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Genetics

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65285
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un ensayo de interferencia de ARN y ChIP para estudiar la herencia epigenética del silenciamiento inducido por ARNi y las modificaciones asociadas a la cromatina en C. elegans.

Abstract

La herencia epigenética transgeneracional (TEI) permite la transmisión de información a través de la línea germinal sin cambiar la secuencia del genoma, a través de factores como los ARN no codificantes y las modificaciones de la cromatina. El fenómeno de la herencia de ARN de interferencia (ARNi) en el nematodo Caenorhabditis elegans es un modelo eficaz para investigar TEI que aprovecha el corto ciclo de vida, la autopropagación y la transparencia de este organismo modelo. En la herencia de ARNi, la exposición de los animales al ARNi conduce al silenciamiento génico y a la alteración de las firmas de cromatina en el locus diana que persisten durante varias generaciones en ausencia del desencadenante inicial. Este protocolo describe el análisis de la herencia de ARNi en C. elegans utilizando un indicador de proteína fluorescente verde nuclear (GFP) expresado en la línea germinal. El silenciamiento del reportero se inicia alimentando a los animales con bacterias que expresan ARN bicatenario dirigido a GFP. En cada generación, los animales son conducidos para mantener un desarrollo sincronizado, y el silenciamiento del gen reportero se determina mediante microscopía. En generaciones seleccionadas, las poblaciones se recolectan y procesan para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para medir el enriquecimiento de la modificación de histonas en el locus reportero de GFP. Este protocolo para estudiar la herencia de ARNi puede modificarse fácilmente y combinarse con otros análisis para investigar más a fondo los factores TEI en las vías de ARN pequeño y cromatina.

Introduction

La herencia epigenética permite la transmisión de información reguladora de genes a través de generaciones y, por lo tanto, puede permitir que el entorno o las experiencias de los padres afecten a su progenie. En C. elegans, el silenciamiento génico de la línea germinal iniciado por ARN bicatenario exógeno (dsRNA) puede heredarse durante varias generaciones en la progenie no expuesta al desencadenante original 1,2,3,4. Este proceso, denominado herencia de ARN de interferencia (ARNi), es uno de varios fenómenos de silenciamiento epigenético relacionados en C. elegans, incluido el silenciamiento multigeneracional iniciado por piRNA2,5, la paramutación/ARNe (silenciamiento epigenético inducido por ARN)6,7,8 y el silenciamiento iniciado por matrices multicopia9, que tienen requisitos superpuestos pero distintos para la maquinaria de regulación de ARN pequeño y cromatina . En el ARNi exógeno de C. elegans, el dsRNA se procesa en pequeños ARN interferentes (siRNA) que actúan en un complejo con las proteínas primarias de Argonaute para reconocer su ARNm diana. Esta orientación conduce a la amplificación de siRNAs secundarios que se asocian con Argonautas secundarios para silenciar el ARNm diana a través de vías de silenciamiento citoplasmático y nuclear. En el caso de las dianas de ARNi expresadas en la línea germinal, el ARGONAUTE secundario nuclear HRDE-1 y los factores de ARNi nuclear adicionales se dirigen a los transcritos nacientes, lo que da lugar a la represión transcripcional y al reclutamiento de metiltransferasas de histonas para depositar marcas de cromatina represivas, incluida H3K9me310. La histona H3K9me3 promueve el establecimiento del silenciamiento hereditario de los transgenes de proteína verde fluorescente (GFP) expresados en la línea germinal por la herencia de ARNi11,12.

El objetivo de este protocolo es utilizar un transgén que exprese una proteína de fusión GFP-histona en la línea germinal como indicador de la herencia de ARNi y ensayar los cambios en las modificaciones de las histonas en el locus del transgén reportero mediante inmunoprecipitación de cromatina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (ChIP-qPCR). Este protocolo describe un enfoque estandarizado de alimentación de ARNi basado en placas para iniciar el silenciamiento del reportero. También proporciona una cronología detallada para el paso de animales entre generaciones mediante el aislamiento en el útero de embriones de adultos grávidos mediante un tratamiento con hipoclorito alcalino («blanqueo»). También se describen métodos y datos representativos para monitorizar la frecuencia de silenciamiento de GFP en un subconjunto de la población mediante microscopía de fluorescencia y para la histona H3K9me3 ChIP-qPCR. Los ensayos de herencia de ARNi basados en reporteros proporcionan un sistema altamente manejable para diseccionar funcionalmente los roles de los factores genéticos y ambientales en la regulación epigenética 13,14, y los exámenes genéticos que utilizan dichos reporteros han identificado tanto los genes que son necesarios para 2,3,15 como los genes que regulan negativamente 16,17 la duración de la herencia epigenética transgeneracional.

Protocol

NOTA: En la Figura 1 se proporciona un cronograma de ensayo.

