें। यदि आईपी डीएनए को क्यूपीसीआर से पहले पतला नहीं किया जाता है, तो कमजोर पड़ने वाला कारक 1 है।
  3. कमजोर पड़ने वाले कारकों के लिए समायोजित आईपी और इनपुट के बीच सीक्यू अंतर की गणना करें।
    Equation 2
  4. इनपुट के प्रतिशत की गणना करें।
    Equation 3

Representative Results

जर्मलाइन-व्यक्त जीएफपी-हिस्टोन एच 2 बी [मेक्स -5पी:: जीएफपी-एच 2 बी:: टीबीबी -2 3'यूटीआर] 7 रिपोर्टर (चित्रा 2 ए) ले जाने वाले जानवरों को जीएफपी आरएनएआई के संपर्क में लाया गया या भोजन द्वारा आरएनएआई को नियंत्रित किया गया, और प्रोटोकॉल और चित्रा 1 में वर्णित के रूप में पारित किया गया। जर्मलाइन में परमाणु जीएफपी सिग्नल को प्रत्येक पीढ़ी में आबादी के नमूने के लिए प्रतिदीप्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मैन्युअल रूप से स्कोर किया गया था। जीएफपी आरएनएआई (चित्रा 2 बी) के साथ इलाज किए गए स्कोर किए गए पी 0 और एफ 1 जानवरों में ट्रांसजेन को चुप करना पूरी तरह से पेनेट्रेंट था। एफ 2 पीढ़ी में, जीएफपी साइलेंसिंग की विरासत का प्रदर्शन करने वाली आबादी का अनुपात लगभग 50% था। एफ 5 पीढ़ी तक, अधिकांश आबादी ने चुप कराने की विरासत नहीं दिखाई, और एफ 10 पीढ़ी तक, कोई विरासत का पता नहीं चला, क्योंकि सभी जानवरों ने जीएफपी व्यक्त किया था।

आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग के अनुरूप हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 संवर्धन में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए, जीएफपी आरएनएआई या नियंत्रण आरएनएआई उपचार के बाद एफ 1 पीढ़ी के जानवरों पर सीएचआईपी-क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, जीएफपी आरएनएआई-उपचारित आबादी ने नियंत्रित आरएनएआई-उपचारित जानवरों की तुलना में जीएफपी लक्ष्य पर और 1.3 केबी डाउनस्ट्रीम क्षेत्र में उच्च हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 स्तर प्रदर्शित किए (चित्रा 2 सी)। हिस्टोन H3K9me3 CHIP की विशिष्टता एक सकारात्मक नियंत्रण स्थान (clec-18) पर संवर्धन द्वारा समर्थित है, जिसे इस निशान में समृद्ध होने के लिए जाना जाता है, लेकिन पास के नकारात्मक नियंत्रण स्थान (hrp-2) पर नहीं। आईजीजी नियंत्रण इम्यूनोप्रेसिट्रेशन में हिस्टोन एच 3 संवर्धन और निकट-पृष्ठभूमि संवर्धन भी सभी क्यूपीसीआर लोकी पर पाया गया था, जैसा कि अपेक्षित था। जब रिपोर्टर में सीएचआईपी संवर्धन को क्लेक -18 सकारात्मक नियंत्रण स्थान के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, तो जीएफपी आरएनएआई पर उच्च हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 संवर्धन दिखाया जाता है, जबकि हिस्टोन एच 3 संवर्धन नियंत्रण और जीएफपी आरएनएआई उपचार (चित्रा 2 डी) के बीच समान होता है। चूंकि जीएफपी आरएनएआई से क्लेक -18 लोकस में हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 या कुल हिस्टोन एच 3 अधिभोग को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है, इसलिए यह सामान्यीकरण तकनीकी भिन्नता के खिलाफ कम करता है, जैसे कि जीएफपी आरएनएआई और नियंत्रण आरएनएआई नमूनों के बीच सीएचआईपी दक्षता में अंतर। आरएनएआई उपचारों के बीच हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 और हिस्टोन एच 3 स्तरों का गुना-परिवर्तन जीएफपी रिपोर्टर-विशिष्ट हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 संवर्धन को दर्शाता है, जो जीएफपी आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग (चित्रा 2 ई) पर हिस्टोन अधिभोग से स्वतंत्र है।

