Summary
Denne protokol beskriver en RNA-interferens og ChIP-assay for at studere den epigenetiske arv af RNAi-induceret hæmning og associerede kromatinmodifikationer i C. elegans.
Abstract
Transgenerationel epigenetisk arv (TEI) tillader transmission af information gennem kimlinjen uden at ændre genomsekvensen gennem faktorer som ikke-kodende RNA'er og kromatinmodifikationer. Fænomenet RNA-interferens (RNAi) arv i nematoden Caenorhabditis elegans er en effektiv model til at undersøge TEI, der udnytter denne modelorganismes korte livscyklus, selvformering og gennemsigtighed. I RNAi-arv fører eksponering af dyr for RNAi til genhæmning og ændrede kromatinsignaturer på målstedet, der vedvarer i flere generationer i fravær af den oprindelige udløser. Denne protokol beskriver analysen af RNAi-arv i C. elegans ved hjælp af en kimlinje-udtrykt nukleært grønt fluorescerende protein (GFP) reporter. Reporterhæmning initieres ved at fodre dyrene med bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA rettet mod GFP. Ved hver generation passeres dyr for at opretholde synkroniseret udvikling, og reportergenhæmning bestemmes ved mikroskopi. Ved udvalgte generationer indsamles og behandles populationer til kromatinimmunudfældning (ChIP)-kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) for at måle histonmodifikationsberigelse på GFP-reporterens locus. Denne protokol til undersøgelse af RNAi-arv kan let ændres og kombineres med andre analyser for yderligere at undersøge TEI-faktorer i små RNA- og kromatinveje.
Introduction
Epigenetisk arv tillader overførsel af genregulerende information på tværs af generationer og kan derfor tillade forældrenes miljø eller oplevelser at påvirke deres afkom. I C. elegans kan kimlinjegenhæmning initieret af eksogent dobbeltstrenget RNA (dsRNA) nedarves i flere generationer i afkom, der ikke udsættes for den oprindelige udløser 1,2,3,4. Denne proces, kaldet RNA-interferens (RNAi) arv, er et af flere relaterede epigenetiske hæmningsfænomener i C. elegans, herunder piRNA-initieret multigenerationel hæmning 2,5, paramutation / RNAe (RNA-induceret epigenetisk hæmning) 6,7,8 og multicopy array-initieret hæmning9, som har overlappende, men forskellige krav til små RNA- og kromatinreguleringsmaskiner . I C. elegans eksogene RNAi behandles dsRNA til små interfererende RNA'er (siRNA'er), der virker i et kompleks med primære Argonaut-proteiner for at genkende deres mål-mRNA. Denne målretning fører til amplifikation af sekundære siRNA'er, der associerer med sekundære argonauter for at dæmpe mål-mRNA gennem både cytoplasmatiske og nukleare hæmningsveje. For kimlinjeudtrykte RNAi-mål er de nukleare sekundære Argonaute HRDE-1 og yderligere nukleare RNAi-faktorer rettet mod spirende transkripter, hvilket resulterer i transkriptionel undertrykkelse og rekruttering af histonmethyltransferaser til deponering af repressive kromatinmærker, herunder H3K9me310. Histon H3K9me3 fremmer etableringen af arvelig hæmning af kimlinje-udtrykte grønne fluorescerende protein (GFP) transgener ved RNAi arv11,12.
Målet med denne protokol er at anvende et transgen, der udtrykker et GFP-histonfusionsprotein i kimlinjen som reporter for RNAi-arv og at analysere ændringer i histonmodifikationer på reportertransgen-locus ved anvendelse af kromatinimmunudfældning og kvantitativ polymerasekædereaktion (ChIP-qPCR). Denne protokol beskriver en standardiseret pladebaseret RNAi-fodringsmetode til initiering af reporterhæmning. Det giver også en detaljeret tidslinje for overførsel af dyr mellem generationer ved isolering i livmoderembryoner fra gravide voksne ved alkalisk hypochloritbehandling ("blegning"). Metoder og repræsentative data til overvågning af hyppigheden af GFP-hæmning i en delmængde af populationen ved fluorescensmikroskopi og for histon H3K9me3 ChIP-qPCR er også beskrevet. Reporterbaserede RNAi-arveassays giver et meget medgørligt system til funktionelt at dissekere rollerne af genetiske og miljømæssige faktorer i epigenetisk regulering 13,14, og genetiske skærme ved hjælp af sådanne reportere har identificeret både gener, der kræves til 2,3,15 og gener, der negativt regulerer16,17 varigheden af transgenerationel epigenetisk arv.
Protocol
BEMÆRK: En analysetidslinje er angivet i figur 1.
1. Fremstilling af RNAi nematode vækstmedium (RNAi-NGM) plader
- Stribe E. coli HT115 (DE3) indeholdende enten GFP eller kontrol RNAi-vektorer fra glycerolstammer på Luria-Bertani (LB) agarplader suppleret med 100 μg / ml ampicillin. Bakterierne inkuberes natten over ved 37 °C.
- Den følgende dag fremstilles RNAi-NGM-plader (1,7% [w/v] agar, 0,3% [w/v] NaCl, 0,25% [w/v] pepton, 1 mMCaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM kaliumphosphatbuffer [pH 6,0], 1 mMMgSO4, 25 μg/ml carbenicillin og 5 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid [IPTG]) i henhold til standardprotokol18.
- For hver stamme i analysen fremstilles mindst seks RNAi-NGM-plader podet med GFP RNAi (to plader for hver af de tre biologiske replikater) og to RNAi-NGM-plader podet med kontrol-RNAi (en biologisk replikat).
- Telt pladerne løst med folie for at beskytte mod lys og lad dem stå natten over ved stuetemperatur for at tørre.
- Samme dag som RNAi-NGM-pladehældning fremstilles 4 ml flydende kulturer af RNAi-bakterier.
- Under sterile betingelser blev alikvote 4 ml LB bouillon suppleret med 10 μg/ml tetracyklin og 100 μg/ml ampicillin i dyrkningsrør. Der plukkes enkelte kolonier fra LB-agarpladerne i hvert rør, som inkuberes natten over, mens de rystes i ca. 16 timer ved 37 °C.
- Frø RNAi-bakterier på RNAi-NGM-pladerne.
- Efter vækst natten over måles den optiske tæthed (OD600) af kulturer ved hjælp af en 1: 5 fortynding af bakterier med LB bouillon.
- Fortynd RNAi-bakterier til en relativ OD 600 af 2 ved hjælp af LB bouillon suppleret med 10 μg / ml tetracyclin og100 μg / ml ampicillin.
- Under sterile betingelser tilsættes 150 μL af kontrol- eller GFP RNAi-bakterierne på hver RNAi-NGM-plade.
- Telt pladerne med folie og lad bakterierne vokse i mindst 24 timer ved stuetemperatur før brug.
BEMÆRK: Ubrugte RNAi-NGM-plader kan opbevares omvendt i op til 1 uge ved 4 °C i en forseglet beholder i mørke.
2. Start af RNAi-arveassayet: blegning og plettering af embryoner til P0-generationen
BEMÆRK: Før RNAi-arveanalysen påbegyndes, skal orme, der indeholder GFP-reporteren mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 , opretholdes usultet ved 21 °C i mindst to generationer.
- 4 dage (96 timer) før starten af RNAi-arveanalysen (figur 1) vælges tre eller fire gravide voksne på hver 35 mm standard NGM-plade podet med OP50-1-bakterier.
BEMÆRK: Tre NGM-plader pr. stamme er tilstrækkeligt. For stammer med nedsat fertilitet kan der kræves mere end fire dyr pr. plade. - Efter 4 dage skal du sikre dig, at den voksne befolkning er begyndt at lægge embryoner på pladen. Ormene vaskes af pladerne i 1,5 ml rør med 800 μL M9-buffer suppleret med Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1mMMgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Gentag vasken og poolen i det samme rør.
- Isoler embryonerne fra befolkningen ved blegning som følger.
- Forbered en blegeopløsning med blegemiddel (6% natriumhypochlorit) og 10 N NaOH i et volumenforhold på 1,5: 1. Der fremstilles en tilstrækkelig mængde til, at der kan anvendes 250 μL til hver prøve.
- Centrifuger de 1,5 ml rør med ormene ved 1.000 x g i 1,5-2 min.
- Supernatanten suges op, og der efterlades 100 μL uden at forstyrre ormens »pellet«. Alternativt kan rørene stå i ca. 2 minutter for at lade ormene sætte sig, før de aspirerer.
- Der tilsættes 650 μL ddH2O til hvert rør for at opnå et slutvolumen på 750 μL.
BEMÆRK: Følgende trin er tidsfølsomme. - Tilsæt 250 μL blegeopløsning til hvert rør, og start en timer.
- Hvert 1-2 minut hvirvler rørene grundigt. Efter 5 minutter skal du kontrollere ormene under stereoskopet for at overvåge nedbrydningen af voksne.
- Fortsæt hvirvelstrømmen, indtil ormene er helt opløst, og kun embryoner forbliver. Centrifuger straks glassene ved 1.000 x g i 1,5 min.
BEMÆRK: Blegning er generelt afsluttet inden for 6-7 minutter, men bør overvåges under et stereoskop med en forstørrelse, der er tilstrækkelig til at observere de frigivne embryoner (40x). Lad ikke ormene være i blegemiddel i længere tid, da dette vil kompromittere embryonerne. - Efter centrifugering suges supernatanten op, og der efterlades ca. 50-100 μl. Der tilsættes 1 ml M9-buffer med TX-100 til vask og blanding ved hvirvelstrøm. Centrifuger igen ved 1.000 x g i 1,5-2 min og vask mindst to gange mere.
- Supernatanten suges ud af den endelige vask og efterlader ca. 100 μL i glasset. Bland ved hvirvelstrøm. Der pipetteres 2 μL fra hvert rør to gange på et mærket glasglas. Embryonerne tælles ved hjælp af en tælletæller for at estimere koncentrationen af embryoner pr. mikroliter.
BEMÆRK: Slides med flere frostede brønde kan bruges her til at tælle replikater af flere stammer. Tælleglas kan vaskes og genbruges.
- For at starte en semi-synkroniseret befolkningstilvækst blandes og pipetteres et volumen indeholdende 250 embryoner på hver RNAi-NGM-plade. Brug to plader til hver replikat. Lad væsken absorbere.
- For P0-generationen behandlet med RNAi inkuberes ved 21 °C i 4 dage (96 timer) (fra embryoner til voksenalderen). Tidspunkter kan variere med genotype.
Figur 1: RNAi-arveassayskematisk. Foreslået tidslinje for RNAi-NGM-pladeforberedelse og opsætning af RNAi-arveassay. Gravide voksne plukkes på dag -4 på NGM-plader podet med OP50-1. Efter 4 dage bleges voksent afkom, og embryoner belægges på RNAi-NGM-plader. P0-generationen udsættes for RNAi i 4 dage ved 21 °C. Når ormene når voksenalderen, passeres replikater ved blegning og scores for kimlinje GFP-ekspression hver generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Overførsel og scoring af hver generation for germline GFP-ekspression
BEMÆRK: For at lette scoring skal du bruge en vinylplade til at oprette agarosepuder med lineære kamme for at stille ormene op. Denne metode blev tilpasset fra Rivera Gomez og Schvarzstein19.
- Der fremstilles 1% (w/v) agarose ved at opløse agarose i ddH2O i en lille kolbe ved opvarmning i mikrobølgeovn. Tilsæt en omrøringsstang og dæk med folie. Ved omsmeltning opvarmes agarosen på en kogeplade ved 200 °C under omrøring. Når den er smeltet, reduceres varmen til 80 °C.
- Vask ormene af NGM-pladerne ved hjælp af 800 μL M9-buffer med TX-100 i et 1,5 ml rør. Vask pladerne to gange for at fjerne alle gravide voksne. Kontroller pladerne under stereoskopet for at bekræfte, at dyrene er blevet indsamlet effektivt.
- Centrifuger glassene ved 1.000 x g i 1,5-2 min eller lad ormene bundfælde sig i 2 min. Supernatanten suges op, og der lades 100 μL uden at forstyrre ormens »pellet«.
- Forbered agarosepuder til montering af ormene som følger.
- Læg en dråbe smeltet 1% (w/v) agarose på vinylpladen (beskrevet tidligere19) ved hjælp af en Pasteur-pipette af glas (med den smalle ende brækket af).
- Orienter et glasglas, så linjerne på pladen enten er vandrette eller lodrette, og placer glideren hurtigt på dråben af agarose. Vent ca. 30 sek., før glasglasset fjernes fra posten.
BEMÆRK: Hvis du scorer flere genotyper, kan det være nyttigt at lave en større agarosepude på et dias og skære den i halve ved hjælp af et blad.
- Monter ormene på agarosepuderne.
- Under stereoskopet tilsættes ca. 5 μL 5 mM levamisol til agarosepuden. Levamisolfortyndingen skal gøres frisk hver uge.
- Svip forsigtigt rørene med orme for at blande og overføre 5-10 μL orme til agarosepuden. Anslå antallet af orme med øjet, når de tilføjes, så der er ca. 40 orme pr. Replikat.
- Stil ormene op i rækker ved hjælp af en øjenvippepluk for lettere at score. Tilføj en glasdæksel.
BEMÆRK: Slides med dyr monteret på denne måde kan vare i flere timer, før de tørrer ud.
- Isoler embryonerne fra de resterende dyr ved hjælp af blegningsprotokollen (se trin 2.3), før du scorer diasene. Plade 250 embryoner på 35 mm NGM-plader podet med OP50-120. Når væsken er absorberet, vendes pladerne på hovedet, og de returneres til inkubatoren for 21 °C.
- Brug et florescensstereoskop med et GFP-filtersæt. Tæl og registrer antallet af GFP-positive og GFP-negative orme på diasene for hver replikat ved hjælp af en optællingstæller.
BEMÆRK: GFP-positive orme vil have nuklear GFP-ekspression i deres kimlinje og embryoner i livmoderen. Kimlinjerne af GFP-negative orme vil ikke fluorescere, men da GFP begynder at tænde igen i senere generationer, kan fluorescensen være svag. Det kan være nyttigt at montere yderligere ikke-transgene ormstammer for at tage højde for enhver observeret autofluorescens. - Populationen passerer gennem blegning som beskrevet ovenfor ca. hver 4. dag (96 timer) ved 21 °C. Alternativt kan passaging ske på en skiftevis 3-dages / 4-dages tidsplan for nemheds skyld. Plade en ekstra ~ 50 embryoner til de kortere passerende generationer, hvis skiftevis, da der kan være et lavere udbytte af embryoner efter 72 timer.
BEMÆRK: Hold P0-generationens passeringstid konsistent ved 4 dage efter plettering af embryoner.
4. Indsamling af dyr til ChIP
BEMÆRK: Antallet af dyr og timing afhænger af stammen, udviklingsstadiet, epitopen og antallet af immunudfældningsmål (IP). I eksemplet nedenfor skal du indsamle dyr til tre IP'er: H3K9me3, histon H3 og IgG-kontrol. ChIP-protokollen blev tilpasset fra Askjaer et al.21.
- Før ChIP-prøveindsamling udvides den forrige generation af RNAi-arveassayet med yderligere tre NGM-plader (til mindst fire plader pr. Replikat). Voks i 4 dage ved 21 °C.
- Bleg de gravide voksne for at isolere embryonerne (se trin 2.3).
- For hver stamme anbringes ca. 3 500 embryoner på 14 plader (250 pr. plade) og vokser i 3 dage ved 21 °C til det unge voksenstadium.
- Dyrene vaskes i 1,5 ml rør med fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). Centrifuger ved 1.000 x g i 2 min. Opsug og saml dyrene fra en stamme i et rør og vask yderligere tre gange med mindst 1 ml PBS / TX.
- Der suges til 1.000 μL, vendes om for at blandes, og antallet af dyr i 3 μL tælles tre gange (se trin 2.3.9).
- Beregn koncentrationen af dyr og overfør et volumen svarende til 3.000 dyr til et nyt rør til formaldehydtværbinding.
- Sørg for, at det samlede volumen er mindst 10 gange ormens pelletvolumen.
5. Formaldehyd tværbinding
FORSIGTIG: Arbejd med formaldehyd i en stinkhætte for at forhindre dampeksponering.
- Tilsæt formaldehyd (1,8% endelig koncentration) til røret indeholdende ormene. Drej ved stuetemperatur i 6 min.
- Frys straks i flydende nitrogen. Forsøget kan sættes på pause på dette trin, og prøverne kan opbevares ved -80 °C.
- Den tværbundne prøve optøs i et vandbad ved stuetemperatur i 3 minutter og roteres i 16 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1,25 M glycin til en slutkoncentration på 125 mM og drej i 5 min.
BEMÆRK: Indtil magnetisk perleeluering opbevares prøverne på is eller ved 4 °C og anvendes iskolde buffere. - Centrifuger prøven ved 1.000 x g i 3 min. Vask tre gange med 1 ml PBS/TX hver gang. Vask to gange med 1 ml resuspensionsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA], 0,01% TX-100, proteasehæmmer [en tablet pr. 5 ml]).
- Efter den sidste vask skal du efterlade tilstrækkelig buffer til at sikre, at det samlede volumen er mindst tre gange pelletvolumenet og mindst ~ 100 μL.
6. Sonikering
BEMÆRK: Sonikeringsparametre afhænger af typen og modellen af sonikator og dyrestadium. Parametre som prøvevolumen og koncentration, tænd / sluk-intervaller, antal cyklusser og effektindstilling skal optimeres empirisk. For eksempel, over et tidsforløb af sonikering, overvåge ormlyse ved hjælp af et proteinassay og bestemme, hvornår koncentrationen når et plateau. Derudover overvåges, når den gennemsnitlige forskydningsstørrelse af det genomiske DNA er ca. 200-1.000 bp ved elektroforese af DNA, renset efter tværbindingsreversering, på en 1,5% agarose/tris-acetat-EDTA (TAE) gel.
- Mål mængden af prøver fra det foregående trin. Bland og alikvote 90-120 μL til et polystyren sonikeringsrør.
- Tilsæt et tilsvarende volumen resuspensionsbuffer indeholdende 2x vaskemidler (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2% natriumdeoxycholat, 0,7% sarkosyl).
- Sonikere i et vandbad sonikator ved 50% effekt i 7 min (20 s on / 40 s slukket) ved 4 ° C. Bland forsigtigt ved pipettering. Gentag sonikeringen i yderligere 7 minutter.
- Overfør sonikeret lysat til et 1,5 ml rør. Der tilsættes 0,5 volumenvolumen resuspensionsbuffer uden rengøringsmidler (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (f.eks. tilsættes 100 μL buffer til 200 μL prøve).
- Der centrifugeres ved 13.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Lysatsupernatanten opbevares og overføres til et nyt glas.
- Udfør eventuelt et proteinassay for at bestemme koncentrationerne af hvert lysat. Dette trin kan være nyttigt i forbindelse med store stikprøvemængder eller sammenligninger mellem assayer. Standardisering af antallet af dyr som beskrevet ovenfor fungerer dog godt for de prøvemængder, der er beskrevet her, da der er bedre korrelation med udbyttet af kromatin / DNA som bestemt ved qPCR.
7. Immunudfældning
BEMÆRK: Skaler mængden af antistof og magnetiske perler til volumen og koncentration af lysat.
- Lysatsupernatanten opdeles i fire portioner: tre lige store volumener for hver IP og 10% af en IP's volumen som input (f.eks. 100 μL IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL input). Overfør IP-lysatet til et 200 μL PCR-rør, og opbevar indgangslysatet ved -20 °C i et 1,5 ml rør.
- Der tilsættes 0,5 μg anti-H3K9me3-antistof, H3-antistof eller IgG til den relevante IP-prøve. Der inkuberes ved 4 °C natten over med rotation.
- Den følgende dag alikvote 9 μL protein G-belagte magnetiske perler pr. IP til et enkelt 1,5 ml rør. Vask perlerne to gange med 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% natriumdeoxycholat).
- Resuspender de magnetiske perler i FA-150-bufferen til det oprindelige volumen, der blev taget fra lageret i trin 7.3 ovenfor. Der tilsættes 7,5 μL til hver IP. Der inkuberes ved 4 °C i 2 timer med rotation.
8. Vasker og eluering
BEMÆRK: For at sikre, at de magnetiske perler ikke tørrer, skal du tilføje hver vaske- eller elueringsbuffer hurtigt efter opsugning af den forrige vask.
- Brug 0,2-1 ml af følgende bufferopløsninger hver gang til at vaske perlerne. Saml perlerne på et magnetisk stativ for at aspirere vaskene. Hver vask inkuberes ved 4 °C i 5 minutter med rotation. Følg rækkefølgen som nedenfor.
- Vask to gange med FA-150.
- Vask én gang med FA-1M (FA-150 med 1 M NaCl).
- Vask én gang med FA-0,5M (FA-150 med 0,5 M NaCl). Overfør til et nyt PCR-rør.
- Vask én gang med TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% natriumdeoxycholat).
- Vask to gange med TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
BEMÆRK: Fortsæt prøvebehandlingen ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Opsug den sidste vaskebuffer. Resuspender de magnetiske perler med 50 μL ChIP-elueringsbuffer (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% natriumdodecylsulfat [SDS]) og overfør til et 1,5 ml rør.
- Eluer ved 65 °C i 15 minutter i en termomixer med blanding ved 1.000 o/min i 5 sek. pr. minut.
- Perlerne samles på et magnetstativ og overfør supernatanten til et nyt glas.
- Elueringen gentages med yderligere 50 μL ChIP-elueringsbuffer. Supernatanterne samles til i alt 100 μl. Der fortsættes med omvendt tværbinding og DNA-eluering som beskrevet nedenfor.
9. Omvendt tværbinding og DNA-eluering
- Optø inputlysatprøven. Fyld op til 100 μL med ChIP-elueringsbuffer.
- Der tilsættes 16,5 μg RNase A til hver IP- og inputprøve. Der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Der tilsættes 40 μg proteinase K og inkuberes ved 55 °C i 2 timer. Derefter inkuberes ved 65 °C natten over.
- Afkøl prøverne til stuetemperatur og rens DNA'et med et spin-kolonnesæt.
10. qPCR-reaktionsopsætning og kørsel
BEMÆRK: Primer-, reaktionsopsætnings- og termocyklerparametrene skal ændres, så de matcher producentens anbefalinger for qPCR-reaktionsblandingen i brug.
- Forbered primersæt rettet mod GFP RNAi-reporteren og H3K9me3 positive og negative berigelseskontrolregioner. Primerens smeltetemperatur er 60 °C. Se Materialetabel for primersekvenser.
- For input-DNA'et skal du lave fire firedobbelte serielle fortyndinger (f.eks. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
BEMÆRK: IP-DNA'et kan anvendes direkte eller fortyndes (f.eks. 1:2 eller 1:3) for at muliggøre flere reaktioner. Fortyndingens egnethed skal bestemmes empirisk, da qPCR-ydeevnen kan blive påvirket. - Organiser alle reaktioner svarende til et primersæt på en PCR-plade. Opsæt tekniske duplikatreaktioner for hver input-DNA-fortynding og hver IP-DNA-prøve. Hver 10 μL reaktion indeholder 1,5 μL input- eller IP-DNA (eller elueringsbuffer som kontrol), qPCR-masterblanding (1x slutkoncentration), fremadgående primer og omvendt primer (400 nM slutkoncentration for hver primer).
- På en termocyklist i realtid skal du køre følgende program: indledende denaturering: 95 ° C i 4 minutter; amplifikation og fluorescensdetektion: 40 cyklusser på 95 °C i 10 s og 60 °C i 30 s med en aflæst plade endelig forlængelse: 60 °C i 5 min; smeltekurve: fra 60 °C til 90 °C i trin på 0,5 °C, 5 s pr. trin.
11. Bestemmelse af forstærkningseffektivitet og kontrol af produktspecificitet
- For hvert sæt input-DNA-fortyndinger afbildes de fire datapunkter med [log10(1/fortynding)] på x-aksen og [Input Cq] på y-aksen. Bestem hældningen af linjen med den bedste pasform.
- Beregn forstærkningseffektiviteten. Ideelle primersæt skal konsekvent vise 95% -100% effektivitet.
- Kontroller, at alle reaktionerne har en skarp smeltekurvetop, og at reaktioner med det samme primersæt har samme smeltetemperatur. Flere toppe eller forskellige smeltetemperaturer kan indikere ikke-specifik forstærkning.
- Kør eventuelt reaktioner på en standard 2% agarose/TAE gel ved stuetemperatur for at kontrollere produktbåndets størrelse.
12. Beregning af procentdelen af input
- Beregn indgangsfortyndingsfaktoren. Da 10% af IP-lysatvolumenet blev gemt som input, er fortyndingsfaktoren for 1:5-fortyndingen af input-DNA 50.
- Bestem IP-fortyndingsfaktoren. Hvis IP-DNA'et ikke fortyndes før qPCR, er fortyndingsfaktoren 1.
- Beregn Cq-forskellen mellem IP og input justeret for fortyndingsfaktorer.
- Beregn procentdelen af input.
Representative Results
Dyr, der bærer den kimlinjeudtrykte GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 reporter (figur 2A) blev eksponeret for GFP RNAi eller kontrol-RNAi ved fodring og passerede som beskrevet i protokollen og figur 1. Kernekraft-GFP-signal i kimlinjen blev manuelt scoret ved hjælp af et fluorescensdissekerende mikroskop for en prøve af befolkningen ved hver generation. Hæmning af transgenet var fuldt penetrerende i de scorede P0- og F1-dyr, der blev behandlet med GFP RNAi (figur 2B). I F2-generationen var andelen af befolkningen, der udviste arv af GFP-hæmning, ca. 50%. Ved F5-generationen viste størstedelen af befolkningen ikke arv af tavshed, og ved F10-generationen blev der ikke påvist nogen arv, da alle dyrene udtrykte GFP.
For at bestemme ændringen i histon H3K9me3-berigelse svarende til RNAi-induceret hæmning blev ChIP-qPCR udført på F1-generationsdyr efter enten GFP RNAi- eller kontrol-RNAi-behandling. Som forventet viste GFP RNAi-behandlede population højere histon H3K9me3-niveauer ved GFP-målet og ved 1,3 kb downstream-regionen sammenlignet med kontrol-RNAi-behandlede dyr (figur 2C). Specificiteten af histonen H3K9me3 ChIP understøttes af berigelsen på et positivt kontrolsted (clec-18), der vides at være beriget i dette mærke, men ikke på et nærliggende negativt kontrolsted (hrp-2). Histone H3-berigelse og nærbaggrundsberigelse i IgG-kontrolimmunudfældningerne blev også påvist på alle qPCR-loci, som forventet. Når ChIP-berigelse hos reporteren normaliseres til clec-18-positivt kontrolsted, vises højere histon H3K9me3-berigelse ved GFP RNAi, mens histon H3-berigelse er ens mellem kontrol- og GFP RNAi-behandlingerne (figur 2D). Da GFP RNAi ikke forventes at påvirke histon H3K9me3 eller total histon H3-belægning ved clec-18-locus , afbøder denne normalisering mod teknisk variation, såsom forskelle i ChIP-effektivitet mellem GFP RNAi og kontrol-RNAi-prøver. Foldændringen af histon H3K9me3 og histon H3 niveauer mellem RNAi-behandlinger viser GFP-reporter-specifik histon H3K9me3-berigelse, uafhængig af histonbelægning, ved GFP RNAi-induceret hæmning (figur 2E).
Figur 2: GFP RNAi-induceret hæmning svarer til forhøjet H3K9me3-berigelse ved RNAi-målet. (A) Diagram over den kimlinjeudtrykte GFP RNAi-reporter mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] med qPCR-amplikon regioner mærket. (B) GFP-ekspression scoret på tværs af generationer efter RNAi-behandlinger ved 21 °C. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen fra to biologiske replikater. (C) ChIP-qPCR af H3K9me3, histon H3 og IgG-kontrol hos F1 unge voksne fra to biologiske replikater. clec-18 og hrp-2 er henholdsvis positive og negative kontrolsteder for H3K9me3-berigelse. (D) H3K9me3 og histon H3 berigelse ved GFP RNAi reporter normaliseret til clec-18 positive kontrol locus. (E) Ændring i H3K9me3 og histon H3 berigelse mellem GFP RNAi- og kontrol RNAi-behandlede dyr, med normalisering til clec-18. Stiplet linje repræsenterer en foldændring på 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
I denne protokol introduceres dsRNA ved fodring, som er blevet en standardmetode i C. elegans18. For RNAi-arveassays giver fodringsmetoden en nem metode til at opnå en stor P0-population 2,11,12,22,23,24,25. Imidlertid påvirker timingen og varigheden af RNAi-eksponering effektiviteten af transgenhæmning26, og koncentrationen af RNAi-bakterier påvirker persistensen af arvelig RNAi-hæmning1. Derfor er standardiserede RNAi-bakterier og ormevækst vigtige for at opnå et ensartet niveau af GFP-hæmning og arvevarighed. Her belægges embryoner på RNAi-plader, så P0-dyr udsættes for RNAi-bakterier fra klækning. Alternative tilgange har belagt synkroniserede L1 24,27 ellerL4 25 fase dyr på RNAi-NGM plader. Da sult og andre belastninger påvirker vedligeholdelsen af RNAi-arv13, skal pladerne overvåges for at forhindre overfyldning og udmattelse af fødevareforsyningen. Som et alternativ til at initiere RNAi ved fodring inducerede nogle af pionererne C. elegans RNAi-arvestudier RNAi gennem gonadeinjektion, hvilket giver en større kontrol af dsRNA-koncentrationen 1,28.
I denne protokol passeres hver generation som en population med alkalisk hypochloritbehandling, som tidligere beskrevet 16,22,23,24. Hypochloritbehandling sikrer, at F1-generationen ikke bliver forurenet med RNAi-bakterier fra forældremiljøet22 og forhindrer potentiel uønsket befolkningsflaskehals. Imidlertid kan bulkoverførsel også være en begrænsning, da individuelle dyr kan have forskellige arvemønstre 1,29. En alternativ metode til at fastslå hver generation er at udvælge individuelle dyr 1,2,9,11,25. Denne tilgang giver mulighed for at spore fænotyper inden for slægter og inkorporering af genetiske krydsninger. Afstamningsanalyse kan også være fordelagtigt for fænotyper med lav penetrans12.
Fluorescerende proteinekspression er en kraftfuld og bekvem aflæsning af RNAi-induceret hæmning 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrevet i denne protokol kan GFP-udtryk manuelt scores som ON eller OFF 11,12,15,16,25. Manuel scoring kan forbedres yderligere ved at tildele kvalitative intensitetsniveauer 3,4,14. Alternativt kan automatiseret intensitetsscoring af mikroskopibilleder 11,12,14,25,27 eller flowcytometrifluorescensmåling af levende dyr2 give en kvantitativ aflæsning med høj kapacitet. Da reporterekspressionen imidlertid er begrænset til kimlinjen, er en advarsel ved automatiserede tilgange, at de også skal skelne mellem dyr med tavs GFP-ekspression versus dyr uden kimlinje, især hvis undersøgelsen inkorporerer mutanter med unormal kimlinjeudvikling. Som et alternativ til GFP-fluorescens kan revers transkription (RT)-qPCR anvendes til at kvantificere RNAi-målpræ-mRNA- og mRNA-niveauer 2,16,23,24. Denne tilgang giver en mere direkte aflæsning af hæmning, som er rettet mod RNA, og er især nyttig for andre RNAi-mål, hvor hæmning ikke producerer en synlig fænotype. En begrænsning ved at bruge kunstige GFP-reportere er, at eksogene og endogene sekvenser reguleres forskelligt i transgenerationelt RNAi11. Undersøgelser med endogene mål, såsom den temperaturfølsomme embryonale letalallel oma-1(zu405)1,11,16,25, bør derfor betragtes som en komplementær tilgang til fluorescerende transgenreportere.
Analysen af ChIP i forbindelse med RNAi-arveassays kræver sammenligning mellem behandlinger og replikater. For det første, for at tage højde for forskelle i udgangsmateriale mellem prøver, normaliseres ChIP-signalet til indgangssignal på samme sted som 'procentdelen af input'. Behandling af en histon H3 ChIP parallelt vil bidrage til at bestemme, om eventuelle histonmodifikationsændringer svarer til ændringer i nukleosomtæthed. Da ChIP desuden er en proces i flere trin, kan effektiviteten variere mellem prøverne. Udvælgelsen af egnede positive og negative kontrolsteder er nyttig til evaluering og sammenligning af signal-støjforholdet mellem prøver og forsøg. For at lette sammenligninger mellem prøver normaliseres ChIP DNA qPCR-tærskelcyklusværdierne ved RNAi-målet ofte til et kontrolsted 3,11,15,23,30,31. For at evaluere virkningerne af RNAi-behandlingen sammenlignes også forholdet mellem ChIP-signalet i behandlings-RNAi versus kontrol eller ingen RNAi-betingelser. En begrænsning af den nuværende tilgang er, at ChIP udføres med hele dyr, mens responset på RNAi-behandling kan være unikt for kimlinjen. En tilgang til at overvinde denne advarsel er at udføre ChIP ved hjælp af isolerede kimlinjekerner. Yderligere tekniske overvejelser for optimering af ChIP er også blevet diskuteret udførligt andetsteds32,33.
Samlet set giver denne RNAi-arv og ChIP-protokol et detaljeret og let at tilpasse fundament, der kan integreres med andre teknikker til yderligere at udforske transgenerationel epigenetisk regulering. For eksempel kan sekventeringsbiblioteker med høj kapacitet konstrueres ud fra ChIP-DNA (ChIP-seq) for en mere detaljeret visning af kromatinlandskabet både proksimalt til RNAi-målet og på genom-bred skala.
Disclosures
Alle forfattere bekræfter, at de ikke har nogen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker at anerkende laboratorierne i C. elegans-samfundet , der udviklede og delte værktøjerne, og hvis arbejde er citeret i dette manuskript. Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af et Canadian Institutes of Health Research (CIHR) projekttilskud til A.L.S. (PJT-175245). CL støttes af et Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) postgraduate stipendium (PGS-D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bioshop | AGA002 | |
| Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL). |
| Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL). |
| Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
| C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
| Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
| E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
| E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
| Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
| HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
| Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
| IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
| IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
| LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
| Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
| LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
| M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
| Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
| Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
| NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
| NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
| NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
| Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| Plasmid - Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
| Plasmid - GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
| Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
| Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
| Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
| Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
| Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
| Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
| Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
| RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
| RNase A | Sigma | R4642 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
| Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
| Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
| Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
| Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
| Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
References
- Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
- Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
- Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
- Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882 (2006).
- Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
- Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
- Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).
- Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
- Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
- Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
- Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448 (2019).
- Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
- Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797 (2021).
- Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
- Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
- Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
- Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
- Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
- Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
- Stiernagle, T.
- Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
- Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
- Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6 (2017).
- Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
- Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
- Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
- Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
- Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
- Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).