1. Preparación de placas de medio de crecimiento de nematodos ARNi (RNAi-NGM)

  1. Eliminar E. coli HT115(DE3) que contiene GFP o vectores de ARNi de control de las existencias de glicerol en placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina. Incubar las bacterias durante la noche a 37 °C.
  2. Al día siguiente, prepare placas de ARNi-NGM (agar al 1,7% [p/v], NaCl al 0,3% [p/v], peptona al 0,25% [p/v], 1 mM de CaCl2, 5 μg/ml de colesterol, tampón fosfato de potasio 25 mM [pH 6,0], 1 mM de MgSO4, 25 μg/ml de carbenicilina y 5 mM de isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido [IPTG]) de acuerdo con el protocolo estándar18.
    1. Para cada cepa del ensayo, prepare un mínimo de seis placas de ARNi-NGM sembradas con ARNi GFP (dos placas para cada una de las tres réplicas biológicas) y dos placas de ARNi-NGM sembradas con ARNi de control (una réplica biológica).
    2. Cubra los platos sin apretar con papel de aluminio para protegerlos de la luz y déjelos secar durante la noche a temperatura ambiente.
  3. El mismo día del vertido de la placa de ARNi-NGM, prepare 4 ml de cultivos líquidos de bacterias ARNi.
    1. En condiciones estériles, alícuota 4 mL de caldo LB suplementado con 10 μg/mL de tetraciclina y 100 μg/mL de ampicilina en tubos de cultivo. Recoger colonias individuales de las placas de agar LB en cada tubo e incubar durante la noche agitando durante aproximadamente 16 h a 37 °C.
  4. Siembra de bacterias de ARNi en las placas de ARNi-NGM.
    1. Después del crecimiento durante la noche, mida la densidad óptica (OD600) de los cultivos utilizando una dilución 1:5 de bacterias con caldo LB.
    2. Diluir las bacterias de ARNi a un OD relativo de 600 de 2 utilizando caldo LB suplementado con 10 μg/mL de tetraciclina y100 μg/mL de ampicilina.
    3. En condiciones estériles, añadir 150 μL de la bacteria de control o de ARNi GFP en cada placa de ARNi-NGM.
    4. Cubra las placas con papel de aluminio y deje que las bacterias crezcan durante al menos 24 horas a temperatura ambiente antes de usarlas.
      NOTA: Las placas de RNAi-NGM no utilizadas pueden almacenarse invertidas hasta 1 semana a 4 °C en un recipiente sellado a oscuras.

2. Inicio del ensayo de herencia de ARNi: blanqueo y siembra de embriones para la generación P0

NOTA: Antes de comenzar el ensayo de herencia de ARNi, los gusanos que contienen el reportero de GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 deben mantenerse sin inanición a 21 °C durante al menos dos generaciones.

  1. A los 4 días (96 h) antes del inicio del ensayo de herencia de ARNi (Figura 1), se recogen tres o cuatro adultos grávidos en cada placa NGM estándar de 35 mm sembrada con la bacteria OP50-1.
    NOTA: Tres placas NGM por cepa son suficientes. En el caso de cepas con fertilidad comprometida, es posible que se requieran más de cuatro animales por placa.
  2. Después de 4 días, asegúrese de que la población adulta haya comenzado a poner embriones en la placa. Lave los gusanos de las placas en tubos de 1,5 ml utilizando 800 μl de tampón M9 suplementado con Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl,1 mM MgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Repita el lavado y la piscina en el mismo tubo.
  3. Aislar los embriones de la población mediante blanqueamiento de la siguiente manera.
    1. Prepare una solución blanqueadora con lejía (hipoclorito de sodio al 6%) y 10 N NaOH en una proporción de volumen de 1,5:1. Preparar una cantidad suficiente para que se puedan utilizar 250 μL por cada muestra.
    2. Centrifugar los tubos de 1,5 ml con los gusanos a 1.000 x g durante 1,5-2 min.
    3. Aspirar el sobrenadante, dejando 100 μL sin alterar el "pellet" del gusano. Alternativamente, los tubos se pueden dejar durante aproximadamente 2 minutos para permitir que los gusanos se asienten antes de aspirar.
    4. Añadir 650 μL de ddH2O a cada tubo para conseguir un volumen final de 750 μL.
      NOTA: Los siguientes pasos son urgentes.
    5. Agregue 250 μL de la solución blanqueadora a cada tubo y ponga en marcha un temporizador.
    6. Cada 1-2 minutos, haga un vórtice de los tubos a fondo. Después de 5 minutos, revise los gusanos bajo el estereoscopio para monitorear la degradación de los adultos.
    7. Continúe el vórtice hasta que los gusanos se disuelvan por completo y solo queden embriones. Centrifugar inmediatamente los tubos a 1.000 x g durante 1,5 min.
      NOTA: El blanqueamiento generalmente se completa en 6-7 minutos, pero debe controlarse con un estereoscopio a un aumento suficiente para observar los embriones liberados (40x). No dejes los gusanos en lejía durante un período prolongado, ya que esto comprometerá los embriones.
    8. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y dejar aproximadamente 50-100 μL. Añadir 1 mL de tampón M9 con TX-100 para lavar y mezclar por vórtice. Centrifugar de nuevo a 1.000 x g durante 1,5-2 minutos y lavar al menos dos veces más.
    9. Aspirar el sobrenadante del lavado final y dejar aproximadamente 100 μL en el tubo. Mezclar por vórtice. Pipetear 2 μL de cada tubo dos veces en un portaobjetos de vidrio etiquetado. Cuente los embriones usando un contador de conteo para estimar la concentración de embriones por microlitro.
      NOTA: Los portaobjetos con múltiples pocillos esmerilados se pueden usar aquí para contar réplicas de múltiples cepas. Los portaobjetos de conteo se pueden lavar y reutilizar.
  4. Para iniciar un crecimiento poblacional semisincronizado, mezcle y pipetee un volumen que contenga 250 embriones en cada placa de ARNi-NGM. Utilice dos placas para cada réplica. Deja que el líquido se absorba.
  5. Para la generación P0 tratada con ARNi, incubar a 21 °C durante 4 días (96 h) (desde los embriones hasta la edad adulta). Los tiempos pueden variar según el genotipo.

