Summary
Detta protokoll beskriver en RNA-interferens och ChIP-analys för att studera det epigenetiska nedärvningen av RNAi-inducerad avstängning och associerade kromatinmodifieringar i C. elegans.
Abstract
Transgenerationell epigenetisk nedärvning (TEI) möjliggör överföring av information genom könscellerna utan att ändra genomsekvensen, genom faktorer som icke-kodande RNA och kromatinmodifieringar. Fenomenet RNA-interferens (RNAi) nedärvning i rundmasken Caenorhabditis elegans är en effektiv modell för att undersöka TEI som drar nytta av denna modellorganisms korta livscykel, självförökning och transparens. Vid RNAi-nedärvning leder exponering av djur för RNAi till nedtystning av gener och förändrade kromatinsignaturer på målplatsen som kvarstår i flera generationer i frånvaro av den initiala utlösaren. Detta protokoll beskriver analysen av RNAi-arv i C. elegans med hjälp av en germline-uttryckt nukleärt grönt fluorescerande protein (GFP) reporter. Rapportörens nedtystning initieras genom att djuren matas med bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA som riktar sig mot GFP. Vid varje generation passerar djuren för att upprätthålla en synkroniserad utveckling, och nedtystning av reportergenerna bestäms genom mikroskopi. Vid utvalda generationer samlas populationer in och bearbetas för kromatinimmunoprecipitering (ChIP)-kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för att mäta anrikning av histonmodifiering vid GFP-reporterplatsen. Detta protokoll för att studera RNAi-arv kan enkelt modifieras och kombineras med andra analyser för att ytterligare undersöka TEI-faktorer i små RNA- och kromatinvägar.
Introduction
Epigenetisk nedärvning möjliggör överföring av genreglerande information mellan generationer och kan därför göra det möjligt för föräldrarnas miljö eller erfarenheter att påverka deras avkomma. I C. elegans kan nedtystning av könsceller initierad av exogent dubbelsträngat RNA (dsRNA) nedärvas i flera generationer i avkomman som inte exponerats för den ursprungliga triggern 1,2,3,4. Denna process, som kallas RNA-interferens (RNAi) nedärvning, är ett av flera relaterade epigenetiska avstängningsfenomen i C. elegans, inklusive piRNA-initierad flergenerationsavstängning2,5, paramutation/RNAe (RNA-inducerad epigenetisk avstängning)6,7,8 och multicopy array-initierad avstängning9, som har överlappande men distinkta krav på små RNA- och kromatinregleringsmaskiner . I C. elegans exogena RNAi bearbetas dsRNA till små interfererande RNA (siRNA) som verkar i ett komplex med primära Argonaute-proteiner för att känna igen sitt mål-mRNA. Denna målinriktning leder till förstärkning av sekundära siRNA som associeras med sekundära Argonautes för att tysta mål-mRNA genom både cytoplasmatiska och nukleära avstängningsvägar. För könscellsuttryckta RNAi-mål riktar sig den nukleära sekundära Argonaute HRDE-1 och ytterligare nukleära RNAi-faktorer mot begynnande transkript, vilket resulterar i transkriptionell repression och rekrytering av histonmetyltransferaser för att deponera repressiva kromatinmärken, inklusive H3K9me310. Histone H3K9me3 främjar etableringen av ärftlig avstängning av könscellsuttryckta gröna fluorescerande proteintransgener (GFP) genom RNAi-arv11,12.
Målet med detta protokoll är att använda en transgen som uttrycker ett GFP-histonfusionsprotein i könscellen som en rapportör för RNAi-arv och att analysera förändringar i histonmodifieringar vid reportertransgenlokus med hjälp av kromatinimmunprecipitering och kvantitativ polymeraskedjereaktion (ChIP-qPCR). Detta protokoll beskriver en standardiserad plattbaserad RNAi-matningsmetod för att initiera nedtystning av rapportörer. Den innehåller också en detaljerad tidsplan för hur djur ska kunna överföras mellan generationer genom att embryon från dräktiga vuxna isoleras i livmodern genom alkalisk hypokloritbehandling ("blekning"). Metoder och representativa data för övervakning av frekvensen av GFP-avstängning i en undergrupp av befolkningen genom fluorescensmikroskopi och för histon H3K9me3 ChIP-qPCR beskrivs också. Reporterbaserade RNAi-arvsanalyser ger ett mycket lätthanterligt system för att funktionellt dissekera rollerna av genetiska och miljömässiga faktorer i epigenetisk reglering 13,14, och genetiska skärmar med hjälp av sådana rapportörer har identifierat både gener som krävs för 2,3,15 och gener som negativt reglerar16,17 varaktigheten av transgenerationell epigenetisk nedärvning.
