Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Analyse av transgenerasjonell epigenetisk arv i C. elegans ved bruk av en fluorescerende reporter og kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP)

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65285
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en RNA-interferens og ChIP-analyse for å studere epigenetisk arv av RNAi-indusert silencing og tilhørende kromatinmodifikasjoner i C. elegans.

Abstract

Transgenerasjonell epigenetisk arv (TEI) tillater overføring av informasjon gjennom kimlinjen uten å endre genomsekvensen, gjennom faktorer som ikke-kodende RNA og kromatinmodifikasjoner. Fenomenet RNA-interferens (RNAi) arv i nematoden Caenorhabditis elegans er en effektiv modell for å undersøke TEI som utnytter denne modellorganismens korte livssyklus, selvutbredelse og gjennomsiktighet. I RNAi-arv fører eksponering av dyr for RNAi til genaktivering og endrede kromatinsignaturer ved målstedet som vedvarer i flere generasjoner i fravær av den første utløseren. Denne protokollen beskriver analysen av RNAi-arv i C. elegans ved hjelp av en germline-uttrykt kjernefysisk grønt fluorescerende protein (GFP) reporter. Reporter-silencing initieres ved å mate dyrene med bakterier som uttrykker dobbeltstrenget RNA rettet mot GFP. Ved hver generasjon passeres dyr for å opprettholde synkronisert utvikling, og reportergenaktivering bestemmes ved mikroskopi. Ved utvalgte generasjoner samles populasjoner og behandles for kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP)-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) for å måle histonmodifikasjonsanrikning ved GFP-reporterlokuset. Denne protokollen for å studere RNAi-arv kan enkelt modifiseres og kombineres med andre analyser for å undersøke TEI-faktorer i små RNA- og kromatinveier.

Introduction

Epigenetisk arv tillater overføring av genreguleringsinformasjon over generasjoner og kan derfor tillate foreldrenes miljø eller erfaringer å påvirke deres avkom. I C. elegans kan germline-genaktivering initiert av eksogent dobbeltstrenget RNA (dsRNA) arves i flere generasjoner i avkom som ikke er utsatt for den opprinnelige utløseren 1,2,3,4. Denne prosessen, kalt RNA-interferens (RNAi) arv, er et av flere relaterte epigenetiske silencing fenomener i C. elegans, inkludert piRNA-initiert multigenerasjonell silencing 2,5, paramutasjon / RNAe (RNA-indusert epigenetisk silencing) 6,7,8 og multicopy array-initiert silencing9, som har overlappende, men forskjellige krav til små RNA- og kromatinreguleringsmaskiner . I C. elegans eksogene RNAi blir dsRNA behandlet i små forstyrrende RNA (siRNAer) som virker i et kompleks med primære Argonaute-proteiner for å gjenkjenne deres mål-mRNA. Denne målrettingen fører til forsterkning av sekundære siRNA som assosierer med sekundære argonauter for å dempe mål-mRNA gjennom både cytoplasmatiske og nukleære silencingveier. For germline-uttrykte RNAi-mål retter de kjernefysiske sekundære Argonaute HRDE-1 og ytterligere nukleære RNAi-faktorer seg mot begynnende transkripsjoner, noe som resulterer i transkripsjonell undertrykkelse og rekruttering av histonmetyltransferaser for å deponere repressive kromatinmerker, inkludert H3K9me310. Histon H3K9me3 fremmer etableringen av arvelig silencing av germline-uttrykt grønt fluorescerende protein (GFP) transgener ved RNAi-arv11,12.

Målet med denne protokollen er å bruke et transgen som uttrykker et GFP-histonfusjonsprotein i kimlinjen som reporter for RNAi-arv og å analysere endringer i histonmodifikasjoner ved reportertransgen-lokuset ved bruk av kromatinimmunopresipitasjon og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (ChIP-qPCR). Denne protokollen beskriver en standardisert platebasert RNAi-fôringsmetode for å starte deaktivering av reporteren. Det gir også en detaljert tidslinje for passering av dyr mellom generasjoner ved å isolere embryoer in utero fra gravide voksne ved alkalisk hypoklorittbehandling ("bleking"). Metoder og representative data for overvåking av frekvensen av GFP-inaktivering i en undergruppe av populasjonen ved fluorescensmikroskopi og for histon H3K9me3 ChIP-qPCR er også beskrevet. Reporterbaserte RNAi-arveanalyser gir et svært håndterbart system for funksjonelt å dissekere rollene til genetiske og miljømessige faktorer i epigenetisk regulering 13,14, og genetiske skjermer ved hjelp av slike reportere har identifisert både gener som kreves for 2,3,15 og gener som negativt regulerer16,17 varigheten av transgenerasjonell epigenetisk arv.

Protocol

MERK: En analysetidslinje er gitt i figur 1.