Figure 1
Figura 1: Esquema del ensayo de herencia de ARNi. Cronograma propuesto para la preparación de placas de ARNi-NGM y la configuración del ensayo de herencia de ARNi. Los adultos grávidos se recogen en el día -4 en placas NGM sembradas con OP50-1. Después de 4 días, la progenie adulta se blanquea y los embriones se siembran en placas de ARNi-NGM. La generación de P0 se expone al ARNi durante 4 días a 21 °C. Una vez que los gusanos alcanzan la edad adulta, las réplicas son pasadas por blanqueamiento y puntuadas para la expresión de GFP de la línea germinal en cada generación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Pasar y puntuar cada generación para la expresión de GFP de la línea germinal

NOTA: Para facilitar la puntuación, use un disco de vinilo para crear almohadillas de agarosa con crestas lineales para alinear los gusanos. Este método fue adaptado de Rivera Gómez y Schvarzstein19.

  1. Preparar agarosa al 1% (p/v) disolviendo agarosa en ddH2O en un matraz pequeño calentando en el microondas. Agregue una barra para revolver y cubra con papel de aluminio. Si se vuelve a fundir, caliente la agarosa en una placa calefactora a 200 °C mientras revuelve. Una vez derretido, reduzca el fuego a 80 °C.
  2. Lave los gusanos de las placas NGM con 800 μL de tampón M9 con TX-100 en un tubo de 1,5 mL. Lave los platos dos veces para eliminar todos los adultos grávidos. Revise las placas debajo del estereoscopio para confirmar que los animales se han recolectado de manera eficiente.
  3. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 1,5-2 minutos o dejar que las lombrices se asienten durante 2 minutos. Aspirar el sobrenadante y dejar 100 μL sin alterar el 'pellet' del gusano.
  4. Prepare las almohadillas de agarosa para montar los gusanos de la siguiente manera.
    1. Coloque una gota de agarosa derretida al 1% (p/v) en el disco de vinilo (descrito anteriormente19) con una pipeta Pasteur de vidrio (con el extremo estrecho roto).
    2. Oriente una diapositiva de vidrio de modo que las líneas del disco sean horizontales o verticales y coloque la diapositiva rápidamente sobre la gota de agarosa. Espere aproximadamente 30 segundos antes de retirar la diapositiva de vidrio del disco.
      NOTA: Si marca varios genotipos, puede ser útil hacer una almohadilla de agarosa más grande en un portaobjetos y cortarla por la mitad con una cuchilla.
  5. Monta los gusanos en las almohadillas de agarosa.
    1. Bajo el estereoscopio, agregue aproximadamente 5 μL de 5 mM de levamisol a la almohadilla de agarosa. La dilución de levamisol debe hacerse nueva cada semana.
    2. Agite suavemente los tubos de lombrices para mezclar y transfiera 5-10 μL de lombrices a la almohadilla de agarosa. Calcule el número de gusanos a ojo a medida que se van añadiendo, de modo que haya aproximadamente 40 gusanos por réplica.
    3. Alinee los gusanos en filas con un palillo de pestañas para marcar más fácilmente. Añade un cubreobjetos de vidrio.
      NOTA: Los portaobjetos con animales montados de esta manera pueden durar varias horas antes de secarse.
  6. Aísle los embriones de los animales restantes utilizando el protocolo de blanqueamiento (consulte el paso 2.3) antes de marcar los portaobjetos. Colocar 250 embriones en placas NGM de 35 mm sembradas con OP50-120. Una vez absorbido el líquido, invierta las placas y devuélvalas a la incubadora a 21 °C.
  7. Utilice un estereoscopio de fluorescencia con un conjunto de filtros GFP. Cuente y registre el número de gusanos positivos y negativos de GFP en las diapositivas de cada réplica utilizando un contador de recuento.
    NOTA: Los gusanos GFP positivos tendrán expresión nuclear de GFP en su línea germinal y embriones en el útero. Las líneas germinales de los gusanos GFP negativos no serán fluorescentes, sin embargo, a medida que la GFP comienza a volver a activarse en generaciones posteriores, la fluorescencia puede ser tenue. Puede ser útil montar cepas adicionales de gusanos no transgénicos para tener en cuenta cualquier autofluorescencia observada.
  8. Pasar la población por blanqueamiento, como se ha descrito anteriormente, aproximadamente cada 4 días (96 h) a 21 °C. Alternativamente, el pase se puede hacer en un horario alterno de 3 días / 4 días para mayor comodidad. Coloque ~ 50 embriones adicionales para las generaciones de paso más cortas si se alternan, ya que puede haber un menor rendimiento de embriones después de 72 h.
    NOTA: Mantenga constante el tiempo de paso de la generación P0 a los 4 días después de la siembra de los embriones.

