Summary
이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi 유도 침묵 및 관련 염색질 변형의 후성유전학적 유전을 연구하기 위한 RNA 간섭 및 ChIP 분석을 설명합니다.
Abstract
세대 간 후성유전학적 유전(TEI)은 비코딩 RNA 및 염색질 변형과 같은 요인을 통해 게놈 염기서열을 변경하지 않고 생식세포를 통해 정보를 전달할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 RNA 간섭(RNAi) 유전 현상은 이 모델 유기체의 짧은 수명 주기, 자가 증식 및 투명성을 활용하는 TEI를 조사하는 데 효과적인 모델입니다. RNAi 유전에서 동물이 RNAi에 노출되면 표적 자리에서 유전자 침묵 및 변경된 염색질 서명이 발생하며, 이는 초기 유발 요인이 없는 상태에서 여러 세대 동안 지속됩니다. 이 프로토콜은 생식세포로 발현된 핵 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 사용하여 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 RNAi 유전 분석을 설명합니다. 리포터 침묵은 GFP를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아를 동물에게 먹이는 것으로 시작됩니다. 각 세대에서 동물은 동기화된 발달을 유지하기 위해 통과되며, 리포터 유전자 침묵은 현미경으로 결정됩니다. 선택된 세대에서, 집단은 GFP 리포터 자리에서 히스톤 변형 농축을 측정하기 위해 염색질 면역침전 (ChIP) - 정량 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)을 위해 수집 및 처리됩니다. RNAi 유전을 연구하기 위한 이 프로토콜은 쉽게 수정될 수 있으며 다른 분석과 결합하여 작은 RNA 및 염색질 경로에서 TEI 인자를 추가로 조사할 수 있습니다.
Introduction
후성유전학적 유전은 유전자 조절 정보를 세대에 걸쳐 전달할 수 있도록 하여 부모의 환경이나 경험이 자손에게 영향을 미칠 수 있도록 합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서, 외인성 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 시작된 생식세포 유전자 침묵은 원래 유발 요인 1,2,3,4에 노출되지 않은 자손에서 여러 세대에 걸쳐 유전될 수 있습니다. RNA 간섭(RNAi) 유전이라고 하는 이 과정은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 여러 관련 후성유전학적 침묵 현상 중 하나로, piRNA 개시 다세대 침묵2,5, paramutation/RNAe(RNA 유도 후성유전학적 침묵)6,7,8 및 다중 복제 배열 시작 침묵 9을 포함하며, 이는 작은 RNA 및 염색질 조절 기계에 대한 중복되지만 뚜렷한 요구 사항을 가지고 있습니다 . 예쁜꼬마선충(C. elegans) 외인성 RNAi에서 dsRNA는 표적 mRNA를 인식하기 위해 1차 아르고넛 단백질과 복합체에서 작용하는 작은 간섭 RNA(siRNA)로 처리됩니다. 이 표적화는 2차 아르고노우트와 결합하는 2차 siRNA의 증폭으로 이어져 세포질 및 핵 침묵 경로를 통해 표적 mRNA를 침묵시킵니다. 생식세포 발현 RNAi 표적의 경우, 핵 2차 Argonaute HRDE-1 및 추가 핵 RNAi 인자는 초기 전사체를 표적으로 하여 H3K9me310을 포함한 억제성 염색질 마크를 침착시키기 위해 전사 억제 및 히스톤 메틸전이효소의 모집을 초래합니다. 히스톤 H3K9me3는 RNAi 유전11,12에 의해 생식세포로 발현된 녹색 형광 단백질(GFP) 전이유전자의 유전성 침묵 확립을 촉진합니다.
이 프로토콜의 목표는 생식세포에서 GFP-히스톤 융합 단백질을 발현하는 전이유전자를 RNAi 유전을 위한 리포터로 사용하고 크로마틴 면역침전 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(ChIP-qPCR)을 사용하여 리포터 전이유전자 자리에서 히스톤 변형의 변화를 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 리포터 침묵을 시작하기 위한 표준화된 플레이트 기반 RNAi 공급 접근 방식을 설명합니다. 또한 알칼리성 차아염소산염 처리('표백')를 통해 자궁 내 배아를 성체로부터 분리하여 세대 간 동물 통과에 대한 자세한 타임라인을 제공합니다. 형광 현미경 검사법과 히스톤 H3K9me3 ChIP-qPCR에 의해 집단의 하위 집합에서 GFP 침묵의 빈도를 모니터링하는 방법 및 대표 데이터도 설명되어 있습니다. 리포터 기반 RNAi 유전 분석은 후성유전학적 조절에서 유전적 및 환경적 요인의 역할을 기능적으로 해부할 수 있는 매우 다루기 쉬운 시스템을 제공하며, 이러한 리포터를 이용한 유전자 스크리닝은 2,3,15에 필요한 유전자와16,17 세대 간 후성유전학적 유전 기간을 부정적으로 조절하는 유전자를 모두 식별했습니다.
Protocol
참고: 분석 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다.