1. Fremstilling av RNAi nematode vekstmedium (RNAi-NGM) plater

  1. Strek ut E. coli HT115(DE3) som inneholder enten GFP eller kontroll-RNAi-vektorer fra glyserolbestander på Luria-Bertani (LB) agarplater supplert med 100 μg/ml ampicillin. Inkuber bakteriene over natten ved 37 °C.
  2. Dagen etter klargjør du RNAi-NGM-plater (1,7 % [w/v] agar, 0,3 % [w/v] NaCl, 0,25 % [w/v] pepton, 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM kaliumfosfatbuffer [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 μg/ml karbenicillin og 5 mM isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid [IPTG]) i henhold til standardprotokollen18.
    1. For hver stamme i analysen, utarbeide minst seks RNAi-NGM-plater sådd med GFP RNAi (to plater for hver av de tre biologiske replikatene) og to RNAi-NGM-plater sådd med kontroll-RNAi (en biologisk replikat).
    2. Telt tallerkenene løst med folie for å beskytte mot lys og la dem stå over natten ved romtemperatur for å tørke.
  3. På samme dag som RNAi-NGM-platehelling, lag 4 ml flytende kulturer av RNAi-bakterier.
    1. Under sterile forhold ble aliquot 4 ml LB-buljong tilsatt 10 μg/ml tetracyklin og 100 μg/ml ampicillin i dyrkningsrør. Plukk enkeltkolonier fra LB-agarplatene inn i hvert rør og rug over natten mens du rister i ca. 16 timer ved 37 °C.
  4. Frø RNAi-bakterier på RNAi-NGM-platene.
    1. Etter vekst over natten måles den optiske tettheten (OD600) av kulturer ved hjelp av en 1: 5 fortynning av bakterier med LB-buljong.
    2. Fortynn RNAi-bakterier til en relativ OD 600 av 2 ved bruk av LB-buljong supplert med 10 μg / ml tetracyklin og100 μg / ml ampicillin.
    3. Under sterile forhold, tilsett 150 μL av kontroll- eller GFP RNAi-bakteriene på hver RNAi-NGM-plate.
    4. Telt platene med folie og la bakteriene vokse i minst 24 timer ved romtemperatur før bruk.
      MERK: Ubrukte RNAi-NGM-plater kan oppbevares invertert i opptil 1 uke ved 4 °C i en lukket beholder i mørket.

2. Starte RNAi-arveanalysen: bleking og plating av embryoer for P0-generasjonen

MERK: Før du starter RNAi-arveanalysen, bør ormer som inneholder GFP-reporteren mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 opprettholdes uten sult ved 21 °C i minst to generasjoner.

  1. Ved 4 dager (96 timer) før starten av RNAi-arveanalysen (figur 1), velg tre eller fire gravide voksne på hver 35 mm standard NGM-plate sådd med OP50-1-bakterier.
    MERK: Tre NGM-plater per stamme er tilstrekkelig. For stammer med nedsatt fruktbarhet kan det være nødvendig med mer enn fire dyr per tallerken.
  2. Etter 4 dager, sørg for at den voksne befolkningen har begynt å legge embryoer på tallerkenen. Vask ormene av platene i 1,5 ml rør med 800 μL M9-buffer supplert med Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1mM MgSO 4, 0,01% (v / v) TX-100). Gjenta vasken og bassenget i samme rør.
  3. Isoler embryoene fra populasjonen ved bleking som følger.
    1. Forbered en blekeoppløsning med blekemiddel (6% natriumhypokloritt) og 10 N NaOH i et volumforhold på 1,5:1. Forbered en tilstrekkelig mengde slik at 250 μL kan brukes for hver prøve.
    2. Sentrifuger 1,5 ml rørene med ormene ved 1000 x g i 1,5-2 min.
    3. Aspirer supernatanten, og etterlater 100 μL uten å forstyrre ormens pellet. Alternativt kan rørene stå i ca 2 min for å la ormene sette seg før aspirasjon.
    4. Tilsett 650 μL ddH2O til hvert rør for å oppnå et endelig volum på 750 μL.
      MERK: Følgende trinn er tidssensitive.
    5. Tilsett 250 μL av blekeløsningen til hvert rør og start en timer.
    6. Hver 1-2 min, virv rørene grundig. Etter 5 minutter, sjekk ormene under stereoskopet for å overvåke nedbrytningen av voksne.
    7. Fortsett vortexing til ormene er helt oppløst og bare embryoer forblir. Sentrifuger rørene umiddelbart ved 1000 x g i 1,5 min.
      MERK: Bleking er vanligvis fullført innen 6-7 minutter, men bør overvåkes under et stereoskop ved en forstørrelse som er tilstrekkelig til å observere de frigjorte embryoene (40x). Ikke la ormene ligge i blekemiddel i lengre tid, da dette vil kompromittere embryoene.
    8. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten og la det stå ca. 50-100 μL. Tilsett 1 ml M9-buffer med TX-100 for å vaske og blande ved vortexing. Sentrifuge igjen på 1000 x g i 1,5-2 min og vask minst to ganger til.
    9. Aspirer supernatanten fra den endelige vasken og la det være ca. 100 μL i røret. Bland med vortexing. Pipett 2 μL fra hvert rør to ganger på et merket glassglass. Tell embryoene ved hjelp av en tellteller for å estimere konsentrasjonen av embryoer per mikroliter.
      MERK: Lysbilder med flere frostede brønner kan brukes her til å telle replikater av flere stammer. Telling av lysbilder kan vaskes og gjenbrukes.
  4. For å starte en semi-synkronisert populasjonsvekst, bland og pipett et volum som inneholder 250 embryoer på hver RNAi-NGM-plate. Bruk to plater for hver replikasjon. La væsken absorbere.
  5. For P0-generasjonen behandlet med RNAi, inkuber ved 21 °C i 4 dager (96 timer) (fra embryoer til voksen alder). Tidspunktene kan variere med genotype.