Protocol
OBS: En analystidslinje finns i figur 1.
1. Beredning av RNAi-nematodtillväxtmedium (RNAi-NGM) plattor
- Stryk ut E. coli HT115(DE3) innehållande antingen GFP- eller kontroll-RNAi-vektorer från glycerollager på Luria-Bertani (LB) agarplattor kompletterade med 100 μg/ml ampicillin. Inkubera bakterierna över natten vid 37 °C.
- Följande dag, förbered RNAi-NGM-plattor (1,7 % [w/v] agar, 0,3 % [w/v] NaCl, 0,25 % [w/v] pepton, 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM kaliumfosfatbuffert [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 μg/ml karbenicillin och 5 mM isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid [IPTG]) enligt standardprotokoll18.
- För varje stam i analysen bereds minst sex RNAi-NGM-plattor som är besprutade med GFP-RNAi (två plattor för vart och ett av de tre biologiska replikaten) och två RNAi-NGM-plattor som är seedade med kontroll-RNAi (ett biologiskt replikat).
- Tälta plattorna löst med folie för att skydda mot ljus och låt torka över natten i rumstemperatur.
- Samma dag som RNAi-NGM-plattan hälls, förbered 4 ml flytande kulturer av RNAi-bakterier.
- Under sterila förhållanden, alikvot 4 ml LB-buljong tillsatt med 10 μg/ml tetracyklin och 100 μg/ml ampicillin i odlingsrör. Plocka enskilda kolonier från LB-agarplattorna i varje rör och inkubera över natten under omskakning i cirka 16 timmar vid 37 °C.
- Frö RNAi-bakterier på RNAi-NGM-plattorna.
- Efter tillväxt över natten, mät den optiska densiteten (OD600) för odlingar med en 1:5 utspädning av bakterier med LB-buljong.
- Späd RNAi-bakterier till en relativ OD 600 på 2 med hjälp av LB-buljong kompletterad med 10 μg/ml tetracyklin och100 μg/ml ampicillin.
- Under sterila förhållanden tillsätts 150 μL av kontroll- eller GFP-RNAi-bakterierna på varje RNAi-NGM-platta.
- Tälta plattorna med folie och låt bakterierna växa i minst 24 timmar i rumstemperatur före användning.
OBS: Oanvända RNAi-NGM-plattor kan förvaras inverterade i upp till 1 vecka vid 4 °C i en förseglad behållare i mörker.
2. Start av RNAi-arvsanalysen: blekning och plätering av embryon för P0-generationen
OBS: Innan RNAi-arvsanalysen påbörjas bör maskar som innehåller GFP-reportern mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 hållas osvultna vid 21 °C i minst två generationer.
- 4 dagar (96 timmar) före starten av RNAi-nedärvningsanalysen (figur 1) väljs tre eller fyra dräktiga vuxna på varje 35 mm NGM-standardplatta sådd med OP50-1-bakterier.
OBS: Tre NGM-plattor per stam räcker. För stammar med nedsatt fertilitet kan det krävas fler än fyra djur per platta. - Efter 4 dagar, se till att den vuxna befolkningen har börjat lägga embryon på plattan. Tvätta maskarna från plattorna i 1,5 ml rör med 800 μL M9-buffert kompletterad med Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1mM MgSO 4, 0,01 % (v/v) TX-100). Upprepa tvätten och poolen i samma rör.
- Isolera embryona från populationen genom blekning enligt följande.
- Bered en blekningslösning med blekmedel (6 % natriumhypoklorit) och 10 N NaOH i ett volymförhållande på 1,5:1. Bered en tillräcklig mängd så att 250 μL kan användas för varje prov.
- Centrifugera 1,5 ml-rören med maskarna vid 1 000 x g i 1,5-2 minuter.
- Aspirera supernatanten och lämna 100 μL utan att störa maskens "pellet". Alternativt kan rören lämnas i cirka 2 minuter för att låta maskarna sätta sig innan de suger.
- Tillsätt 650 μl ddH2O till varje rör för att uppnå en slutlig volym på 750 μL.
OBS: Följande steg är tidskänsliga. - Tillsätt 250 μL av blekningslösningen till varje tub och starta en timer.
- Var 1-2:e minut, virvla rören noggrant. Efter 5 minuter, kontrollera maskarna under stereoskopet för att övervaka nedbrytningen av vuxna.