4. Recogida de animales para ChIP

NOTA: El número de animales y el momento dependen de la cepa, la etapa de desarrollo, el epítopo y el número de objetivos de inmunoprecipitación (IP). En el siguiente ejemplo, recoja animales para tres IP: H3K9me3, histona H3 y control de IgG. El protocolo ChIP fue adaptado de Askjaer et al.21.

  1. Antes de la recolección de muestras de ChIP, amplíe la generación anterior del ensayo de herencia de ARNi con tres placas NGM adicionales (a al menos cuatro placas por réplica). Cultivar durante 4 días a 21 °C.
  2. Blanquear los adultos grávidos para aislar los embriones (consulte el paso 2.3).
  3. Para cada cepa, coloque aproximadamente 3.500 embriones en 14 placas (250 por placa) y crezca durante 3 días a 21 °C hasta la etapa de adulto joven.
  4. Lavar a los animales en tubos de 1,5 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,01% (v/v) de TX-100 (PBS/TX). Centrifugar a 1.000 x g durante 2 min. Aspire y agrupe a los animales de una cepa en un tubo y lávelos tres veces más con al menos 1 ml de PBS/TX.
  5. Aspirar a 1.000 μL, invertir para mezclar y contar el número de animales en 3 μL tres veces (consulte el paso 2.3.9).
  6. Calcular la concentración de animales y transferir un volumen correspondiente a 3.000 animales a un nuevo tubo para la reticulación de formaldehído.
  7. Asegúrese de que el volumen total sea al menos 10 veces el volumen de gránulos de gusano.

5. Reticulación de formaldehído

PRECAUCIÓN: Trabaje con formaldehído en una campana extractora para evitar la exposición al vapor.

  1. Agregue formaldehído (1,8% de concentración final) al tubo que contiene los gusanos. Gire a temperatura ambiente durante 6 min.
  2. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. El experimento se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -80 °C.
  3. Descongele la muestra reticulada en un baño de agua a temperatura ambiente durante 3 minutos y gírela durante 16 minutos a temperatura ambiente.
  4. Añadir 1,25 M de glicina a una concentración final de 125 mM y girar durante 5 min.
    NOTA: Hasta la elución magnética de las perlas, mantenga las muestras en hielo o a 4 °C y utilice tampones helados.
  5. Centrifugar la muestra a 1.000 x g durante 3 min. Lávese tres veces con 1 ml de PBS/TX cada vez. Lavar dos veces con 1 mL de tampón de resuspensión (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], 0,01% TX-100, inhibidor de la proteasa [un comprimido por 5 mL]).
  6. Después del último lavado, deje suficiente tampón para garantizar que el volumen total sea al menos tres veces el volumen del gránulo y un mínimo de ~ 100 μL.

6. Sonicación

NOTA: Los parámetros de sonicación dependen del tipo y modelo de sonicador y de la fase animal. Parámetros como el volumen y la concentración de la muestra, los intervalos de encendido/apagado, el número de ciclos y el ajuste de potencia deben optimizarse empíricamente. Por ejemplo, durante un período de tiempo de sonicación, monitorizar la lisis de los gusanos mediante un ensayo de proteínas y determinar cuándo la concentración alcanza una meseta. Además, monitorizar cuando el tamaño medio de cizallamiento del ADN genómico es de aproximadamente 200-1.000 pb mediante electroforesis del ADN, purificado tras la reversión de la reticulación, en un gel de agarosa/tris-acetato-EDTA (TAE) al 1,5%.

  1. Mida el volumen de muestras del paso anterior. Mezclar y alícuota 90-120 μL a un tubo de sonicación de poliestireno.
  2. Añadir un volumen igual de tampón de resuspensión que contenga 2 detergentes (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 0,2% de desoxicolato de sodio, 0,7% de sarkosil).
  3. Sonicado en un sonicador en baño de agua al 50% de potencia durante 7 min (20 s encendido/40 s apagado) a 4 °C. Mezclar suavemente pipeteando. Repita la sonicación durante 7 minutos más.
  4. Transfiera el lisado sonicado a un tubo de 1,5 ml. Añadir 0,5 volúmenes de tampón de resuspensión sin detergentes (150 mM de NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA) (p. ej., añadir 100 μL de tampón a 200 μL de muestra).
  5. Centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C. Mantenga el lisado sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo.
  6. Opcionalmente, realice un ensayo de proteínas para determinar las concentraciones de cada lisado. Este paso puede ser útil para grandes cantidades de muestras o comparaciones entre ensayos. Sin embargo, la estandarización del número de animales como se ha descrito anteriormente funciona bien para las cantidades de muestra descritas aquí, ya que existe una mejor correlación con el rendimiento de cromatina/ADN determinado por qPCR.