Figure 1
Figur 1: RNAi arveanalyse skjematisk. Foreslått tidslinje for RNAi-NGM plateklargjøring og RNAi-arveanalyseoppsett. Gravide voksne plukkes på dag -4 på NGM-tallerkener sådd med OP50-1. Etter 4 dager blekes voksne avkom og embryoer belegges på RNAi-NGM-plater. P0-generasjonen utsettes for RNAi i 4 dager ved 21 °C. Når ormene når voksen alder, blir replikater passert ved bleking og scoret for germline GFP-uttrykk hver generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Passaging og scoring hver generasjon for germline GFP-uttrykk

MERK: For å lette scoring, bruk en vinylplate for å lage agaroseputer med lineære rygger for å stille opp ormene. Denne metoden ble tilpasset fra Rivera Gomez og Schvarzstein19.

  1. Tilbered 1 % (w/v) agarose ved å løse opp agarose i ddH2O i en liten kolbe ved oppvarming i mikrobølgeovn. Tilsett en rørestang og dekk med folie. Ved omsmelting varmer du agarosen på en kokeplate ved 200 °C under omrøring. Når den er smeltet, reduser du varmen til 80 °C.
  2. Vask ormene av NGM-platene med 800 μL M9-buffer med TX-100 i et 1,5 ml rør. Vask platene to ganger for å fjerne alle gravide voksne. Sjekk platene under stereoskopet for å bekrefte at dyrene har blitt samlet effektivt.
  3. Sentrifuge rørene ved 1000 x g i 1,5-2 min eller la ormer slå seg ned i 2 minutter. Aspirer supernatanten og la det være 100 μL uten å forstyrre ormens pellet.
  4. Forbered agaroseputer for montering av ormene som følger.
    1. Legg en dråpe smeltet 1% (w / v) agarose på vinylplaten (beskrevet tidligere19) ved hjelp av en glass Pasteur pipette (med den smale enden brutt av).
    2. Orienter et glassglass slik at linjene på platen er enten horisontale eller vertikale, og plasser lysbildet raskt på agarosedråpen. Vent ca. 30 s før du fjerner glassglasset fra posten.
      MERK: Hvis du scorer flere genotyper, kan det være nyttig å lage en større agarosepute på ett lysbilde og kutte den i to ved hjelp av et blad.
  5. Monter ormene på agaroseputene.
    1. Under stereoskopet, tilsett ca. 5 μL 5 mM levamisol til agaroseputen. Levamisolfortynningen skal gjøres frisk hver uke.
    2. Flikk forsiktig ormene for å blande og overfør 5-10 μL ormer på agaroseputen. Beregn antall ormer etter øye når de legges til, slik at det er omtrent 40 ormer per replikat.
    3. Still opp ormene i rader ved hjelp av en øyenvippe plukke for enklere scoring. Legg til et glassdeksel.
      MERK: Lysbilder med dyr montert på denne måten kan vare i flere timer før de tørker ut.
  6. Isoler embryoene fra de gjenværende dyrene ved hjelp av blekeprotokollen (se trinn 2.3) før du skårer lysbildene. Plate 250 embryoer på 35 mm NGM-plater sådd med OP50-120. Når væsken er absorbert, snu platene og returner dem til 21 ° C inkubatoren.
  7. Bruk et florescence stereoskop med et GFP-filtersett. Telle og registrere antall GFP positive og GFP negative ormer på lysbildene for hver replikere ved hjelp av en telleteller.
    MERK: GFP-positive ormer vil ha kjernefysisk GFP-uttrykk i deres kimlinje og embryoer i utero. Kimlinjene til GFP-negative ormer vil ikke fluoresceres, men da GFP begynner å slå seg PÅ igjen i senere generasjoner, kan fluorescensen være svak. Det kan være nyttig å montere flere ikke-transgene ormstammer for å ta hensyn til eventuell autofluorescens som observeres.
  8. Passere befolkningen ved bleking, som beskrevet ovenfor, ca. hver 4. dag (96 t) ved 21 °C. Alternativt kan passasje gjøres på en vekslende 3-dagers / 4-dagers tidsplan for enkelhets skyld. Plate en ekstra ~ 50 embryoer for kortere passerende generasjoner hvis vekslende, da det kan være et lavere utbytte av embryoer etter 72 timer.
    MERK: Hold P0-generasjonens passeringstid konsistent på 4 dager etter plating av embryoer.