- Fortsätt virvla tills maskarna är helt upplösta och endast embryon återstår. Centrifugera omedelbart rören vid 1 000 x g i 1,5 min.
OBS: Blekningen är i allmänhet klar inom 6-7 minuter, men bör övervakas i stereoskop med en förstoring som är tillräcklig för att observera de frisläppta embryona (40x). Lämna inte maskarna i blekmedel under en längre period, eftersom detta kommer att äventyra embryona. - Efter centrifugering, aspirera supernatanten och lämna cirka 50-100 μL. Tillsätt 1 ml M9-buffert med TX-100 för att tvätta och blanda genom virvling. Centrifugera igen med 1 000 x g i 1,5-2 minuter och tvätta minst två gånger till.
- Sug upp supernatanten från den sista tvätten och lämna cirka 100 μL i röret. Blanda genom att virvla. Pipettera 2 μL från varje rör två gånger till ett märkt glasglas. Räkna embryona med hjälp av en räkneräknare för att uppskatta koncentrationen av embryon per mikroliter.
OBS: Objektglas med flera frostade brunnar kan användas här för att räkna replikat av flera stammar. Räkneglas kan tvättas och återanvändas.
- För att starta en halvsynkroniserad populationstillväxt, blanda och pipettera en volym innehållande 250 embryon på varje RNAi-NGM-platta. Använd två plattor för varje replikat. Låt vätskan absorberas.
- För P0-generationen som behandlats med RNAi, inkubera vid 21 °C i 4 dagar (96 timmar) (från embryon till vuxen ålder). Tidpunkterna kan variera beroende på genotyp.
Figur 1: Schematisk RNAi-arvsanalys. Föreslagen tidslinje för beredning av RNAi-NGM-plattor och RNAi-arvsanalys. Dräktiga vuxna plockas på dag -4 på NGM-plattor sådda med OP50-1. Efter 4 dagar bleks vuxna avkommor och embryon pläteras på RNAi-NGM-plattor. P0-generationen exponeras för RNAi i 4 dagar vid 21 °C. När maskarna når vuxen ålder passeras replikaten genom blekning och poängsätts för GFP-uttryck i könscellerna varje generation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Passning och poängsättning av varje generation för GFP-uttryck på könscellerna
OBS: För att underlätta poängsättningen, använd en vinylskiva för att skapa agaroskuddar med linjära åsar för att rada upp maskarna. Denna metod anpassades från Rivera Gomez och Schvarzstein19.
- Bered 1 % (w/v) agaros genom att lösa upp agaros i ddH2O i en liten kolv genom att värma i mikrovågsugn. Tillsätt en omrörningsstång och täck med folie. Vid omsmältning, värm agarosen på en kokplatta vid 200 °C under omrörning. När den har smält, sänk värmen till 80 °C.
- Tvätta maskarna från NGM-plattorna med 800 μL M9-buffert med TX-100 i ett 1.5 ml rör. Tvätta tallrikarna två gånger för att ta bort alla gravida vuxna. Kontrollera plattorna under stereoskopet för att bekräfta att djuren har samlats in effektivt.
- Centrifugera rören vid 1 000 x g i 1,5-2 minuter eller låt maskarna sätta sig i 2 minuter. Aspirera supernatanten och lämna 100 μL utan att störa maskens "pellet".
- Förbered agaroskuddar för montering av maskarna enligt följande.
- Placera en droppe smält 1 % (w/v) agaros på vinylskivan (beskriven tidigare19) med hjälp av en Pasteur-pipett av glas (med den smala änden avbruten).
- Orientera en glasskiva så att linjerna på skivan är antingen horisontella eller vertikala och placera bilden snabbt på agarosdroppen. Vänta cirka 30 s innan du tar bort glasskivan från skivan.
OBS: Om du gör flera genotyper kan det vara användbart att göra en större agarosdyna på ett objektglas och skära den på mitten med hjälp av ett blad.
- Montera maskarna på agaroskuddarna.
- Tillsätt cirka 5 μl 5 mM levamisol till agaroskudden under stereoskopet. Utspädningen av levamisol ska göras färsk varje vecka.
- Snärta försiktigt till rören med maskar för att blanda och överför 5-10 μL maskar till agarosdynan. Uppskatta antalet maskar med ögat när de läggs till så att det finns cirka 40 maskar per replikat.
- Rada upp maskarna i rader med hjälp av en ögonfransplockare för enklare poäng. Lägg till ett täckglas i glas.