1. RNAi 선충 성장 배지(RNAi-NGM) 플레이트 준비
- 글리세롤 스톡에서 GFP 또는 대조군 RNAi 벡터를 포함하는 대장균 HT115(DE3)를 100μg/mL 암피실린이 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 줄무늬 제거합니다. 박테리아를 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음 날, 표준 프로토콜18에 따라 RNAi-NGM 플레이트(1.7% [w/v] 한천, 0.3% [w/v] NaCl, 0.25% [w/v] 펩톤, 1mM CaCl2, 5μg/mL 콜레스테롤, 25mM 인산칼륨 완충액[pH 6.0], 1mM MgSO4, 25μg/mL 카베니실린 및 5mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드[IPTG])를 준비합니다.
- 분석의 각 균주에 대해 GFP RNAi로 시드된 최소 6개의 RNAi-NGM 플레이트(3개의 생물학적 복제 각각에 대해 2개의 플레이트)와 대조군 RNAi로 시드된 2개의 RNAi-NGM 플레이트(1개의 생물학적 복제물)를 준비합니다.
- 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 접시를 느슨하게 덮고 실온에서 밤새 그대로 두어 건조시킵니다.
- RNAi-NGM 플레이트 주입과 같은 날에 RNAi 박테리아의 액체 배양 4mL를 준비합니다.
- 멸균 상태에서 10μg/mL 테트라사이클린과 100μg/mL 암피실린이 보충된 LB 육수 4mL를 배양 튜브에 분취합니다. LB 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 각 튜브로 선택하고 37°C에서 약 16시간 동안 흔들면서 밤새 배양합니다.
- RNAi-NGM 플레이트에 RNAi 박테리아를 시드합니다.
- 하룻밤 동안 성장시킨 후 LB 육수로 박테리아를 1:5로 희석하여 배양물의 광학 밀도(OD600)를 측정합니다.
- 10μg/mL 테트라사이클린과 100μg/mL 암피실린이 보충된 LB 육수를 사용하여 RNAi 박테리아를 상대 OD600 /2로 희석합니다.
- 멸균 조건에서 150μL의 대조군 또는 GFP RNAi 박테리아를 각 RNAi-NGM 플레이트에 추가합니다.
- 호일로 플레이트를 덮고 사용하기 전에 실온에서 최소 24시간 동안 박테리아가 자랄 수 있도록 합니다.
참고: 사용하지 않은 RNAi-NGM 플레이트는 어두운 곳에서 밀봉된 용기에 4°C에서 최대 1주일 동안 거꾸로 보관할 수 있습니다.
2. RNAi 유전 분석 시작: P0 세대를 위한 배아 표백 및 도금
참고: RNAi 유전 분석을 시작하기 전에 GFP 리포터 mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 을 포함하는 웜은 최소 2세대 동안 21°C에서 굶주리지 않은 상태로 유지되어야 합니다.
- RNAi 유전 분석(그림 1)을 시작하기 4일(96시간) 전에 OP50-1 박테리아가 파종된 각 35mm 표준 NGM 플레이트에 3-4마리의 성충을 선택합니다.
참고: 균주당 3개의 NGM 플레이트면 충분합니다. 생식력이 저하된 균주의 경우 플레이트당 4마리 이상의 동물이 필요할 수 있습니다. - 4일 후, 성인 개체군이 접시에 배아를 낳기 시작했는지 확인하십시오. Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1mMMgSO 4, 0.01 % (v/v) TX-100)이 보충된 800 μL의 M9 완충액을 사용하여 플레이트에서 웜을 1.5 mL 튜브로 세척합니다. 세탁을 반복하고 같은 튜브에 담습니다.
- 다음과 같이 표백을 통해 개체군에서 배아를 분리합니다.
- 표백제(6% 차아염소산나트륨)와 10N NaOH를 1.5:1 부피 비율로 사용하여 표백 용액을 준비합니다. 각 샘플에 250μL를 사용할 수 있도록 충분한 양을 준비합니다.
- 1.5-2분 동안 1,000 x g 에서 웜과 함께 1.5mL 튜브를 원심분리합니다.
- 웜 '펠릿'을 방해하지 않고 100μL를 남기고 상층액을 흡입합니다. 또는 튜브를 약 2분 동안 그대로 두어 흡인하기 전에 웜이 가라앉을 수 있도록 할 수 있습니다.
- 각 튜브에 650μL의 ddH2O를 추가하여 최종 부피 750μL를 얻습니다.
참고: 다음 단계는 시간에 민감합니다. - 각 튜브에 표백 용액 250μL를 추가하고 타이머를 시작합니다.
- 1-2분마다 튜브를 완전히 소용돌이치십시오. 5분 후 스테레오스코프로 벌레를 확인하여 성충의 분해를 모니터링합니다.
- 벌레가 완전히 용해되고 배아만 남을 때까지 계속 소용돌이칩니다. 즉시 튜브를 1,000 x g 에서 1.5분 동안 원심분리합니다.