4. Dyresamling for ChIP

MERK: Antall dyr og timing avhenger av belastning, utviklingsstadium, epitop og antall immunutfellingsmål (IP). I eksemplet nedenfor samler du dyr for tre IP-adresser: H3K9me3, histon H3 og IgG-kontroll. ChIP-protokollen ble tilpasset fra Askjaer et al.21.

  1. Før ChIP-prøveinnsamling, utvider du forrige generasjon av RNAi-arveanalysen med ytterligere tre NGM-plater (til minst fire plater per replikat). Dyrk i 4 dager ved 21 °C.
  2. Blekemiddel de gravide voksne for å isolere embryoene (se trinn 2.3).
  3. For hver stamme, plate ca. 3,500 embryoer på 14 plater (250 per plate) og vokse i 3 dager ved 21 ° C til det unge voksne stadiet.
  4. Vask dyrene i 1,5 ml rør med fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,01 % (v/v) TX-100 (PBS/TX). Sentrifuge ved 1000 x g i 2 min. Aspirer og samle dyrene fra en stamme i ett rør og vask tre ganger til med minst 1 ml PBS / TX.
  5. Aspirer til 1000 μL, inverter for å blande, og tell antall dyr i 3 μL tre ganger (se trinn 2.3.9).
  6. Beregne konsentrasjonen av dyr og overføre et volum tilsvarende 3000 dyr til et nytt rør for tverrbinding av formaldehyd.
  7. Sørg for at totalvolumet er minst 10 ganger ormepelletsvolumet.

5. Formaldehyd tverrbinding

FORSIKTIG: Arbeid med formaldehyd i en avtrekkshette for å forhindre dampeksponering.

  1. Tilsett formaldehyd (1,8% endelig konsentrasjon) til røret som inneholder ormene. Roter ved romtemperatur i 6 minutter.
  2. Frys umiddelbart i flytende nitrogen. Forsøket kan settes på pause på dette trinnet, og prøvene kan lagres ved -80 °C.
  3. Tine den tverrbundne prøven i et vannbad i romtemperatur i 3 minutter og roter i 16 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett 1,25 M glycin til en endelig konsentrasjon på 125 mM og roter i 5 minutter.
    MERK: Inntil magnetisk dråpeeluering, hold prøvene på is eller ved 4 ° C og bruk iskalde buffere.
  5. Sentrifuger prøven ved 1000 x g i 3 minutter. Vask tre ganger med 1 ml PBS/TX hver gang. Vask to ganger med 1 ml resuspendasjonsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA], 0,01 % TX-100, proteasehemmer [én tablett per 5 ml]).
  6. Etter siste vask, la det være nok buffer for å sikre at totalvolumet er minst tre ganger pelletsvolumet og minimum ~100 μL.

6. Sonikering

MERK: Sonikeringsparametere avhenger av type og modell av sonikator og dyrestadium. Parametere som prøvevolum og konsentrasjon, av/på-intervaller, antall sykluser og effektinnstilling må optimaliseres empirisk. For eksempel, over et tidsforløp av sonikering, overvåke ormlyse ved hjelp av en proteinanalyse og bestemme når konsentrasjonen når et platå. I tillegg må du overvåke når den gjennomsnittlige skjærstørrelsen til det genomiske DNA er ca. 200-1000 bp ved elektroforese av DNA, renset etter kryssbindingsreversering, på en 1,5% agarose / tris-acetat-EDTA (TAE) gel.

  1. Mål volumet av prøver fra forrige trinn. Bland og aliquot 90-120 μL til et polystyren sonikeringsrør.
  2. Tilsett et likt volum resuspensjonsbuffer inneholdende 2x vaskemidler (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2 % natriumdeoksykolat, 0,7 % sarkosyl).
  3. Sonikere i et vannbad sonikator ved 50% effekt i 7 min (20 s på / 40 s av) ved 4 ° C. Bland forsiktig med pipettering. Gjenta sonikeringen i ytterligere 7 minutter.
  4. Overfør sonikert lysat til et 1,5 ml rør. Tilsett 0,5 volum resuspensjonsbuffer uten vaskemidler (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (tilsett f.eks. 100 μL buffer til 200 μL prøve).
  5. Sentrifuge ved 13 000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Hold lysatsupernatanten og overfør til et nytt rør.
  6. Eventuelt utføre en proteinanalyse for å bestemme konsentrasjonene av hvert lysat. Dette trinnet kan være nyttig for store utvalgsmengder eller sammenligninger mellom analyser. Standardisering av antall dyr som beskrevet ovenfor fungerer imidlertid bra for prøvemengdene beskrevet her, siden det er bedre korrelasjon med utbyttet av kromatin / DNA som bestemt av qPCR.