OBS: Rutschkanor med djur monterade på detta sätt kan hålla i flera timmar innan de torkar ut.
- Isolera embryona från de återstående djuren med hjälp av blekningsprotokollet (se steg 2.3) innan glasen poängsätts. Platta 250 embryon på 35 mm NGM-plattor sådda med OP50-120. När vätskan har absorberats, vänd plattorna upp och ner och lägg tillbaka dem i 21 °C-inkubatorn.
- Använd ett blomsterstereoskop med en GFP-filteruppsättning. Räkna och registrera antalet GFP-positiva och GFP-negativa maskar på objektglasen för varje replikat med hjälp av en räkneräknare.
OBS: GFP-positiva maskar kommer att ha nukleärt GFP-uttryck i sina könsceller och embryon i livmodern. Könscellerna hos GFP-negativa maskar kommer inte att fluorescera, men när GFP börjar slå på igen i senare generationer kan fluorescensen vara svag. Det kan vara till hjälp att montera ytterligare icke-transgena maskstammar för att ta hänsyn till eventuell observerad autofluorescens. - Genomfartsled genom blekning, enligt beskrivningen ovan, ungefär var 4:e dag (96 timmar) vid 21 °C. Alternativt kan passering göras på ett alternerande 3-dagars/4-dagarsschema för enkelhetens skull. Platta ytterligare ~50 embryon för de kortare passerande generationerna om de alternerar, eftersom det kan finnas ett lägre utbyte av embryon efter 72 timmar.
OBS: Håll P0-generationens passeringstid konsekvent vid 4 dagar efter plätering av embryon.
4. Djurinsamling för ChIP
OBS: Antalet djur och tidpunkten beror på stammen, utvecklingsstadiet, epitopen och antalet mål för immunprecipitering (IP). I exemplet nedan samlar du in djur för tre IP-adresser: H3K9me3, histon H3 och IgG-kontroll. ChIP-protokollet anpassades från Askjaer et al.21.
- Före ChIP-provtagningen, utöka den tidigare generationen av RNAi-arvsanalysen med ytterligare tre NGM-plattor (till minst fyra plattor per replikat). Odla i 4 dagar vid 21 °C.
- Blek de dräktiga vuxna för att isolera embryona (se steg 2.3).
- För varje stam placeras cirka 3 500 embryon på 14 plattor (250 per platta) och växer i 3 dagar vid 21 °C till stadiet som ung vuxen.
- Tvätta djuren i 1,5 ml rör med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 0,01 % (v/v) TX-100 (PBS/TX). Centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter. Aspirera och slå samman djuren från en stam till ett rör och tvätta ytterligare tre gånger med minst 1 ml PBS/TX.
- Aspirera till 1 000 μl, vänd upp och ner för att blanda och räkna antalet djur i 3 μl tre gånger (se steg 2.3.9).
- Beräkna koncentrationen av djur och för över en volym motsvarande 3 000 djur till ett nytt rör för tvärbindning av formaldehyd.
- Se till att den totala volymen är minst 10 gånger maskpelletsvolymen.
5. Tvärbindning av formaldehyd
VARNING: Arbeta med formaldehyd i ett dragskåp för att förhindra exponering för ånga.
- Tillsätt formaldehyd (1,8 % slutkoncentration) i röret som innehåller maskarna. Rotera i rumstemperatur i 6 min.
- Frys omedelbart i flytande kväve. Experimentet kan pausas i detta steg och proverna kan förvaras vid -80 °C.
- Tina det tvärbundna provet i ett rumstempererat vattenbad i 3 minuter och rotera i 16 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 1,25 M glycin till en slutlig koncentration på 125 mM och rotera i 5 minuter.
OBS: Fram till magnetisk pärleluering, håll proverna på is eller vid 4 °C och använd iskalla buffertar. - Centrifugera provet vid 1 000 x g i 3 minuter. Tvätta tre gånger med 1 ml PBS/TX varje gång. Tvätta två gånger med 1 ml resuspensionsbuffert (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA], 0,01 % TX-100, proteashämmare [en tablett per 5 ml]).
- Efter den sista tvätten, lämna tillräckligt med buffert för att säkerställa att den totala volymen är minst tre gånger pelletsvolymen och minst ~100 μL.