7. Inmunoprecipitación

NOTA: Ajuste la cantidad de anticuerpos y perlas magnéticas al volumen y la concentración de lisado.

  1. Divida el sobrenadante de lisado en cuatro porciones: tres volúmenes iguales para cada IP y el 10% del volumen de una IP como entrada (por ejemplo, 100 μL de IP #1, 100 μL de IP #2, 100 μL de IP #3, 10 μL de entrada). Transfiera el lisado IP a un tubo de PCR de 200 μL y almacene el lisado de entrada a -20 °C en un tubo de 1,5 ml.
  2. Añadir 0,5 μg de anticuerpo anti-H3K9me3, anticuerpo antihistona H3 o IgG a la muestra IP adecuada. Incubar a 4 °C durante la noche con rotación.
  3. Al día siguiente, alícuota 9 μL de perlas magnéticas recubiertas de proteína G por IP a un solo tubo de 1,5 mL. Lave las perlas dos veces con 1 mL de FA-150 (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 1% de TX-100, 0,1% de desoxicolato de sodio).
  4. Vuelva a suspender las perlas magnéticas en el tampón FA-150 al volumen original tomado del stock en el paso 7.3 anterior. Agregue 7,5 μL a cada IP. Incubar a 4 °C durante 2 h con rotación.

8. Lavados y elución

NOTA: Para asegurarse de que las perlas magnéticas no se sequen, agregue cada tampón de lavado o elución rápidamente después de aspirar el lavado anterior.

  1. Use 0.2-1 mL de las siguientes soluciones tampón cada vez para lavar las perlas. Recoja las perlas en un soporte magnético para aspirar los lavados. Incubar cada lavado a 4 °C durante 5 min con rotación. Siga el orden que se indica a continuación.
    1. Lavar dos veces con FA-150.
    2. Lavar una vez con FA-1M (FA-150 con NaCl 1 M).
    3. Lavar una vez con FA-0,5M (FA-150 con NaCl 0,5 M). Transfiéralo a un nuevo tubo de PCR.
    4. Lavar una vez con TE-LiCl (250 mM de LiCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 1% de IGEPAL CA-630, 1% de desoxicolato de sodio).
    5. Lavar dos veces con TE+ (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 0,005% de IGEPAL CA-630).
      NOTA: Continúe el procesamiento de la muestra a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
  2. Aspire el último tampón de lavado. Vuelva a suspender las perlas magnéticas con 50 μL de tampón de elución ChIP (200 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 1% de dodecil sulfato de sodio [SDS]) y transfiéralas a un tubo de 1,5 mL.
  3. Eluir a 65 °C durante 15 min en una termomezcladora mezclando a 1.000 rpm durante 5 s cada minuto.
  4. Recoja las cuentas en un soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo.
  5. Repita la elución con otros 50 μL de tampón de elución ChIP. Agrupe los sobrenadantes para un total de 100 μL. Proceda a la reticulación inversa y a la elución del ADN, como se detalla a continuación.

9. Reticulación inversa y elución del ADN

  1. Descongele la muestra de lisado de entrada. Rellene hasta 100 μL con tampón de elución ChIP.
  2. Agregue 16,5 μg de RNasa A a cada IP y muestra de entrada. Incubar a 37 °C durante 1 h.
  3. Añadir 40 μg de Proteinasa K e incubar a 55 °C durante 2 h. A continuación, incubar a 65 °C durante la noche.
  4. Enfríe las muestras a temperatura ambiente y purifique el ADN con un kit de columna de centrifugación.

10. Configuración y ejecución de la reacción de qPCR

NOTA: El cebador, la configuración de la reacción y los parámetros del termociclador deben modificarse para que coincidan con las recomendaciones del fabricante para la mezcla de reacción de qPCR en uso.

  1. Prepare conjuntos de cebadores dirigidos al reportero de ARNi de GFP y a las regiones de control de enriquecimiento positivo y negativo de H3K9me3. La temperatura de fusión de la imprimación es de 60 °C. Consulte la Tabla de materiales para ver las secuencias de cebadores.
  2. Para el ADN de entrada, realice cuatro diluciones en serie cuádruples (por ejemplo, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
    NOTA: El ADN IP puede usarse directamente o diluido (por ejemplo, 1:2 o 1:3) para permitir más reacciones. La idoneidad de la dilución debe determinarse empíricamente, ya que el rendimiento de la qPCR puede verse afectado.
  3. Organice todas las reacciones correspondientes a un conjunto de cebadores en una placa de PCR. Configure reacciones técnicas duplicadas para cada dilución de ADN de entrada y cada muestra de ADN IP. Cada reacción de 10 μL contiene 1,5 μL de ADN de entrada o IP (o tampón de elución como control), mezcla maestra de qPCR (1x concentración final), cebador directo y cebador inverso (concentración final de 400 nM para cada cebador).
  4. En un termociclador en tiempo real, ejecute el siguiente programa: desnaturalización inicial: 95 °C durante 4 min; detección de amplificación y fluorescencia: 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s con lectura de placa; extensión final: 60 °C durante 5 min; Curva de fusión: de 60 °C a 90 °C en incrementos de 0,5 °C, 5 s por paso.