7. Immunutfelling

MERK: Skala mengden antistoff og magnetiske perler til volumet og konsentrasjonen av lysat.

  1. Del lysatsupernatanten i fire deler: tre like store volumer for hver IP og 10% av en IPs volum som inngangen (f.eks. 100 μL IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL inngang). Overfør IP-lysatet til et 200 μL PCR-rør og oppbevar inngangslysatet ved -20 °C i et 1,5 ml rør.
  2. Legg til 0,5 μg anti-H3K9me3-antistoff, antihiston H3-antistoff eller IgG til den aktuelle IP-prøven. Inkuber ved 4 °C over natten med rotasjon.
  3. Neste dag, aliquot 9 μL protein G-belagt magnetiske perler per IP til et enkelt 1,5 ml rør. Vask kulene to ganger med 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% natriumdeoksykolat).
  4. Resuspender magnetkulene i FA-150-bufferen til det opprinnelige volumet hentet fra lageret i trinn 7.3 ovenfor. Legg til 7,5 μL til hver IP. Inkuber ved 4 °C i 2 timer med rotasjon.

8. Vask og eluering

NOTAT: For å sikre at magnetkulene ikke tørker, tilsett hver vaske- eller elueringsbuffer raskt etter at du har aspirert forrige vask.

  1. Bruk 0,2-1 ml av følgende bufferløsninger hver gang for å vaske perlene. Samle perlene på et magnetisk stativ for å aspirere vaskene. Inkuber hver vask ved 4 °C i 5 minutter med rotasjon. Følg rekkefølgen nedenfor.
    1. Vask to ganger med FA-150.
    2. Vask en gang med FA-1M (FA-150 med 1 M NaCl).
    3. Vask en gang med FA-0.5M (FA-150 med 0,5 M NaCl). Overfør til et nytt PCR-rør.
    4. Vask én gang med TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1 % IGEPAL CA-630, 1 % natriumdeoksykolat).
    5. Vask to ganger med TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
      MERK: Fortsett prøvebehandlingen ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
  2. Aspirer den siste vaskebufferen. Resuspender magnetkulene med 50 μL ChIP-elueringsbuffer (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1 % natriumdodecylsulfat [SDS]) og overfør til et 1,5 ml rør.
  3. Elute ved 65 °C i 15 minutter i en thermomixer med blanding ved 1000 o / min i 5 s hvert minutt.
  4. Samle perlene på et magnetisk stativ og overfør supernatanten til et nytt rør.
  5. Gjenta elueringen med ytterligere 50 μL ChIP-elueringsbuffer. Slå sammen supernatantene for totalt 100 μL. Fortsett til omvendt tverrbinding og DNA-eluering, som beskrevet nedenfor.

9. Omvendt tverrbinding og DNA-eluering

  1. Tine Input-lysatprøven. Fyll på opptil 100 μL med ChIP-elueringsbuffer.
  2. Legg til 16,5 μg RNase A til hver IP- og Input-prøve. Inkuber ved 37 °C i 1 time.
  3. Tilsett 40 μg proteinase K og inkuber ved 55 °C i 2 timer. Deretter ruges det ved 65 °C over natten.
  4. Avkjøl prøvene til romtemperatur og rens DNA-et med et spinnkolonnesett.

10. qPCR-reaksjonsoppsett og kjøring

MERK: Primer-, reaksjonsoppsett- og termosyklistparametrene bør endres for å samsvare med produsentens anbefalinger for qPCR-reaksjonsblandingen som brukes.

  1. Forbered primersett rettet mot GFP RNAi-reporteren og H3K9me3 positive og negative anrikningskontrollregioner. Primerens smeltetemperatur er 60 °C. Se Materialfortegnelse for primersekvenser.
  2. For inngangs-DNA, gjør fire firefoldige serielle fortynninger (f.eks. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
    MERK: IP-DNA kan brukes direkte eller fortynnet (f.eks. 1:2 eller 1:3) for å tillate flere reaksjoner. Fortynningens egnethet må bestemmes empirisk, siden qPCR-ytelsen kan påvirkes.
  3. Organiser alle reaksjonene som tilsvarer ett primersett på en PCR-plate. Sett opp tekniske dupliserte reaksjoner for hver Input DNA-fortynning og hver IP DNA-prøve. Hver 10 μL-reaksjon inneholder 1,5 μL inngangs- eller IP-DNA (eller elueringsbuffer som kontroll), qPCR-masterblanding (1x endelig konsentrasjon), foroverprimer og reversprimer (400 nM endelig konsentrasjon for hver primer).
  4. Kjør følgende program på en termosyklist i sanntid: innledende denaturering: 95 °C i 4 minutter; forsterknings- og fluorescensdeteksjon: 40 sykluser på 95 °C i 10 s og 60 °C i 30 s med en plateavlesning; endelig forlengelse: 60 °C i 5 min; smeltekurve: fra 60 °C til 90 °C i trinn på 0,5 °C, 5 s per trinn.