6. Ultraljudsbehandling
OBS: Ultraljudsbehandling parametrar beror på typ och modell av ultraljudssond och djur stadium. Parametrar som provvolym och koncentration, på/av-intervall, antal cykler och effektinställning måste optimeras empiriskt. Till exempel, under en tidsperiod för ultraljudsbehandling, övervaka masklys med hjälp av en proteinanalys och bestämma när koncentrationen når en platå. Övervaka dessutom när den genomsnittliga skjuvstorleken för det genomiska DNA:t är cirka 200-1 000 bp genom elektrofores av DNA, renat efter tvärbindningsreversering, på en 1,5 % agaros/tris-acetat-EDTA (TAE) gel.
- Mät volymen av samples från föregående steg. Blanda och aliquera 90-120 μL till ett polystyren-ultraljudsbehandlingsrör.
- Tillsätt en lika stor volym resuspensionsbuffert innehållande 2x rengöringsmedel (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2 % natriumdeoxikolat, 0,7 % sarkosyl).
- Ultraljudsbehandling i ett vattenbad sonikator med 50 % effekt i 7 minuter (20 s på / 40 s av) vid 4 °C. Blanda försiktigt genom att pipettera. Upprepa ultraljudsbehandlingen i ytterligare 7 minuter.
- Överför det sonikerade lysatet till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 0,5 volymer resuspensionsbuffert utan rengöringsmedel (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (tillsätt t.ex. 100 μL buffert till 200 μL prov).
- Centrifugera vid 13 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Behåll lysatsupernatanten och överför den till en ny sond.
- Alternativt kan du utföra en proteinanalys för att bestämma koncentrationerna av varje lysat. Detta steg kan vara användbart för stora provkvantiteter eller jämförelser mellan analyser. Att standardisera antalet djur enligt ovan fungerar dock bra för de provmängder som beskrivs här, eftersom det finns en bättre korrelation med utbytet av kromatin/DNA som bestäms med qPCR.
7. Immunoprecipitering
OBS: Skala mängden antikroppar och magnetiska pärlor till volymen och koncentrationen av lysat.
- Dela upp lysatsupernatanten i fyra delar: tre lika stora volymer för varje IP och 10 % av en IP:s volym som ingång (t.ex. 100 μl IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL ingång). Överför IP-lysatet till ett 200 μL PCR-rör och förvara det ingående lysatet vid -20 °C i ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 0,5 μg anti-H3K9me3-antikropp, antihiston H3-antikropp eller IgG till lämpligt IP-prov. Inkubera vid 4 °C över natten med rotation.
- Följande dag, alikvot 9 μL protein G-belagda magnetiska pärlor per IP till ett enda 1,5 ml rör. Tvätta pärlorna två gånger med 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1 % TX-100, 0,1 % natriumdeoxikolat).
- Återsuspendera de magnetiska pärlorna i FA-150-bufferten till den ursprungliga volymen som togs från materialet i steg 7.3 ovan. Tillsätt 7,5 μL till varje IP. Inkubera vid 4 °C i 2 timmar under rotation.
8. Tvättar och eluering
OBS: För att säkerställa att de magnetiska pärlorna inte torkar, tillsätt varje tvätt eller elueringsbuffert snabbt efter att du har aspirerat föregående tvätt.
- Använd 0,2-1 ml av följande buffertlösningar varje gång för att tvätta pärlorna. Samla pärlorna på ett magnetstativ för att aspirera tvättarna. Inkubera varje tvätt vid 4 °C i 5 minuter med rotation. Följ ordningen enligt nedan.
- Tvätta två gånger med FA-150.
- Tvätta en gång med FA-1M (FA-150 med 1 M NaCl).
- Tvätta en gång med FA-0.5M (FA-150 med 0.5 M NaCl). Överför till ett nytt PCR-rör.
- Tvätta en gång med TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1 % IGEPAL CA-630, 1 % natriumdeoxikolat).
- Tvätta två gånger med TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
OBS: Fortsätt sample bearbetning vid rumstemperatur om inte annat anges.
- Aspirera den sista tvättbufferten. Återsuspendera de magnetiska pärlorna med 50 μL ChIP-elueringsbuffert (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1 % natriumdodecylsulfat [SDS]) och överför till ett 1,5 ml rör.
- Eluera vid 65 °C i 15 minuter i en termomixer med blandning vid 1 000 varv per minut i 5 s varje minut.
- Samla pärlorna på ett magnetiskt stativ och överför supernatanten till ett nytt rör.
- Upprepa elueringen med ytterligare 50 μl ChIP-elueringsbuffert. Slå samman supernatanterna till totalt 100 μL. Fortsätt med omvänd tvärbindning och DNA-eluering, enligt beskrivningen nedan.
9. Omvänd tvärbindning och DNA-eluering
- Tina inmatat lysat sample. Fyll på upp till 100 μL med ChIP-elueringsbuffert.