Figure 2
चित्रा 2: जीएफपी आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग आरएनएआई लक्ष्य पर ऊंचा एच 3 के 9 एम 3 संवर्धन से मेल खाती है। (ए) जर्मलाइन-व्यक्त जीएफपी आरएनएआई रिपोर्टर एमजेआईएस 134 [मेक्स-5पी:: जीएफपी-एच 2 बी:: टीबीबी -2 3'यूटीआर] का आरेख जिसमें क्यूपीसीआर एम्प्लिकॉन क्षेत्रों को लेबल किया गया है। (बी) जीएफपी अभिव्यक्ति 21 डिग्री सेल्सियस पर आरएनएआई उपचार के बाद पीढ़ियों में स्कोर की गई। त्रुटि पट्टियाँ दो जैविक प्रतिकृतियों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) दो जैविक प्रतिकृतियों से एफ 1 युवा वयस्कों में एच 3 के 9 एम 3, हिस्टोन एच 3 और आईजीजी नियंत्रण के सीएचआईपी-क्यूपीसीआर। सीएलईसी -18 और एचआरपी -2 क्रमशः एच 3 के 9 एम 3 संवर्धन के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण लोकी हैं। (डी) जीएफपी आरएनएआई रिपोर्टर में एच 3 के 9 एम 3 और हिस्टोन एच 3 संवर्धन सीएलईसी -18 सकारात्मक नियंत्रण स्थान के लिए सामान्यीकृत है। (ई) जीएफपी आरएनएआई- और नियंत्रण आरएनएआई-उपचारित जानवरों के बीच एच 3 के 9 एम 3 और हिस्टोन एच 3 संवर्धन में परिवर्तन, सीएलईसी -18 के सामान्यीकरण के साथ। डॉटेड लाइन 1 के फोल्ड-परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, डीएसआरएनए को खिलाकर पेश किया जाता है, जो सी एलिगेंस18 में एक मानक विधि बन गया है। आरएनएआई वंशानुक्रम परख के लिए, भोजन दृष्टिकोण 2,11,12,22,23,24,25 की बड़ी पी 0 आबादी प्राप्त करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है। हालांकि, आरएनएआई एक्सपोजर का समय और अवधि ट्रांसजेन साइलेंसिंग26 की प्रभावकारिता को प्रभावित करती है, और आरएनएआई बैक्टीरिया की एकाग्रता हेरिटेबल आरएनएआई साइलेंसिंग1 की दृढ़ता को प्रभावित करती है। इसलिए, मानकीकृत आरएनएआई बैक्टीरिया और कृमि वृद्धि जीएफपी साइलेंसिंग और वंशानुक्रम की अवधि के एक सुसंगत स्तर को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, भ्रूण को आरएनएआई प्लेटों पर चढ़ाया जाता है ताकि पी 0 जानवर सेने से आरएनएआई बैक्टीरिया के संपर्क में आ सकें। वैकल्पिक तरीकों ने आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ किए गए एल 1 24,27 या एल 425 चरण जानवरों को चढ़ाया है। इसके अलावा, चूंकि भुखमरी और अन्य तनाव आरएनएआई वंशानुक्रम13 के रखरखाव को प्रभावित करते हैं, इसलिए खाद्य आपूर्ति की भीड़भाड़ और थकावट को रोकने के लिए प्लेटों की निगरानी की जानी चाहिए। भोजन द्वारा आरएनएआई शुरू करने के विकल्प के रूप में, कुछ अग्रणी सी एलिगेंस आरएनएआई वंशानुक्रम अध्ययनों ने गोनैड इंजेक्शन के माध्यम से आरएनएआई को प्रेरित किया, जो डीएसआरएनए एकाग्रता 1,28 का अधिक नियंत्रण प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल में, प्रत्येक पीढ़ी को क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार के साथ आबादी के रूप में पारित किया जाता है, जैसा कि पहले वर्णित 16,22,23,24 था। हाइपोक्लोराइट उपचार यह सुनिश्चित करता है कि एफ 1 पीढ़ी माता-पिताके वातावरण से आरएनएआई बैक्टीरिया से दूषित नहीं होगी और संभावित अवांछित आबादी की बोतल-गर्दन को रोकती है। हालांकि, थोक पासिंग भी एक सीमा हो सकती है, क्योंकि व्यक्तिगत जानवरों में अलग-अलग वंशानुक्रम पैटर्न 1,29 हो सकते हैं। प्रत्येक पीढ़ी को स्थापित करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका 1,2,9,11,25 व्यक्तिगत जानवरों का चयन करना है। यह दृष्टिकोण वंशावली के भीतर फेनोटाइप्स को ट्रैक करने और आनुवंशिक क्रॉस के समावेश की अनुमति देता है। वंश विश्लेषण कम पेनेट्रेंस फेनोटाइप12 के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग 2,3,4,12,14,15,16,25,30 का एक शक्तिशाली और सुविधाजनक रीडआउट है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, जीएफपी अभिव्यक्ति को मैन्युअल रूप से ऑन या ऑफ 11,12,15,16,25 के रूप में स्कोर किया जा सकता है। गुणात्मक तीव्रता स्तर 3,4,14 निर्दिष्ट करके मैनुअल स्कोरिंग को और परिष्कृत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोपी छवियों 11,12,14,25,27 की स्वचालित तीव्रता स्कोरिंग या जीवित जानवरों के फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस माप 2 एक मात्रात्मक और उच्च-थ्रूपुट रीडआउट प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, चूंकि रिपोर्टर अभिव्यक्ति जर्मलाइन तक ही सीमित है, इसलिए स्वचालित दृष्टिकोणों की एक चेतावनी यह है कि उन्हें खामोश जीएफपी अभिव्यक्ति वाले जानवरों बनाम बिना जर्मलाइन वाले जानवरों के बीच भी अंतर करना चाहिए, खासकर अगर अध्ययन में असामान्य जर्मलाइन विकास वाले उत्परिवर्ती शामिल हैं। जीएफपी प्रतिदीप्ति के विकल्प के रूप में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी)-क्यूपीसीआर का उपयोग आरएनएआई लक्ष्य प्री-एमआरएनए और एमआरएनए स्तर 2,16,23,24 को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण साइलेंसिंग का अधिक प्रत्यक्ष रीडआउट प्रदान करता है, जो आरएनए को लक्षित करता है, और विशेष रूप से अन्य आरएनएआई लक्ष्यों के लिए उपयोगी है जहां साइलेंसिंग एक दृश्यमान फेनोटाइप का उत्पादन नहीं करता है। कृत्रिम जीएफपी संवाददाताओं का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि बहिर्जात और अंतर्जात अनुक्रम ों को ट्रांसजेनरेशनल आरएनएआई11 में अलग-अलग विनियमित किया जाता है। अंतर्जात लक्ष्यों के साथ अध्ययन, जैसे कि तापमान-संवेदनशील भ्रूण घातक एलील ओमा -1 (zu405)1,11,16,25, इसलिए फ्लोरोसेंट ट्रांसजेन संवाददाताओं के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में माना जाना चाहिए।

आरएनएआई वंशानुक्रम परख के संदर्भ में सीएचआईपी के विश्लेषण के लिए उपचार और प्रतिकृति के बीच तुलना की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, नमूनों के बीच प्रारंभिक सामग्री में अंतर के लिए, सीएचआईपी सिग्नल को 'इनपुट के प्रतिशत' के समान स्थान पर इनपुट सिग्नल के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। समानांतर में हिस्टोन एच 3 सीएचआईपी को संसाधित करने से यह निर्धारित करने में मदद मिलेगी कि क्या कोई हिस्टोन संशोधन परिवर्तन न्यूक्लियोसोम घनत्व में परिवर्तन के अनुरूप है। इसके अलावा, क्योंकि CHIP एक बहु-चरण प्रक्रिया है, दक्षता नमूनों के बीच भिन्न हो सकती है। उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण लोकी का चयन नमूने और प्रयोगों के बीच सिग्नल-टू-शोर अनुपात का मूल्यांकन और तुलना करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, नमूनों के बीच तुलना की सुविधा के लिए, आरएनएआई लक्ष्य पर सीएचआईपी डीएनए क्यूपीसीआर थ्रेशोल्ड चक्र मान अक्सर 3,11,15,23,30,31 के नियंत्रण स्थान तक सामान्यीकृत होते हैं। आरएनएआई उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, उपचार आरएनएआई बनाम नियंत्रण या कोई आरएनएआई स्थितियों में सीएचआईपी सिग्नल के अनुपात की भी तुलना की जाती है। वर्तमान दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि सीएचआईपी पूरे जानवरों के साथ किया जाता है, जबकि आरएनएआई उपचार की प्रतिक्रिया जर्मलाइन के लिए अद्वितीय हो सकती है। इस चेतावनी को दूर करने का एक तरीका पृथक जर्मलाइन नाभिक का उपयोग करके सीएचआईपी करना है। CHIP को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त तकनीकी विचारों पर भी कहीं और बड़े पैमाने पर चर्चा की गईहै।

कुल मिलाकर, यह आरएनएआई वंशानुक्रम और सीएचआईपी प्रोटोकॉल एक विस्तृत और आसानी से अनुकूलन नींव प्रदान करता है जिसे ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक विनियमन का पता लगाने के लिए अन्य तकनीकों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण सीएचआईपी डीएनए (सीएचआईपी-सेक) से आरएनएआई लक्ष्य के समीपस्थ और जीनोम-व्यापक पैमाने पर क्रोमैटिन परिदृश्य के अधिक विस्तृत दृश्य के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

सभी लेखक पुष्टि करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

एलिगेंस समुदाय में प्रयोगशालाओं को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने उपकरणों को विकसित और साझा किया और जिनके काम को इस पांडुलिपि में उद्धृत किया गया है। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। इस काम को एएलएस (पीजेटी -175245) को कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सीएल कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (पीजीएस-डी) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Bioshop AGA002
Ampicillin Bioshop AMP201 Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab8898 Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab1791 Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).
Bleach (6% Sodium hypochlorite) Lavo 02358107
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter NA SX1263 Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.
Carbenicillin BioShop CAR544 Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Dynabeads Protein G Magnetic Beads Invitrogen 10003D
E. coli strain HT115(DE3) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) HT115(DE3)
E. coli strain OP50-1 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50-1
EDTA (0.5 M, pH 8.0) Invitrogen 15575020
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Formaldehyde (37%) Sigma F8775
Glycine Sigma 50046 Make a 1.25 M solution and store at 4 °C.
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) Teknova H1035
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells VWR 100488-904
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) BioShop NON999 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) BioShop IPT001 Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725122
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin NA NA Standard lab recipe.
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) Sigma L9756 Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C.
LiCl (8 M) Sigma L7026
M9 Buffer NA NA 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) Applied Biosystems A13346
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) Permagen MSR812
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12541B
Microscope Slide Technologist Choice LAB-037
NaCl (5 M) Promega V4221 For ChIP buffers.
NaOH  Sigma S5881 Make a 10 M solution and store at room temperature.
NGM Plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin.
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) Cell Signaling Technology 2729
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) Sarstedt 82.1135.500
Phosphate Buffered Saline (10X) Fisher BioReagents BP3991
Plasmid - Control RNAi  Addgene L4440 (Plasmid #1654)
Plasmid - GFP-targetting RNAi  Addgene L4417 (Plasmid #1649) Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Primer pair [clec-18] Integrated DNA Technologies NA F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
Primer pair [gfp exon 1] Integrated DNA Technologies NA F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Primer pair [gfp exon 4] Integrated DNA Technologies NA F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Primer pair [hrp-2] Integrated DNA Technologies NA F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 11836170001
Proteinase K  Bioline BIO-37084
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104
Real-Time PCR Detection System Bio-Rad CFX96 
RNAi-NGM plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.
RNase A Sigma R4642
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma L5777 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
SDS Sigma 74255 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.
Sodium deoxycholate Sigma 30970 Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
Sonication Tube Evergreen 214-3721-010
Sonication Tube Cap Evergreen 300-2911-020
Sonicator Qsonica Q800R3-110
Streptomycin sulfate Bioshop STP101 Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
TAE buffer (1X) NA NA 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA
Tally counter clicker Uline H-7350
Tetracycline Bioshop TET701 Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C.
Thermomixer Eppendorf 05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Invitrogen 15568025
Triton X-100 Sigma T8787 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.

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References

  1. Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
  2. Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
  3. Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
  4. Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882 (2006).
  5. Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
  6. Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
  7. Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).
  8. Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
  9. Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
  10. Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
  11. Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448 (2019).
  12. Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
  13. Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797 (2021).
  14. Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
  15. Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
  16. Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
  17. Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
  18. Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
  19. Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  21. Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
  22. Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
  23. Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6 (2017).
  24. Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
  25. Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
  26. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  27. Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
  28. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
  29. Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
  30. Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
  31. Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
  32. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  33. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).

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एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) का उपयोग करके <em>सी एलिगेंस</em> में ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक इनहेरिटेंस का विश्लेषण
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Li, C., Bhagoutie, P. A. W., Lao, V., Saltzman, A. L. Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). J. Vis. Exp. (195), e65285, doi:10.3791/65285 (2023).

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