11. Bestemme amplifikasjonseffektivitet og verifisere produktspesifisitet

  1. For hvert sett med inndata-DNA-fortynninger plotter du de fire datapunktene med [log10(1/fortynning)] på x-aksen og [Input Cq] på y-aksen. Bestem hellingen på linjen med best passform.
  2. Beregn forsterkningseffektiviteten. Ideelle primersett bør konsekvent vise 95% -100% effektivitet.
    Equation 1
  3. Kontroller at alle reaksjonene har en skarp smeltekurvetopp og at reaksjoner med samme primersett har samme smeltetemperatur. Flere topper eller forskjellige smeltetemperaturer kan indikere uspesifikk forsterkning.
  4. Kjør eventuelt reaksjoner på en standard 2 % agarose/TAE-gel ved romtemperatur for å verifisere størrelsen på produktbåndet.

12. Beregning av prosentandelen av inngang

  1. Beregn inngangsfortynningsfaktoren. Siden 10 % av IP-lysatvolumet ble lagret som inngang, er fortynningsfaktoren for 1:5-fortynningen av inngangs-DNA 50.
  2. Bestem IP-fortynningsfaktoren. Hvis IP-DNA ikke fortynnes før qPCR, er fortynningsfaktoren 1.
  3. Beregn Cq-forskjellen mellom IP og Input justert for utvanningsfaktorer.
    Equation 2
  4. Beregn prosentandelen av Inndata.
    Equation 3

Representative Results

Dyr som bærer germline-uttrykt GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 reporter (figur 2A) ble utsatt for GFP RNAi eller kontroll RNAi ved fôring, og passerte som beskrevet i protokollen og figur 1. Nukleært GFP-signal i kimlinjen ble manuelt scoret ved hjelp av et fluorescensdissekerende mikroskop for et utvalg av befolkningen ved hver generasjon. Deaktivering av transgenet var fullt penetrerende hos P0- og F1-dyr behandlet med GFP RNAi (figur 2B). I F2-generasjonen var andelen av befolkningen som viste arv av GFP-inaktivering ca. 50 %. Ved F5-generasjonen viste flertallet av befolkningen ikke arv av silencing, og ved F10-generasjonen ble det ikke påvist noen arv, da alle dyrene uttrykte GFP.

For å bestemme endringen i histon H3K9me3-anrikning tilsvarende RNAi-indusert silencing, ble ChIP-qPCR utført på F1-generasjonsdyr etter enten GFP RNAi eller kontroll-RNAi-behandling. Som forventet viste den GFP RNAi-behandlede populasjonen høyere histon H3K9me3-nivåer ved GFP-målet og ved 1.3 kb nedstrøms region sammenlignet med kontroll-RNAi-behandlede dyr (figur 2C). Spesifisiteten til histonen H3K9me3 ChIP støttes av anrikningen ved et positivt kontrolllokus (clec-18) kjent for å være anriket i dette merket, men ikke ved et nærliggende negativt kontrolllokus (hrp-2). Histone H3-anrikning og nærbakgrunnsanrikning i IgG-kontrollimmunutfellingene ble også detektert ved alle qPCR-loci, som forventet. Når ChIP-anrikning hos reporteren normaliseres til clec-18 positiv kontrolllokus, vises høyere histon H3K9me3-anrikning ved GFP RNAi, mens histon H3-anrikning er lik mellom kontroll- og GFP RNAi-behandlingene (figur 2D). Siden GFP RNAi ikke forventes å påvirke histon H3K9me3 eller totalt histon H3-belegg ved clec-18-lokuset , reduserer denne normaliseringen mot teknisk variasjon, for eksempel forskjeller i ChIP-effektivitet mellom GFP RNAi og kontroll-RNAi-prøver. Fold-endringen av histon H3K9me3 og histon H3 nivåer mellom RNAi behandlinger viser GFP reporter-spesifikk histon H3K9me3 anrikning, uavhengig av histonbelegg, ved GFP RNAi-indusert silencing (figur 2E).