- Tillsätt 16,5 μg RNas A till varje IP och Input sample. Inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Tillsätt 40 μg proteinas K och inkubera vid 55 °C i 2 timmar. Inkubera sedan vid 65 °C över natten.
- Kyl proverna till rumstemperatur och rena DNA:t med ett spinnkolonnkit.
10. Inställning och körning av qPCR-reaktion
OBS: Parametrarna primer, reaktionsinställning och termocykler bör modifieras för att matcha tillverkarens rekommendationer för den qPCR-reaktionsblandning som används.
- Förbered primeruppsättningar som riktar sig mot GFP RNAi-reportern och H3K9me3 positiva och negativa anrikningskontrollregioner. Primerns smälttemperatur är 60 °C. Se materialtabell för primersekvenser.
- För ingångs-DNA, gör fyra fyrfaldiga serieutspädningar (t.ex. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
OBS: IP-DNA kan användas direkt eller utspätt (t.ex. 1:2 eller 1:3) för att möjliggöra fler reaktioner. Spädningens lämplighet måste bestämmas empiriskt, eftersom qPCR-prestandan kan påverkas. - Organisera alla reaktioner som motsvarar en primer på en PCR-platta. Ställ in tekniska duplicerade reaktioner för varje Input DNA-utspädning och varje IP DNA-prov. Varje 10 μL-reaktion innehåller 1,5 μL ingångs- eller IP-DNA (eller elueringsbuffert som kontroll), qPCR-mastermix (1x slutkoncentration), framåtriktad primer och omvänd primer (400 nM slutkoncentration för varje primer).
- Kör följande program på en termocykler i realtid: initial denaturering: 95 °C i 4 minuter; Förstärkning och fluorescensdetektion: 40 cykler med 95 °C i 10 s och 60 °C i 30 s med en skyltavläst. slutlig förlängning: 60 °C i 5 min; smältkurva: från 60 °C till 90 °C i steg om 0,5 °C, 5 s per steg.
11. Bestämning av förstärkningseffektivitet och kontroll av produktspecificitet
- För varje uppsättning indata-DNA-utspädningar plottar du de fyra datapunkterna med [log10(1/dilution)] på x-axeln och [Input Cq] på y-axeln. Bestäm lutningen på den linje som passar bäst.
- Beräkna förstärkningseffektiviteten. Idealiska primerset bör konsekvent visa 95%-100% effektivitet.
- Kontrollera att alla reaktioner har en skarp smältkurva och att reaktioner med samma primeruppsättning har samma smälttemperatur. Flera toppar eller olika smälttemperaturer kan indikera icke-specifik förstärkning.
- Alternativt kan du köra reaktioner på en standard 2 % agaros/TAE-gel vid rumstemperatur för att verifiera produktens bandstorlek.
12. Beräkning av procentandelen av insatsen
- Beräkna utspädningsfaktorn. Eftersom 10 % av IP-lysatvolymen sparades som ingång, är utspädningsfaktorn för 1:5-utspädningen av inmatat DNA 50.
- Bestäm utspädningsfaktorn för IP. Om IP-DNA:t inte späds ut före qPCR är utspädningsfaktorn 1.
- Beräkna Cq-differensen mellan IP och indata justerat för utspädningsfaktorer.
- Beräkna procentandelen av ingången.
Representative Results
Djur som bar på GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 reporter (figur 2A) exponerades för GFP-RNAi eller kontroll-RNAi genom utfodring och passerade enligt beskrivningen i protokollet och figur 1. Kärn-GFP-signalen i könscellerna poängsattes manuellt med hjälp av ett fluorescensdissekerande mikroskop för ett urval av populationen vid varje generation. Nedtystning av transgenen var helt penetrerande hos de poängsatta P0- och F1-djuren som behandlades med GFP RNAi (Figur 2B). I F2-generationen var andelen av befolkningen som uppvisade nedärvning av GFP-nedtystning cirka 50 %. I F5-generationen visade majoriteten av populationen inte nedärvning av tystnad, och i F10-generationen upptäcktes ingen nedärvning, eftersom alla djur uttryckte GFP.