11. Determinación de la eficiencia de amplificación y verificación de la especificidad del producto

  1. Para cada conjunto de diluciones de ADN de entrada, represente los cuatro puntos de datos con [log10(1/dilución)] en el eje x y [Input Cq] en el eje y. Determine la pendiente de la línea de mejor ajuste.
  2. Calcule la eficiencia de amplificación. Los juegos de imprimación ideales deben mostrar constantemente una eficiencia del 95% al 100%.
    Equation 1
  3. Compruebe que todas las reacciones tengan un pico de curva de fusión pronunciada y que las reacciones con el mismo juego de cebadores tengan la misma temperatura de fusión. Múltiples picos o diferentes temperaturas de fusión pueden indicar una amplificación no específica.
  4. Opcionalmente, ejecute las reacciones en un gel estándar de agarosa/TAE al 2% a temperatura ambiente para verificar el tamaño de la banda del producto.

12. Cálculo del porcentaje de entrada

  1. Calcule el factor de dilución de entrada. Dado que el 10% del volumen de lisado de IP se guardó como entrada, el factor de dilución para la dilución 1:5 del ADN de entrada es 50.
  2. Determine el factor de dilución IP. Si el ADN IP no se diluye antes de la qPCR, entonces el factor de dilución es 1.
  3. Calcule la diferencia de Cq entre el IP y la entrada ajustada por factores de dilución.
    Equation 2
  4. Calcule el porcentaje de entrada.
    Equation 3

Representative Results

Los animales portadores del reportero de la histona GFP H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 expresada en la línea germinal (Figura 2A) fueron expuestos al ARNi de GFP o al ARNi de control mediante la alimentación, y se les hizo pasar como se describe en el protocolo y en la Figura 1. La señal de GFP nuclear en la línea germinal se puntuó manualmente utilizando un microscopio de disección de fluorescencia para una muestra de la población en cada generación. El silenciamiento del transgén fue totalmente penetrante en los animales puntuados P0 y F1 tratados con GFP RNAi (Figura 2B). En la generación F2, la proporción de la población que exhibía herencia de silenciamiento de GFP fue de aproximadamente el 50%. Para la generación F5, la mayoría de la población no mostró herencia de silenciamiento, y para la generación F10, no se detectó herencia, ya que todos los animales expresaron GFP.

Para determinar el cambio en el enriquecimiento de la histona H3K9me3 correspondiente al silenciamiento inducido por ARNi, se realizó ChIP-qPCR en animales de generación F1 después de un tratamiento con ARNi GFP o ARNi control. Como era de esperar, la población tratada con ARNi de GFP mostró niveles más altos de histonas H3K9me3 en el objetivo de GFP y en la región descendente de 1,3 kb en comparación con los animales tratados con ARNi de control (Figura 2C). La especificidad de la histona H3K9me3 ChIP está respaldada por el enriquecimiento en un locus de control positivo (clec-18) que se sabe que está enriquecido en esta marca, pero no en un locus de control negativo cercano (hrp-2). También se detectó enriquecimiento de histonas H3 y enriquecimiento cercano al fondo en las inmunoprecipitaciones de control de IgG en todos los loci de qPCR, como se esperaba. Cuando el enriquecimiento de ChIP en el reportero se normaliza al locus de control positivo clec-18 , se muestra un mayor enriquecimiento de la histona H3K9me3 en el ARNi de GFP, mientras que el enriquecimiento de la histona H3 es similar entre los tratamientos de control y de ARNi de GFP (Figura 2D). Dado que no se espera que el ARNi de GFP afecte a la histona H3K9me3 ni a la ocupación total de la histona H3 en el locus clec-18 , esta normalización mitiga la variación técnica, como las diferencias en la eficiencia de ChIP entre el ARNi de GFP y las muestras de ARNi de control. El cambio de plegamiento de los niveles de histonas H3K9me3 e histonas H3 entre los tratamientos con ARNi muestra un enriquecimiento de la histona H3K9me3 específica del reportero de GFP, independiente de la ocupación de la histona, tras el silenciamiento inducido por ARNi de GFP (Figura 2E).