Figure 2
Figur 2: GFP RNAi-indusert silencing tilsvarer forhøyet H3K9me3-anrikning ved RNAi-målet. (A) Diagram over germline-uttrykt GFP RNAi reporter mjIs134 [mex-5p:: gfp-h2b :: tbb-2 3'UTR] med qPCR amplicon regioner merket. (B) GFP-uttrykk scoret over generasjoner etter RNAi-behandlinger ved 21 ° C. Feilfelt representerer standardavviket fra to biologiske replikater. (C) ChIP-qPCR av H3K9me3, histon H3 og IgG-kontroll hos F1 unge voksne fra to biologiske replikater. clec-18 og hrp-2 er henholdsvis positive og negative kontrollloci for H3K9me3-anrikning. (D) H3K9me3 og histon H3-anrikning ved GFP RNAi-reporteren normalisert til clec-18 positiv kontrolllokus. (E) Endring i H3K9me3 og histon H3-anrikning mellom GFP RNAi- og kontroll-RNAi-behandlede dyr, med normalisering til clec-18. Stiplet linje representerer en foldeendring på 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I denne protokollen introduseres dsRNA ved fôring, som har blitt en standardmetode i C. elegans18. For RNAi-arveanalyser gir fôringsmetoden en enkel metode for å oppnå en stor P0-populasjon 2,11,12,22,23,24,25. Imidlertid påvirker tidspunktet og varigheten av RNAi-eksponering effekten av transgene silencing26, og konsentrasjonen av RNAi-bakterier påvirker persistensen av arvelig RNAi-inaktivering1. Derfor er standardiserte RNAi-bakterier og ormvekst viktig for å oppnå et konsistent nivå av GFP-silencing og varighet av arv. Her blir embryoer belagt på RNAi-plater slik at P0-dyr blir utsatt for RNAi-bakterier fra klekking. Alternative tilnærminger har belagt synkroniserte L1 24,27 ellerL4 25 scenedyr på RNAi-NGM-plater. I tillegg, siden sult og andre påkjenninger påvirker opprettholdelsen av RNAi-arv13, må tallerkener overvåkes for å forhindre overbefolkning og utmattelse av matforsyningen. Som et alternativ til å initiere RNAi ved fôring, induserte noen av pioneren C. elegans RNAi arvestudier RNAi gjennom gonadeinjeksjon, noe som gir større kontroll over dsRNA-konsentrasjon 1,28.

I denne protokollen passeres hver generasjon som en populasjon med alkalisk hypoklorittbehandling, som tidligere beskrevet 16,22,23,24. Hypoklorittbehandling sikrer at F1-generasjonen ikke vil bli forurenset med RNAi-bakterier fra foreldremiljøet22 og forhindrer potensiell uønsket populasjon flaskehalser. Bulkpassering kan imidlertid også være en begrensning, siden enkeltdyr kan ha distinkte arvemønstre 1,29. En alternativ metode for å etablere hver generasjon er å velge ut enkeltdyr 1,2,9,11,25. Denne tilnærmingen gjør det mulig å spore fenotyper i linjer og inkorporering av genetiske kryss. Avstamningsanalyse kan også være fordelaktig for fenotyper med lav penetrans12.

Fluorescerende proteinuttrykk er en kraftig og praktisk avlesning av RNAi-indusert silencing 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrevet i denne protokollen kan GFP-uttrykk manuelt skåres som PÅ eller AV 11,12,15,16,25. Manuell scoring kan forbedres ytterligere ved å tildele kvalitative intensitetsnivåer 3,4,14. Alternativt kan automatisert intensitetsskåring av mikroskopibilder 11,12,14,25,27 eller flowcytometrifluorescensmåling av levende dyr2 gi en kvantitativ og høy gjennomstrømningsavlesning. Men siden reporterens uttrykk er begrenset til kimlinjen, er et forbehold om automatiserte tilnærminger at de også må skille mellom dyr med lydløst GFP-uttrykk versus dyr uten kimlinje, spesielt hvis studien inkorporerer mutanter med unormal kimlinjeutvikling. Som et alternativ til GFP-fluorescens kan revers transkripsjon (RT)-qPCR brukes til å kvantifisere RNAi-målnivåer før mRNA og mRNA-nivåer 2,16,23,24. Denne tilnærmingen gir en mer direkte avlesning av lyddemping, som retter seg mot RNA, og er spesielt nyttig for andre RNAi-mål der deaktivering ikke produserer en synlig fenotype. En begrensning ved bruk av kunstige GFP-reportere er at eksogene og endogene sekvenser er differensielt regulert i transgenerasjonell RNAi11. Studier med endogene mål, som det temperaturfølsomme embryonale dødelige allelet oma-1(zu405)1,11,16,25, bør derfor betraktes som en komplementær tilnærming til fluorescerende transgenreportere.

Analysen av ChIP i sammenheng med RNAi-arveanalyser krever sammenligning mellom behandlinger og replikater. For det første, for å ta hensyn til forskjeller i startmateriale mellom prøver, normaliseres ChIP-signalet til inngangssignal på samme sted som 'prosentandelen av inngang'. Behandling av en histon H3 ChIP parallelt vil bidra til å avgjøre om noen histonmodifikasjonsendringer samsvarer med endringer i nukleosomtetthet. I tillegg, fordi ChIP er en flertrinnsprosess, kan effektiviteten variere mellom prøver. Valget av passende positive og negative kontrollsteder er nyttig for å evaluere og sammenligne signal-støy-forholdet mellom prøver og eksperimenter. I tillegg, for å lette sammenligninger mellom prøver, blir ChIP DNA qPCR-terskelsyklusverdiene ved RNAi-målet ofte normalisert til et kontrollsted 3,11,15,23,30,31. For å evaluere effekten av RNAi-behandlingen, sammenlignes også forholdet mellom ChIP-signalet i behandling RNAi versus kontroll eller ingen RNAi-forhold. En begrensning av dagens tilnærming er at ChIP utføres med hele dyr, mens responsen på RNAi-behandling kan være unik for kimlinjen. En tilnærming for å overvinne dette forbeholdet er å utføre ChIP ved hjelp av isolerte kimlinjekjerner. Ytterligere tekniske hensyn for å optimalisere ChIP har også blitt diskutert mye andre steder32,33.