För att bestämma förändringen i histon H3K9me3-anrikning motsvarande RNAi-inducerad avstängning utfördes ChIP-qPCR på djur i F1-generationen efter antingen GFP RNAi- eller kontroll-RNAi-behandling. Som förväntat uppvisade den GFP RNAi-behandlade populationen högre histonnivåer H3K9me3 vid GFP-målet och vid 1,3 kb nedströmsregionen jämfört med kontroll-RNAi-behandlade djur (Figur 2C). Specificiteten hos histon H3K9me3 ChIP stöds av anrikningen vid ett positivt kontrolllokus (clec-18) som är känt för att vara anrikat i detta märke, men inte vid ett närliggande negativt kontrolllokus (hrp-2). Histone H3-anrikning och nära bakgrundsanrikning i IgG-kontrollimmunprecipitrationer detekterades också vid alla qPCR-loci, som förväntat. När ChIP-anrikning vid rapportören normaliseras till clec-18-positiva kontrolllokuset, visas högre histonanrikning H3K9me3 vid GFP-RNAi, medan histon H3-anrikning är likartad mellan kontroll- och GFP-RNAi-behandlingarna (Figur 2D). Eftersom GFP-RNAi inte förväntas påverka histon H3K9me3 eller total histon H3-beläggning vid clec-18-lokuset , mildrar denna normalisering den tekniska variationen, såsom skillnader i ChIP-effektivitet mellan GFP-RNAi- och kontroll-RNAi-proverna. Vikningsförändringen av histon H3K9me3 och histon H3-nivåer mellan RNAi-behandlingar visar GFP-reporterspecifik histon H3K9me3-anrikning, oberoende av histonbeläggning, vid GFP RNAi-inducerad avstängning (Figur 2E).
Figur 2: GFP RNAi-inducerad avstängning motsvarar förhöjd H3K9me3-anrikning vid RNAi-målet. (A) Diagram över den könscellsuttryckta GFP RNAi-reportern mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] med qPCR-amplikonregioner märkta. (B) GFP-uttryck som bedömts över generationer efter RNAi-behandlingar vid 21 °C. Felstaplar representerar standardavvikelsen från två biologiska replikat. (C) ChIP-qPCR av H3K9me3, histon H3 och IgG-kontroll hos F1 unga vuxna från två biologiska replikat. clec-18 och hrp-2 är de positiva respektive negativa kontrollplatserna för H3K9me3-anrikning. (D) H3K9me3 och histon H3-anrikning vid GFP RNAi-reportern normaliserades till clec-18-positiva kontrolllokuset. (E) Förändring i H3K9me3- och histon-H3-anrikning mellan GFP-RNAi- och kontroll-RNAi-behandlade djur, med normalisering till clec-18. Prickad linje representerar en vikningsändring på 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
I detta protokoll introduceras dsRNA genom utfodring, vilket har blivit en standardmetod i C. elegans18. För RNAi-nedärvningsanalyser ger utfodringsmetoden en enkel metod för att erhålla en stor P0-population 2,11,12,22,23,24,25. Tidpunkten och varaktigheten av RNAi-exponeringen påverkar dock effekten av transgen nedtystning26, och koncentrationen av RNAi-bakterier påverkar varaktigheten av ärftlig RNAi-avstängning1. Därför är standardiserade RNAi-bakterier och masktillväxt viktiga för att få en konsekvent nivå av GFP-avstängning och nedärvningstid. Här pläteras embryon på RNAi-plattor så att P0-djuren exponeras för RNAi-bakterier från kläckningen. Alternativa metoder har pläterat synkroniserade L1 24,27 ellerL4 25 djur på RNAi-NGM-plattor. Dessutom, eftersom svält och andra påfrestningar påverkar upprätthållandet av RNAi-arv13, måste plattorna övervakas för att förhindra överbeläggning och utmattning av matförrådet. Som ett alternativ till att initiera RNAi genom utfodring inducerade några av pionjärstudierna av C. elegans RNAi RNAi genom gonadinjektion, vilket ger en större kontroll av dsRNA-koncentrationen 1,28.
I detta protokoll passerar varje generation som en population med alkalisk hypokloritbehandling, som tidigare beskrivits 16,22,23,24. Hypokloritbehandling säkerställer att F1-generationen inte kommer att kontamineras med RNAi-bakterier från föräldramiljön22 och förhindrar potentiell oönskad flaskhals i populationen. Bulkförflyttning kan dock också vara en begränsning, eftersom enskilda djur kan ha distinkta nedärvningsmönster 1,29. En alternativ metod för att fastställa varje generation är att välja ut enskilda djur 1,2,9,11,25. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att spåra fenotyper inom linjer och införliva genetiska korsningar. Härstamningsanalys kan också vara fördelaktigt för fenotyper med låg penetrans12.
Fluorescerande proteinuttryck är en kraftfull och bekväm avläsning av RNAi-inducerad avstängning 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrivs i detta protokoll kan GFP-uttryck manuellt poängsättas som PÅ eller AV 11,12,15,16,25. Manuell poängsättning kan förfinas ytterligare genom att tilldela kvalitativa intensitetsnivåer 3,4,14. Alternativt kan automatiserad intensitetsbedömning av mikroskopibilder 11,12,14,25,27 eller flödescytometrifluorescensmätning av levande djur2 ge en kvantitativ avläsning med hög genomströmning. Men eftersom reporteruttrycket är begränsat till könscellerna är en invändning mot automatiserade metoder att de också måste skilja mellan djur med tystat GFP-uttryck och djur utan könsceller, särskilt om studien innehåller mutanter med onormal könscellsutveckling. Som ett alternativ till GFP-fluorescens kan omvänd transkription (RT)-qPCR användas för att kvantifiera RNAi-målpre-mRNA och mRNA-nivåer 2,16,23,24. Detta tillvägagångssätt ger en mer direkt avläsning av avstängning, som riktar sig mot RNA, och är särskilt användbart för andra RNAi-mål där avstängning inte ger en synlig fenotyp. En begränsning med att använda artificiella GFP-rapportörer är att exogena och endogena sekvenser är differentiellt reglerade i transgenerationellt RNAi11. Studier med endogena mål, såsom den temperaturkänsliga embryonala letala allelen OMA-1(zu405)1,11,16,25, bör därför betraktas som ett komplement till fluorescerande transgenrapportörer.
Analysen av ChIP i samband med RNAi-arvsanalyser kräver jämförelse mellan behandlingar och replikat. För det första, för att ta hänsyn till skillnader i utgångsmaterial mellan samplingar, normaliseras ChIP-signalen till insignal på samma plats som "procentandelen av ingången". Parallell bearbetning av en histon H3 ChIP hjälper till att avgöra om några histonmodifieringsförändringar motsvarar förändringar i nukleosomtätheten. Dessutom, eftersom ChIP är en process i flera steg, kan effektiviteten variera mellan prover. Valet av lämpliga positiva och negativa kontrollplatser är användbart för att utvärdera och jämföra signal-brusförhållandet mellan prover och experiment. Dessutom, för att underlätta jämförelser mellan prover, normaliseras ofta ChIP DNA qPCR-tröskelcykelvärdena vid RNAi-målet till ett kontrolllokus 3,11,15,23,30,31. För att utvärdera effekterna av RNAi-behandlingen jämförs också förhållandet mellan ChIP-signalen i behandlings-RNAi kontra kontroll- eller inga RNAi-förhållanden. En begränsning med det nuvarande tillvägagångssättet är att ChIP utförs med hela djur, medan svaret på RNAi-behandling kan vara unikt för könscellerna. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna varning är att utföra ChIP med hjälp av isolerade könsceller. Ytterligare tekniska överväganden för att optimera ChIP har också diskuterats utförligt på andra håll32,33.
Sammantaget ger detta RNAi-arv och ChIP-protokoll en detaljerad och lättanpassad grund som kan integreras med andra tekniker för att ytterligare utforska transgenerationell epigenetisk reglering. Till exempel kan sekvenseringsbibliotek med hög genomströmning konstrueras från ChIP-DNA (ChIP-seq) för en mer detaljerad bild av kromatinlandskapet både proximalt till RNAi-målet och på en genomomfattande skala.
Disclosures
Samtliga författare bekräftar att de inte har några konflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi vill tacka laboratorierna i C. elegans-gemenskapen som utvecklade och delade verktygen och vars arbete citeras i detta manuskript. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av ett projektbidrag från Canadian Institutes of Health Research (CIHR) till A.L.S. (PJT-175245). CL stöds av ett forskarstipendium från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bioshop | AGA002 | |
| Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL). |
| Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL). |
| Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
| C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
| Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
| E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
| E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
| Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
| HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
| Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
| IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
| IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
| LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
| Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
| LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
| M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
| Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
| Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
| NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
| NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
| NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
| Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| Plasmid - Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
| Plasmid - GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
| Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
| Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
| Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
| Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
| Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
| Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
| Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
| RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
| RNase A | Sigma | R4642 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
| Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
| Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
| Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
| Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
| Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
References
- Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
- Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
- Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
- Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882 (2006).
- Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
- Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
- Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).
- Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
- Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
- Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
- Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448 (2019).
- Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
- Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797 (2021).
- Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
- Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
- Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
- Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
- Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
- Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
- Stiernagle, T.
- Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
- Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
- Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6 (2017).
- Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
- Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
- Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
- Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
- Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
- Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).