Figure 2
Figura 2: El silenciamiento inducido por GFP RNAi corresponde a un enriquecimiento elevado de H3K9me3 en la diana de ARNi. (A) Diagrama del reportero de ARNi GFP expresado en la línea germinal mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] con regiones de amplicón de qPCR marcadas. (B) La expresión de GFP se obtuvo a lo largo de las generaciones después de los tratamientos con ARNi a 21 °C. Las barras de error representan la desviación estándar de dos réplicas biológicas. (C) ChIP-qPCR de H3K9me3, histona H3 y control de IgG en adultos jóvenes F1 a partir de dos réplicas biológicas. clec-18 y hrp-2 son los loci de control positivo y negativo para el enriquecimiento de H3K9me3, respectivamente. (D) Enriquecimiento de H3K9me3 e histona H3 en el reportero de ARNi de GFP normalizado al locus de control positivo clec-18. (E) Cambio en el enriquecimiento de H3K9me3 e histona H3 entre los animales tratados con ARNi GFP y los animales tratados con ARNi control, con normalización a clec-18. La línea punteada representa un cambio de plegado de 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este protocolo, el dsRNA se introduce por alimentación, que se ha convertido en un método estándar en C. elegans18. Para los ensayos de herencia de ARNi, el enfoque de alimentación proporciona un método fácil para obtener una gran población de P0 2,11,12,22,23,24,25. Sin embargo, el momento y la duración de la exposición al ARNi afectan a la eficacia del silenciamiento transgénico26, y la concentración de bacterias ARNi afecta a la persistencia del silenciamiento del ARNi hereditario1. Por lo tanto, el crecimiento estandarizado de bacterias ARNi y gusanos es importante para obtener un nivel constante de silenciamiento de GFP y duración de la herencia. Aquí, los embriones se colocan en placas de ARNi para que los animales P0 estén expuestos a las bacterias ARNi desde la eclosión. Los enfoques alternativos han colocado animales sincronizados en estadios L1 24,27 oL4 25 en placas de ARNi-NGM. Además, dado que la inanición y otros estreses afectan el mantenimiento de la herencia de ARNi13, las placas deben ser monitoreadas para evitar el hacinamiento y el agotamiento del suministro de alimentos. Como alternativa a la iniciación del ARNi por alimentación, algunos de los estudios pioneros de herencia de ARNi de C. elegans indujeron el ARNi a través de la inyección en gónadas, lo que proporciona un mayor control de la concentración de dsRNA 1,28.

En este protocolo, cada generación es transitada como una población con tratamiento con hipoclorito alcalino, como se describió previamente 16,22,23,24. El tratamiento con hipoclorito garantiza que la generación F1 no se contaminará con bacterias ARNi del entorno parental22 y evita posibles cuellos de botella no deseados en la población. Sin embargo, el paso a granel también puede ser una limitación, ya que los animales individuales pueden tener patrones de herencia distintos 1,29. Un método alternativo para establecer cada generación es seleccionar animales individuales 1,2,9,11,25. Este enfoque permite el seguimiento de fenotipos dentro de linajes y la incorporación de cruces genéticos. El análisis de linaje también puede ser ventajoso para fenotipos de baja penetrancia12.

La expresión de proteínas fluorescentes es una lectura potente y conveniente del silenciamiento inducido por ARNi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Como se describe en este protocolo, la expresión GFP se puede puntuar manualmente como ON o OFF 11,12,15,16,25. La puntuación manual se puede refinar aún más mediante la asignación de niveles de intensidad cualitativa 3,4,14. Alternativamente, la puntuación de intensidad automatizada de imágenes de microscopía 11,12,14,25,27 o la medición de fluorescencia por citometría de flujo de animales vivos2 pueden proporcionar una lectura cuantitativa y de alto rendimiento. Sin embargo, dado que la expresión del reportero está restringida a la línea germinal, una advertencia de los enfoques automatizados es que también deben diferenciar entre los animales con expresión silenciada de GFP y los animales sin línea germinal, especialmente si el estudio incorpora mutantes con un desarrollo anormal de la línea germinal. Como alternativa a la fluorescencia de GFP, se puede utilizar la transcripción inversa (RT)-qPCR para cuantificarlos niveles de ARNm y ARNm 2,16,23,24. Este enfoque proporciona una lectura más directa del silenciamiento, que se dirige al ARN, y es especialmente útil para otras dianas de ARNi en las que el silenciamiento no produce un fenotipo visible. Una limitación del uso de reporteros artificiales de GFP es que las secuencias exógenas y endógenas están reguladas diferencialmente en el ARNi transgeneracional11. Por lo tanto, los estudios con dianas endógenas, como el alelo letal embrionario sensible a la temperatura oma-1(zu405)1,11,16,25, deben considerarse como un enfoque complementario a los reporteros de transgenes fluorescentes.

El análisis de ChIP en el contexto de los ensayos de herencia de ARNi requiere la comparación entre tratamientos y réplicas. En primer lugar, para tener en cuenta las diferencias en el material de partida entre las muestras, la señal ChIP se normaliza a la señal de entrada en el mismo lugar que el "porcentaje de entrada". El procesamiento de una histona H3 ChIP en paralelo ayudará a determinar si cualquier alteración de la modificación de histonas se corresponde con cambios en la densidad de nucleosomas. Además, debido a que ChIP es un proceso de varios pasos, la eficiencia puede variar entre muestras. La selección de loci de control positivo y negativo apropiados es útil para evaluar y comparar la relación señal-ruido entre muestras y experimentos. Además, para facilitar las comparaciones entre muestras, los valores del ciclo umbral de qPCR de ADN ChIP en el objetivo de ARNi a menudo se normalizan a un locus de control 3,11,15,23,30,31. Para evaluar los efectos del tratamiento con ARNi, también se compara la relación entre la señal ChIP en el ARNi del tratamiento y las condiciones de control o ausencia de ARNi. Una limitación del enfoque actual es que la ChIP se realiza con animales enteros, mientras que la respuesta al tratamiento con ARNi puede ser exclusiva de la línea germinal. Un enfoque para superar esta advertencia es realizar ChIP utilizando núcleos aislados de la línea germinal. Las consideraciones técnicas adicionales para optimizar ChIP también se han discutido ampliamente en otros lugares32,33.

En general, esta herencia de ARNi y el protocolo ChIP proporcionan una base detallada y fácil de adaptar que puede integrarse con otras técnicas para explorar más a fondo la regulación epigenética transgeneracional. Por ejemplo, se pueden construir bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir del ADN ChIP (ChIP-seq) para obtener una visión más detallada del panorama de la cromatina, tanto proximal a la diana de ARNi como a escala de todo el genoma.

Disclosures

Todos los autores confirman que no tienen ningún conflicto que revelar.

Acknowledgments

Deseamos agradecer a los laboratorios de la comunidad de C. elegans que desarrollaron y compartieron las herramientas y cuyo trabajo se cita en este manuscrito. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) a A.L.S. (PJT-175245). C.L. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (PGS-D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Bioshop AGA002
Ampicillin Bioshop AMP201 Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab8898 Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody Abcam ab1791 Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).
Bleach (6% Sodium hypochlorite) Lavo 02358107
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter NA SX1263 Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.
Carbenicillin BioShop CAR544 Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Dynabeads Protein G Magnetic Beads Invitrogen 10003D
E. coli strain HT115(DE3) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) HT115(DE3)
E. coli strain OP50-1 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50-1
EDTA (0.5 M, pH 8.0) Invitrogen 15575020
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Formaldehyde (37%) Sigma F8775
Glycine Sigma 50046 Make a 1.25 M solution and store at 4 °C.
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) Teknova H1035
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells VWR 100488-904
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) BioShop NON999 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) BioShop IPT001 Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725122
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin NA NA Standard lab recipe.
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) Sigma L9756 Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C.
LiCl (8 M) Sigma L7026
M9 Buffer NA NA 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) Applied Biosystems A13346
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) Permagen MSR812
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12541B
Microscope Slide Technologist Choice LAB-037
NaCl (5 M) Promega V4221 For ChIP buffers.
NaOH  Sigma S5881 Make a 10 M solution and store at room temperature.
NGM Plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin.
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) Cell Signaling Technology 2729
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) Sarstedt 82.1135.500
Phosphate Buffered Saline (10X) Fisher BioReagents BP3991
Plasmid - Control RNAi  Addgene L4440 (Plasmid #1654)
Plasmid - GFP-targetting RNAi  Addgene L4417 (Plasmid #1649) Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] Integrated DNA Technologies NA F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Primer pair [clec-18] Integrated DNA Technologies NA F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
Primer pair [gfp exon 1] Integrated DNA Technologies NA F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Primer pair [gfp exon 4] Integrated DNA Technologies NA F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Primer pair [hrp-2] Integrated DNA Technologies NA F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 11836170001
Proteinase K  Bioline BIO-37084
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104
Real-Time PCR Detection System Bio-Rad CFX96 
RNAi-NGM plates NA NA 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.
RNase A Sigma R4642
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma L5777 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
SDS Sigma 74255 Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.
Sodium deoxycholate Sigma 30970 Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
Sonication Tube Evergreen 214-3721-010
Sonication Tube Cap Evergreen 300-2911-020
Sonicator Qsonica Q800R3-110
Streptomycin sulfate Bioshop STP101 Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
TAE buffer (1X) NA NA 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA
Tally counter clicker Uline H-7350
Tetracycline Bioshop TET701 Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C.
Thermomixer Eppendorf 05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Invitrogen 15568025
Triton X-100 Sigma T8787 Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.

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References

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Herencia Epigenética Transgeneracional C. elegans Reportero Fluorescente Inmunoprecipitación de la Cromatina Herencia de ARN de Interferencia (ARNi) ARN No Codificante Modificaciones de la Cromatina Línea Germinal Silenciamiento de Genes Firmas de Cromatina Reportero de Proteína Fluorescente Verde (GFP) ARN de Doble Cadena Desarrollo Sincronizado Microscopía Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR) Enriquecimiento de Modificación de Histonas
Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en <em>C. elegans</em> mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
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Li, C., Bhagoutie, P. A. W., Lao,… More

Li, C., Bhagoutie, P. A. W., Lao, V., Saltzman, A. L. Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). J. Vis. Exp. (195), e65285, doi:10.3791/65285 (2023).

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