참고: 표백은 일반적으로 6-7분 이내에 완료되지만 방출된 배아(40x)를 관찰하기에 충분한 배율로 입체경으로 모니터링해야 합니다. 배아를 손상시킬 수 있으므로 지렁이를 표백제에 장기간 방치하지 마십시오. - 원심분리 후 상층액을 흡인하고 약 50-100μL를 남깁니다. TX-9에 M9 완충액 1mL를 TX-100과 함께 추가하여 세척하고 와류로 혼합합니다. 1,000 x g 에서 1.5-2분 동안 다시 원심분리하고 최소 두 번 더 세척합니다.
- 최종 세척에서 상층액을 흡인하고 튜브에 약 100μL를 남겨 둡니다. 소용돌이에 의해 혼합. 각 튜브에서 2 μL를 라벨이 부착된 유리 슬라이드에 두 번 피펫팅합니다. 마이크로리터당 배아의 농도를 추정하기 위해 집계 카운터를 사용하여 배아를 계산합니다.
참고: 여러 개의 젖빛 웰이 있는 슬라이드를 사용하여 여러 균주의 반복을 계산할 수 있습니다. 카운팅 슬라이드는 세척하여 재사용할 수 있습니다.
- 반동기화된 개체군 증가를 시작하려면 250개의 배아가 포함된 부피를 각 RNAi-NGM 플레이트에 혼합하고 피펫팅합니다. 각 반복실험에 대해 두 개의 플레이트를 사용합니다. 액체가 흡수되도록 하십시오.
- RNAi로 처리된 P0 세대의 경우 21°C에서 4일(96시간) 동안 배양합니다(배아에서 성체까지). 시기는 유전자형에 따라 다를 수 있습니다.
그림 1: RNAi 유전 분석 개략도. RNAi-NGM 플레이트 준비 및 RNAi 유전 분석 설정을 위해 제안된 일정. Gravid 성체는 OP50-1로 파종된 NGM 플레이트에 -4일째에 선택됩니다. 4일 후, 성체 자손을 표백하고 배아를 RNAi-NGM 플레이트에 도금합니다. P0 생성은 21°C에서 4일 동안 RNAi에 노출됩니다. 웜이 성충이 되면 복제는 표백을 통해 통과되고 세대마다 생식계열 GFP 발현에 대해 점수가 매겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 생식세포 GFP 발현을 위한 각 세대 Passaging 및 점수 매기기
알림: 점수를 쉽게 매기려면 비닐 레코드를 사용하여 선형 융기가 있는 아가로스 패드를 만들어 웜을 정렬합니다. 이 방법은 리베라 고메즈(Rivera Gomez)와 슈바르츠슈타인(Schvarzstein)19에서 채택되었다.
- 전자레인지에서 가열하여 작은 플라스크에 ddH2O의 아가로스를 용해시켜 1%(w/v) 아가로스를 제조합니다. 교반 막대를 추가하고 호일로 덮습니다. 재용해하는 경우 저어주면서 200°C의 핫플레이트에서 아가로스를 가열합니다. 녹으면 열을 80°C로 줄입니다.
- TX-100과 함께 800μL의 M9 버퍼를 사용하여 NGM 플레이트에서 웜을 1.5mL 튜브로 세척합니다. 접시를 두 번 씻어 모든 육아성 성인을 제거합니다. 동물이 효율적으로 수집되었는지 확인하기 위해 입체경 아래의 플레이트를 확인하십시오.
- 튜브를 1,000 x g 에서 1.5-2분 동안 원심분리하거나 웜이 2분 동안 가라앉도록 합니다. 상층액을 흡인하고 웜 '펠릿'을 방해하지 않고 100μL를 남겨둡니다.
- 다음과 같이 웜을 장착하기 위한 아가로스 패드를 준비합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫(좁은 끝이 부러진 상태)을 사용하여 녹인 1%(w/v) 아가로스 한 방울을 비닐 레코드(이전에설명한 19)에 놓습니다.
- 레코드의 선이 수평 또는 수직이 되도록 유리 슬라이드의 방향을 지정하고 슬라이드를 아가로스 방울에 빠르게 놓습니다. 레코드에서 유리 슬라이드를 제거하기 전에 약 30초 동안 기다리십시오.
알림: 여러 유전자형을 채점하는 경우 하나의 슬라이드에 더 큰 아가로스 패드를 만들고 칼날을 사용하여 반으로 자르는 것이 유용할 수 있습니다.
- 웜을 아가로스 패드에 장착합니다.
- 입체경 아래에서 약 5μL의 5mM 레바미솔을 아가로스 패드에 추가합니다. 레바미솔 희석액은 매주 신선하게 만들어야 합니다.
- 웜 튜브를 부드럽게 튕겨 5-10μL의 웜을 혼합하고 아가로스 패드에 옮깁니다. 반복실험당 약 40개의 웜이 있도록 추가될 때 눈으로 웜 수를 추정합니다.
- 더 쉽게 점수를 매기기 위해 속눈썹 송곳을 사용하여 웜을 일렬로 정렬하십시오. 유리 커버슬립을 추가합니다.
알림: 이러한 방식으로 동물이 장착된 슬라이드는 건조되기 전에 몇 시간 동안 지속될 수 있습니다.
- 슬라이드를 채점하기 전에 표백 프로토콜(2.3단계 참조)을 사용하여 나머지 동물에서 배아를 분리합니다. OP50-1 20으로 파종된 35mm NGM 플레이트에 배아250개를 도금합니다. 액체가 흡수되면 플레이트를 뒤집어 21°C 인큐베이터로 되돌립니다.
- GFP 필터 세트와 함께 형광 스테레오스코프를 사용하십시오. 집계 카운터를 사용하여 각 반복실험에 대한 슬라이드의 GFP 양성 및 GFP 음성 웜 수를 계산하고 기록합니다.
참고: GFP 양성 웜은 생식세포와 자궁의 배아에서 핵 GFP 발현을 갖습니다. GFP 음성 벌레의 생식세포는 GFP가 이후 세대에서 등을 다시 켜기 시작함에 따라, 형광이 희미할지도 모른다 그러나, 형광을 발하지 않을 것입니다. 관찰된 자가형광을 설명하기 위해 추가적인 non-transgenic 웜 균주를 장착하는 것이 도움이 될 수 있습니다. - 위에서 설명한 바와 같이 21°C에서 약 4일(96시간)마다 표백하여 인구를 통과시킵니다. 또는 편의를 위해 3일/4일 일정으로 번갈아 가며 패스에이징을 수행할 수 있습니다. 50시간 후에 배아의 수율이 낮아질 수 있으므로 교대로 더 짧은 패시에이징 세대를 위해 추가 ~72개의 배아를 도금하십시오.
알림: P0 생성 통과 시간을 도금 후 4일째 되는 배아로 일정하게 유지하십시오.
4. ChIP를 위한 동물 수집
참고: 동물의 수와 시기는 균주, 발달 단계, 항원결정기, 면역침전(IP) 표적의 수에 따라 다릅니다. 아래 예에서는 H3K9me3, 히스톤 H3 및 IgG 대조군의 세 가지 IP에 대한 동물을 수집합니다. ChIP 프로토콜은 Askjaer et al.21에서 채택되었습니다.
- ChIP 시료 채취 전에 이전 세대의 RNAi 유전 분석을 3개의 NGM 플레이트를 추가로 확장합니다(복제당 최소 4개의 플레이트로). 21 °C에서 4일 동안 성장시킵니다.
- 배아를 분리하기 위해 성체를 표백합니다(2.3단계 참조).
- 각 균주에 대해 약 3,500개의 배아를 14개의 플레이트(플레이트당 250개)에 도금하고 21°C에서 3일 동안 젊은 성인 단계까지 성장시킵니다.
- 0.01%(v/v) TX-100(PBS/TX)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)가 있는 1.5mL 튜브에 동물을 세척합니다. 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리 한 균주에서 동물을 흡인하여 하나의 튜브에 모으고 최소 1mL의 PBS/TX로 3회 더 세척합니다.
- 1,000 μL까지 흡인하고, 혼합하기 위해 반전하고, 3 μL의 동물 수를 세 번 계산합니다(2.3.9단계 참조).
- 동물의 농도를 계산하고 포름알데히드 가교를 위해 3,000마리에 해당하는 부피를 새 튜브로 옮깁니다.
- 총 부피가 웜 펠릿 부피의 10배 이상인지 확인하십시오.
5. 포름알데히드 가교
주의 : 증기 노출을 방지하기 위해 흄 후드에서 포름알데히드를 사용하십시오.
- 포름알데히드(최종 농도 1.8%)를 웜이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 실온에서 6분 동안 회전합니다.
- 액체 질소에서 즉시 얼립니다. 이 단계에서 실험을 일시 중지할 수 있으며 샘플을 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
- 가교된 샘플을 실온 수조에서 3분 동안 해동하고 실온에서 16분 동안 회전합니다.
- 1.25M 글리신을 최종 농도 125mM에 첨가하고 5분 동안 회전시킵니다.
참고: 마그네틱 비드가 용리될 때까지 샘플을 얼음 위 또는 4°C에 보관하고 얼음처럼 차가운 버퍼를 사용하십시오. - 샘플을 1,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 매번 1mL의 PBS/TX로 3회 세척합니다. 1mL의 재현탁 완충액(150mM NaCl, 50mM HEPES-KOH[PH 7.5], 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA], 0.01% TX-100, 프로테아제 억제제[5mL당 1정])으로 2회 세척합니다.
- 마지막 세척 후 총 부피가 펠릿 부피의 최소 3배이고 최소 ~100μL가 되도록 충분한 버퍼를 남겨 두십시오.
6. 초음파 처리
참고 : 초음파 처리 매개 변수는 초음파 발생기 및 동물 단계의 유형과 모델에 따라 다릅니다. 시료 부피 및 농도, 온/오프 간격, 사이클 수, 전력 설정과 같은 파라미터는 경험적으로 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 초음파 처리 과정에서 단백질 분석을 사용하여 웜 용해를 모니터링하고 농도가 정체기에 도달 할 때를 결정합니다. 또한 1.5% 아가로스/트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 겔에서 가교 반전 후 정제된 DNA의 전기영동에 의해 게놈 DNA의 평균 전단 크기가 약 200-1,000bp일 때 모니터링합니다.
- 이전 단계의 샘플 부피를 측정합니다. 90-120 μL를 폴리스티렌 초음파 처리 튜브에 혼합하고 분취하십시오.
- 2x 세제(150mM NaCl, 50mM HEPES-KOH[pH 7.5], 1mM EDTA, 0.2% 소듐 데옥시콜레이트, 0.7% 사르코실)를 포함하는 동일한 부피의 재현탁 완충액을 추가합니다.
- 4 ° C에서 7 분 (20 초 켜기 / 40 초 끄기) 동안 50 % 전력으로 수조 초음파 발생기에서 초음파 처리합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 추가로 7분 동안 초음파 처리를 반복합니다.
- 초음파 처리 된 용해물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세제 없이 0.5 부피의 재현탁 완충액(150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA)을 추가합니다(예: 200μL의 샘플에 100μL의 완충액 추가).
- 13,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 용해물 상층액을 유지하고 새 튜브로 옮깁니다.
- 선택적으로 단백질 분석을 수행하여 각 용해물의 농도를 측정합니다. 이 단계는 많은 양의 시료 또는 분석 간 비교에 유용할 수 있습니다. 그러나 위에서 설명한 대로 동물 수를 표준화하는 것은 qPCR에 의해 결정된 크로마틴/DNA의 수율과 더 나은 상관관계가 있기 때문에 여기에 설명된 샘플 양에 대해 잘 작동합니다.
7. 면역침전
참고: 항체와 마그네틱 비드의 양을 용해물의 부피와 농도에 맞게 조정합니다.
- 용해물 상층액을 각 IP에 대해 3개의 동일한 부피와 1개의 IP 부피를 입력으로 10% 등 4개 부분으로 나눕니다(예: IP #1 100μL, IP #2 100μL, IP #3 100μL, 입력 10μL). IP 용해물을 200μL PCR 튜브로 옮기고 -20°C에서 1.5mL 튜브에 입력 용해물을 보관합니다.
- 0.5μg의 항-H3K9me3 항체, 항-히스톤 H3 항체 또는 IgG를 적절한 IP 샘플에 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 회전하면서 배양합니다.
- 다음 날, IP당 9μL의 단백질 G 코팅 마그네틱 비드를 단일 1.5mL 튜브에 분취합니다. 1mL의 FA-150(150mM NaCl, 50mM HEPES-KOH[pH 7.5], 1mM EDTA, 1% TX-100, 0.1% 소듐 데옥시콜레이트)으로 비드를 두 번 세척합니다.
- FA-150 버퍼의 마그네틱 비드를 위의 7.3단계에서 스톡에서 가져온 원래 부피로 재현탁합니다. 각 IP에 7.5μL를 추가합니다. 4 °C에서 회전하면서 2 시간 동안 배양합니다.
8. 세척 및 용출
알림: 마그네틱 비드가 마르지 않도록 하려면 이전 세척을 흡입한 후 각 세척 또는 용출 버퍼를 빠르게 추가하십시오.
- 매번 0.2-1mL의 다음 완충 용액을 사용하여 비드를 세척합니다. 마그네틱 스탠드에 구슬을 모아 세척액을 흡인합니다. 각 세척액을 4°C에서 5분 동안 회전시키면서 배양합니다. 아래 순서를 따르십시오.
- FA-150으로 두 번 씻으십시오.
- FA-1M (FA-150 1M NaCl)으로 한 번 씻으십시오.
- FA-0.5M (FA-150, 0.5M NaCl)으로 한 번 씻으십시오. 새 PCR 튜브로 옮깁니다.
- TE-LiCl(250mM LiCl, 10mM Tris-Cl[pH 8.0], 1mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% 소듐 데옥시콜레이트)으로 한 번 세척합니다.
- TE+(50mM NaCl, 10mM Tris-Cl[pH 8.0], 1mM EDTA, 0.005% IGEPAL CA-630)로 두 번 세척합니다.
알림: s를 계속하십시오amp달리 명시되지 않는 한 실온에서 처리합니다.
- 마지막 세척 버퍼를 흡입합니다. 50 μL의 ChIP 용출 완충액(200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl[pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% 소듐 도데실 설페이트[SDS])으로 마그네틱 비드를 재현탁시키고 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
- 열혼합기에서 65°C에서 15분 동안 용리하고 1,000rpm에서 분당 5초 동안 혼합합니다.
- 마그네틱 스탠드에 비드를 모으고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
- 또 다른 50μL의 ChIP 용출 버퍼로 용출을 반복합니다. 총 100μL의 상층액을 합합니다. 아래에 자세히 설명된 대로 역 가교 결합 및 DNA 용출을 진행합니다.
9. 역 가교 및 DNA 용출
- 입력 용해물 샘플을 해동합니다. ChIP 용리 완충액으로 최대 100μL까지 충전할 수 있습니다.
- 16.5 μg의 RNase A를 각 IP 및 입력 샘플에 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 40μg의 Proteinase K를 첨가하고 55°C에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 65°C에서 밤새 배양합니다.
- 샘플을 실온으로 냉각하고 스핀 컬럼 키트로 DNA를 정제합니다.
10. qPCR 반응 설정 및 실행
참고: 프라이머, 반응 설정 및 thermocycler 파라미터는 사용 중인 qPCR 반응 혼합물에 대한 제조업체의 권장 사항과 일치하도록 수정해야 합니다.
- GFP RNAi 리포터와 H3K9me3 양성 및 음성 농축 제어 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트를 준비합니다. 프라이머 용융 온도는 60°C입니다. 프라이머 염기서열에 대해서는 Table of Materials 를 참조하십시오.
- 입력 DNA의 경우 4개의 4중 연속 희석(예: 1:5, 1:20, 1:80, 1:320)을 만듭니다.
참고: IP DNA는 더 많은 반응을 허용하기 위해 직접 사용하거나 희석(예: 1:2 또는 1:3)할 수 있습니다. qPCR 성능이 영향을 받을 수 있으므로 희석의 적합성을 경험적으로 결정해야 합니다. - 하나의 프라이머 세트에 해당하는 모든 반응을 하나의 PCR 플레이트에 구성합니다. 각 입력 DNA 희석 및 각 IP DNA 샘플에 대한 기술적 중복 반응을 설정합니다. 각 10μL 반응에는 1.5μL의 입력 또는 IP DNA(또는 대조군으로서의 용출 완충액), qPCR 마스터 믹스(1x 최종 농도), 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(각 프라이머에 대해 400nM 최종 농도)가 포함됩니다.
- 실시간 thermocycler에서 다음 프로그램을 실행하십시오 : 초기 변성 : 4 분 동안 95 ° C; 증폭 및 형광 검출: 플레이트 판독으로 10초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 40 사이클; 최종 연장: 5분 동안 60°C; 용융 곡선: 60 °C에서 90 °C까지 0.5 °C 단위로 증가, 단계당 5초.
11. 증폭 효율 결정 및 제품 특이성 검증
- 각 입력 DNA 희석 세트에 대해 x축에 [log10(1/dilution)]을 사용하고 y축에 [Input Cq]를 사용하여 4개의 데이터 포인트를 플로팅합니다. 최적선의 기울기를 결정합니다.
- 증폭 효율을 계산합니다. 이상적인 프라이머 세트는 일관되게 95%-100%의 효율을 보여야 합니다.
- 모든 반응이 하나의 예리한 용융 곡선 피크를 가지며 동일한 프라이머 세트를 사용하는 반응이 동일한 용융 온도를 갖는지 확인하십시오. 여러 피크 또는 다른 용융 온도는 비특이적 증폭을 나타낼 수 있습니다.
- 선택적으로 실온에서 표준 2% 아가로스/TAE 겔에 대한 반응을 실행하여 제품 밴드 크기를 확인합니다.
12. 입력 비율 계산
- 입력 희석 계수를 계산합니다. IP 용해물 부피의 10%가 Input으로 저장되었기 때문에 Input DNA의 1:5 희석에 대한 희석 계수는 50입니다.
- IP 희석 계수를 결정합니다. IP DNA가 qPCR 전에 희석되지 않은 경우 희석 계수는 1입니다.
- 희석 계수에 대해 조정된 IP와 입력 간의 Cq 차이를 계산합니다.
- 입력의 백분율을 계산합니다.
Representative Results
생식세포-발현된 GFP-히스톤 H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 리포터(그림 2A)를 운반하는 동물은 GFP RNAi 또는 대조군 RNAi에 먹이를 줌으로써 노출시키고, 프로토콜 및 그림 1에 기술된 바와 같이 통과시켰다. 생식세포에 있는 핵 GFP 신호는 각 세대에 모집단의 표본을 위한 형광 해부 현미경을 사용하여 수동으로 점수가 매겨졌습니다. 전이유전자의 침묵은 GFP RNAi로 처리된 스코어링된 P0 및 F1 동물에서 완전히 침투하였다(도 2B). F2 세대에서 GFP 침묵의 유전을 나타내는 인구의 비율은 약 50%였습니다. F5 세대에 이르러서는 인구의 대다수가 침묵의 유전을 나타내지 않았으며, F10 세대에 이르러서는 모든 동물이 GFP를 발현했기 때문에 유전이 발견되지 않았습니다.
RNAi 유도 침묵에 해당하는 히스톤 H3K9me3 농축의 변화를 결정하기 위해 GFP RNAi 또는 대조군 RNAi 처리 후 F1 생성 동물에서 ChIP-qPCR을 수행했습니다. 예상대로, GFP RNAi 대우한 인구는 통제 RNAi 대우한 동물과 비교된 GFP 표적 그리고 1.3 kb 하류 지구에 더 높은 히스톤 H3K9me3 수준을 표시했습니다 (그림 2C). 히스톤 H3K9me3 ChIP의 특이성은 이 표지가 풍부해지는 것으로 알려진 양성 대조군 자리(clec-18)의 농축에 의해 뒷받침되지만 근처의 음성 대조군 자리(hrp-2)에서는 지지되지 않습니다. IgG 대조군 면역침전에서 히스톤 H3 농축 및 근백부 농축도 예상대로 모든 qPCR 유전자좌에서 검출되었습니다. 리포터의 ChIP 농축이 clec-18 양성 대조군 유전자좌로 정규화되면 GFP RNAi에서 더 높은 히스톤 H3K9me3 농축이 나타나는 반면 히스톤 H3 농축은 대조군과 GFP RNAi 처리 간에 유사합니다(그림 2D). GFP RNAi가 히스톤 H3K9me3 또는 clec-18 유전자좌에서 총 히스톤 H3 점유에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되기 때문에, 이 정규화는 GFP RNAi와 대조군 RNAi 샘플 사이의 ChIP 효율 차이와 같은 기술적 변동에 대해 완화합니다. RNAi 처리 사이의 히스톤 H3K9me3 및 히스톤 H3 수준의 접힘 변화는 GFP RNAi 유도 침묵시 히스톤 점유와 무관하게 GFP 리포터 특정 히스톤 H3K9me3 농축을 보여줍니다 (그림 2E).
그림 2: GFP RNAi 유도 침묵은 RNAi 표적에서 H3K9me3 농축 증가에 해당합니다. (A) qPCR 앰플리콘 영역이 표지된 생식세포 발현 GFP RNAi 리포터 mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]의 다이어그램. (B) 21°C에서 RNAi 처리 후 세대에 걸쳐 점수가 매겨진 GFP 발현. 오차 막대는 두 생물학적 반복의 표준 편차를 나타냅니다. (C) 두 가지 생물학적 복제에서 F1 젊은 성인의 H3K9me3, 히스톤 H3 및 IgG 대조군의 ChIP-qPCR. clec-18 및 hrp-2는 각각 H3K9me3 농축을 위한 양성 및 음성 대조군 유전자좌입니다. (D) GFP RNAi 리포터에서 H3K9me3 및 히스톤 H3 농축은 clec-18 양성 대조군 자리로 정규화되었습니다. (E) GFP RNAi-와 대조군 RNAi-처리 동물 사이의 H3K9me3 및 히스톤 H3 농축의 변화, clec-18로의 정규화. 점선은 1의 접기 변경을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜에서 dsRNA는 섭식에 의해 도입되며, 이는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 18에서 표준 방법이 되었습니다. RNAi 유전 분석의 경우 공급 접근법은 큰 P0 집단 2,11,12,22,23,24,25를 얻는 쉬운 방법을 제공합니다. 그러나, RNAi 노출의 시기와 지속 시간은 전이유전자 침묵의 효능에 영향을 미치고(26), RNAi 박테리아의 농도는 유전성 RNAi 침묵의 지속성에 영향을 미친다1. 그러므로, 표준화된 RNAi 박테리아 및 벌레 성장은 GFP 침묵 그리고 유전의 내구의 일관된 수준을 얻게 중요합니다. 여기서 배아는 RNAi 플레이트에 도금되어 P0 동물이 부화할 때 RNAi 박테리아에 노출됩니다. 다른 접근법은 동기화된 L1 24,27 또는L4 25 단계 동물을 RNAi-NGM 플레이트에 도금하는 것입니다. 또한, 굶주림과 다른 스트레스는 RNAi 유전의 유지에 영향을 미치기 때문에(13), 식량 공급의 과밀 및 고갈을 방지하기 위해 플레이트를 모니터링해야 한다. 먹이를 주어 RNAi를 시작하는 대안으로, 선구적인 예쁜꼬마선충(C. elegans) RNAi 유전 연구 중 일부는 생식선 주입을 통해 RNAi를 유도했으며, 이는 dsRNA 농도 1,28을 더 잘 제어할 수 있습니다.
이 프로토콜에서, 각 세대는 이전에 기술된바와 같이 알칼리성 차아염소산염 처리를 가진 집단으로 통과된다 16,22,23,24. 차아염소산염 처리는 F1 세대가 부모 환경(22)으로부터 RNAi 박테리아에 오염되지 않도록 보장하고, 잠재적인 원치 않는 개체군 병목 현상을 방지한다. 그러나, 개별 동물이 뚜렷한 유전 패턴을 가질 수 있기 때문에 대량 통과 또한 한계가 될 수 있다 1,29. 각 세대를 설정하는 또 다른 방법은 개별 동물을 선택하는 것이다 1,2,9,11,25. 이 접근 방식을 사용하면 계통 내에서 표현형을 추적하고 유전적 교배를 통합할 수 있습니다. 계통 분석은 침투율이 낮은 표현형(low penetrance phenotype)에도 유리할 수있다 12.
형광 단백질 발현은 RNAi 유도 침묵 2,3,4,12,14,15,16,25,30의 강력하고 편리한 판독입니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 GFP 표현은 ON 또는 OFF 11,12,15,16,25로 수동으로 점수를 매길 수 있습니다. 수동 채점은 정성적 강도 수준 3,4,14를 할당하여 더욱 구체화할 수 있습니다. 대안으로, 현미경 이미지(11,12,14,25,27)의 자동 강도 스코어링 또는살아있는 동물2의 유세포 분석 형광 측정은 정량적이고 처리량이 높은 판독값을 제공할 수 있다. 그러나, 보고자 발현이 생식세포에 제한되기 때문에, 자동화된 접근의 주의사항은 또한 연구가 비정상적인 생식세포 발달을 가진 돌연변이체를 통합하는 경우에 생식세포가 없는 동물에 대 침묵한 GFP 발현을 가진 동물 사이에서 분화해야 한다 이다. GFP 형광의 대안으로 역전사(RT)-qPCR을 사용하여 RNAi 표적 pre-mRNA 및 mRNA 수준 2,16,23,24를 정량화할 수 있습니다. 이 접근법은 RNA를 표적으로 하는 침묵에 대한 보다 직접적인 판독을 제공하며, 침묵이 가시적인 표현형을 생성하지 않는 다른 RNAi 표적에 특히 유용합니다. 인공 GFP 리포터 사용의 한계는 외인성 및 내인성 서열이 세대 간 RNAi11에서 차별적으로 조절된다는 것입니다. 따라서 온도에 민감한 배아 치사 대립유전자 oma-1(zu405)1,11,16,25와 같은 내인성 표적에 대한 연구는 형광 전이유전자 리포터에 대한 보완적 접근법으로 고려되어야 합니다.
RNAi 유전 분석의 맥락에서 ChIP를 분석하려면 처리와 복제를 비교해야 합니다. 첫째, 샘플 간 출발 물질의 차이를 설명하기 위해 ChIP 신호는 '입력 백분율'과 동일한 궤적에서 입력 신호로 정규화됩니다. 히스톤 H3 ChIP를 병렬로 처리하면 히스톤 변형 변경이 뉴클레오솜 밀도의 변화와 일치하는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다. 또한 ChIP는 다단계 프로세스이기 때문에 효율성은 샘플마다 다를 수 있습니다. 적절한 양성 및 음성 대조군 유전자좌의 선택은 샘플과 실험 간의 신호 대 잡음비를 평가하고 비교하는 데 유용합니다. 또한 샘플 간의 비교를 용이하게 하기 위해 RNAi 표적의 ChIP DNA qPCR 임계값 주기 값은 종종 대조군 위치 3,11,15,23,30,31로 정규화됩니다. RNAi 처리의 효과를 평가하기 위해 치료 RNAi와 대조군 또는 RNAi 없음 조건에서 ChIP 신호의 비율도 비교됩니다. 현재 접근법의 한계는 ChIP가 전체 동물에서 수행되는 반면 RNAi 처리에 대한 반응은 생식세포에 고유할 수 있다는 것입니다. 이 경고를 극복하기 위한 접근 방식은 분리된 생식세포 핵을 사용하여 ChIP를 수행하는 것입니다. ChIP를 최적화하기 위한 추가적인 기술적 고려사항들 또한 다른 곳에서 광범위하게 논의되었다32,33.
전반적으로, 이 RNAi 유전 및 ChIP 프로토콜은 세대 간 후성유전학적 조절을 더 깊이 탐구하기 위해 다른 기술과 통합할 수 있는 상세하고 적응하기 쉬운 기반을 제공합니다. 예를 들어, ChIP DNA(ChIP-seq)에서 고처리량 염기서열분석 라이브러리를 구성하여 RNAi 표적에 근접한 염색질 환경과 게놈 전체 규모 모두에서 염색질 환경을 보다 자세히 볼 수 있습니다.
Disclosures
모든 저자는 공개할 충돌이 없음을 확인합니다.
Acknowledgments
우리는 도구를 개발하고 공유했으며 이 원고에 인용된 C. elegans 커뮤니티의 연구실에 감사드립니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다. 이 연구는 A.L.S.(PJT-175245)에 대한 캐나다 보건 연구소(CIHR) 프로젝트 보조금의 지원을 받았습니다. CL은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 대학원 장학금(PGS-D)의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bioshop | AGA002 | |
| Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL). |
| Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL). |
| Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
| C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
| Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
| E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
| E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
| Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
| HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
| Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
| IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
| IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
| LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
| Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
| LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
| M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
| Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
| Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
| NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
| NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
| NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
| Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| Plasmid - Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
| Plasmid - GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
| Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
| Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
| Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
| Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
| Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
| Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
| Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
| RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
| RNase A | Sigma | R4642 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
| Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
| Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
| Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
| Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
| TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
| Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
| Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
References
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