Samlet sett gir denne RNAi-arven og ChIP-protokollen et detaljert og lett å tilpasse fundament som kan integreres med andre teknikker for å utforske transgenerasjonell epigenetisk regulering ytterligere. For eksempel kan biblioteker med høy gjennomstrømningssekvensering konstrueres fra ChIP-DNA (ChIP-seq) for en mer detaljert visning av kromatinlandskapet både proksimalt for RNAi-målet og på genom-bred skala.

Disclosures

Alle forfatterne bekrefter at de ikke har noen konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne laboratoriene i C. elegans-samfunnet som utviklet og delte verktøyene og hvis arbeid er sitert i dette manuskriptet. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av et kanadisk institutt for helseforskning (CIHR) prosjektstipend til ALS (PJT-175245). CL støttes av et Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) forskerstipend (PGS-D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Bioshop AGA002
Ampicillin Bioshop AMP201 Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab8898 Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab1791 Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).
Bleach (6% Sodium hypochlorite) Lavo 02358107
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter NA SX1263 Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.
Carbenicillin BioShop CAR544 Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Dynabeads Protein G Magnetic Beads Invitrogen 10003D
E. coli strain HT115(DE3) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) HT115(DE3)
E. coli strain OP50-1 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50-1
EDTA (0.5 M, pH 8.0) Invitrogen 15575020
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Formaldehyde (37%) Sigma F8775
Glycine Sigma 50046 Make a 1.25 M solution and store at 4 °C.
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) Teknova H1035
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells VWR 100488-904
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) BioShop NON999 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) BioShop IPT001 Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725122
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin NA NA Standard lab recipe.
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) Sigma L9756 Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C.
LiCl (8 M) Sigma L7026
M9 Buffer NA NA 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) Applied Biosystems A13346
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) Permagen MSR812
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12541B
Microscope Slide Technologist Choice LAB-037
NaCl (5 M) Promega V4221 For ChIP buffers.
NaOH  Sigma S5881 Make a 10 M solution and store at room temperature.
NGM Plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin.
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) Cell Signaling Technology 2729
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) Sarstedt 82.1135.500
Phosphate Buffered Saline (10X) Fisher BioReagents BP3991
Plasmid - Control RNAi  Addgene L4440 (Plasmid #1654)
Plasmid - GFP-targetting RNAi  Addgene L4417 (Plasmid #1649) Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Primer pair [clec-18] Integrated DNA Technologies NA F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
Primer pair [gfp exon 1] Integrated DNA Technologies NA F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Primer pair [gfp exon 4] Integrated DNA Technologies NA F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Primer pair [hrp-2] Integrated DNA Technologies NA F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 11836170001
Proteinase K  Bioline BIO-37084
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104
Real-Time PCR Detection System Bio-Rad CFX96 
RNAi-NGM plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.
RNase A Sigma R4642
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma L5777 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
SDS Sigma 74255 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.
Sodium deoxycholate Sigma 30970 Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
Sonication Tube Evergreen 214-3721-010
Sonication Tube Cap Evergreen 300-2911-020
Sonicator Qsonica Q800R3-110
Streptomycin sulfate Bioshop STP101 Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
TAE buffer (1X) NA NA 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA
Tally counter clicker Uline H-7350
Tetracycline Bioshop TET701 Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C.
Thermomixer Eppendorf 05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Invitrogen 15568025
Triton X-100 Sigma T8787 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
  2. Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
  3. Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
  4. Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882 (2006).
  5. Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
  6. Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
  7. Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).
  8. Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
  9. Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
  10. Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
  11. Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448 (2019).
  12. Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
  13. Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797 (2021).
  14. Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
  15. Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
  16. Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
  17. Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
  18. Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
  19. Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  21. Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
  22. Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
  23. Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6 (2017).
  24. Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
  25. Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
  26. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  27. Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
  28. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
  29. Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
  30. Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
  31. Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
  32. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  33. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).

Tags

Transgenerasjonell epigenetisk arv C. elegans fluorescerende reporter kromatinimmunoprecipitasjon RNA-interferens (RNAi) arv ikke-kodende RNA kromatinmodifikasjoner kimlinje geninaktivering kromatinsignaturer grønt fluorescerende protein (GFP) reporter dobbeltstrenget RNA synkronisert utvikling mikroskopi kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP) kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) histonmodifikasjonsberikelse
Analyse av transgenerasjonell epigenetisk arv i <em>C. elegans</em> ved bruk av en fluorescerende reporter og kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Bhagoutie, P. A. W., Lao,… More

Li, C., Bhagoutie, P. A. W., Lao, V., Saltzman, A. L. Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). J. Vis. Exp. (195), e65285, doi:10.3791/65285 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter