Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Svinemodel af biofilminfektion og usynlige sår

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65301
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery, Indiana University School of Medicine

Summary

Kroniske sår, der er resistente over for antibiotika, er en stor trussel mod sundhedssystemet. Biofilminfektioner er stædige og fjendtlige og kan forårsage mangelfuld funktionel sårlukning. Vi rapporterer en klinisk relevant svinemodel af biofilminficerede kroniske sår i fuld tykkelse. Denne model er kraftfuld til mekanistiske undersøgelser såvel som til test af interventioner.

Abstract

Biofilminfektion er en stor bidragyder til sårkronicitet. Etablering af klinisk relevant eksperimentel sårbiofilminfektion kræver involvering af værtsimmunsystemet. Iterative ændringer i værten og patogenet under dannelsen af en sådan klinisk relevant biofilm kan kun forekomme in vivo. Svinesårmodellen er anerkendt for sine fordele som en kraftfuld præklinisk model. Der er flere rapporterede tilgange til undersøgelse af sårbiofilm. In vitro - og ex vivo-systemer er mangelfulde med hensyn til værtens immunrespons. Kortvarige in vivo-undersøgelser involverer akut respons og tillader derfor ikke modning af biofilm, som det vides at forekomme klinisk. Den første langsigtede svinesår biofilm undersøgelse blev rapporteret i 2014. Undersøgelsen anerkendte, at biofilminficerede sår kan lukke som bestemt af planimetry, men hudbarrierefunktionen på det berørte sted kan muligvis ikke genoprettes. Senere blev denne observation valideret klinisk. Begrebet funktionel sårlukning blev således født. Sår, der er lukkede, men mangelfulde i hudens barrierefunktion, kan betragtes som usynlige sår. I dette arbejde søger vi at rapportere de metodologiske detaljer, der er nødvendige for at reproducere den langsigtede svinemodel af biofilminficeret alvorlig forbrændingsskade, som er klinisk relevant og har translationel værdi. Denne protokol giver detaljeret vejledning om etablering af en 8 ugers sårbiofilminfektion ved hjælp af P. aeruginosa (PA01). Otte brændesår i fuld tykkelse blev skabt symmetrisk på dorsum af tamme hvide grise, som blev podet med (PA01) på dag 3 efter forbrænding; efterfølgende blev ikke-invasive vurderinger af sårhelingen udført på forskellige tidspunkter ved hjælp af laser speckle imaging (LSI), ultralyd med høj opløsning (HUSD) og transepidermalt vandtab (TEWL). De podede brandsår blev dækket af en firelags dressing. Biofilm, som etableret og bekræftet strukturelt af SEM på dag 7 efter podning, kompromitterede den funktionelle sårlukning. Et sådant negativt resultat kan vendes som reaktion på passende indgreb.

Introduction

Biofilminfektion komplicerer forbrænding og kroniske sår og forårsager kronicitet 1,2,3,4,5. I mikrobiologi studeres primært biofilmmekanismer med fokus på mikroberne 1,6. Erfaringerne fra disse undersøgelser er af afgørende betydning fra et biologisk videnskabeligt synspunkt, men kan ikke nødvendigvis anvendes på klinisk relevante patogene biofilm 6,7,8. Klinisk relevante biofilmstrukturelle aggregater bør omfatte mikrobielle såvel som værtsfaktorer 8,9,10. Et sådant mikromiljø giver mulighed for inkludering af vært-mikrobe iterative interaktioner, som er afgørende for udviklingen af en klinisk relevant biofilm 7,8. I en sådan proces er deltagelsen af immunceller og blodbårne faktorer kritisk11,12. Værtsmikrobeinteraktionerne, der ligger til grund for kliniske patogene biofilm, som det ses i kroniske sår, forekommer over en lang periode. Enhver eksperimentel tilgang, der sigter mod at udvikle en translationelt relevant model for biofilminfektion, skal således tage højde for disse faktorer. Så vi søgte at udvikle en klinisk reproducerbar kronisk biofilminfektionsmodel for svin.

Mens menneskelige studier klart repræsenterer den bedste tilgang til at studere helbredende resultater, er de ofte ikke bedst egnet til at tackle de underliggende mekanismer og nye mekanistiske paradigmer. Etiske bekymringer begrænser brugen af undersøgelsesdesign, der kræver indsamling af flere biopsier fra et kronisk sår på forskellige tidspunkter. Det er derfor afgørende at have en veletableret og reproducerbar dyremodel for at muliggøre invasive undersøgelser til grundig undersøgelse af biofilms skæbne 7,13. Valget af en dyremodel afhænger af flere faktorer, herunder videnskabelig/translationel relevans og logistik. Svinesystemet er bredt anerkendt for at være den mest translationelt værdifulde eksperimentelle model til undersøgelse af menneskelige hudsår7. Således rapporterer dette arbejde en etableret svinemodel af biofilminficeret brændeskade i fuld tykkelse. Dette arbejde er baseret på flere originale publikationer rapporteret i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denne undersøgelse blev et klinisk isolat af multiresistent Pseudomonas aeruginosa (PA01) valgt til at inficere såret. P. aeruginosa er en almindelig årsag til sårinfektioner 2,18,19,20. Det er en gramnegativ bakterie, der kan være vanskelig at behandle på grund af dens resistens over for nogle antibiotika11,19,21. Ingen af de hidtil rapporterede svinebiofilmmodeller involverede 8 ugers langtidsundersøgelser 22,23,24,25,26. Kroniske sår er dem, der forbliver åbne i 4 uger eller mere 14,27,28. Der er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapporteret i litteraturen. Dette arbejde omhandler begrebet funktionel sårlukning 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147. Undersøgelsen blev udført på Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University. Vi brugte en kvindelig indenlandsk hvid gris (70-80 lb) i denne protokol.

1. Akklimatisering af dyr

  1. Ved ankomsten af grisene til anlægget skal dyrene huses individuelt i samme rum i mindst 3 dage til akklimatisering og social interaktion.
  2. Foder grisene en velafbalanceret kost. Bestem mængden fodret baseret på vægt, og følg producentens anbefalinger.
  3. Sørg for, at dyret fastes i 6-12 timer før proceduren for at forhindre kvalme, opkastning og aspiration af mavevæsker under anæstesi.

2. Opsætning af operationsrum

  1. Forbered anæstesimaskinen, og sørg for, at den er klar med rebreathing-kredsløbet.
  2. Arranger rummet til operation, som beskrevet nedenfor (figur 1A).
    1. Dæk procedurebordet med en steril gardin, og læg et cirkulerende vandtæppe nedenunder for at hjælpe med termoregulering.
    2. Opsæt et bord med induktionsforsyninger og operationsforberedelsesmaterialer. Opsæt et bord med brænderenheder og kontrolbokse. Konfigurer billedbehandlingsudstyret, og sørg for, at det er tændt.

3. Sedation af grisen

  1. Bedæt grisen med en intramuskulær injektion af TKX (Telazol 4,4 mg/kg; ketamin 2,2 mg/kg; xylazin 2,2 mg/kg) i en dosis på 1 ml/50 lb. Hold grisen i procedurerummet på 1% -3% isofluran leveret via en maske.
  2. administrere de (præoperative) analgetika til svinene i henhold til IACUC-protokollen; nogle eksempler er som følger: buprenorphin 0,3 mg / ml, 0,01-0,05 mg / kg IM; carprofen 50 mg/ml, 4 mg/kg IM eller sq; fentanyl transdermal 100 mcg/h placeret på ørepinna; gabapentin 300 mg kapsler, 3-10 mg/kg PO.
    BEMÆRK: For alle forbrændings- og biopsiprocedurer gives 1 dosis gabapentin dagen før operationen, og 1 dosis carprofen gives på dagen for proceduren. Til hovedbrændingsproceduren placeres et fentanylplaster, og der gives 1 fuld dosis buprenorphin under kirurgisk forberedelse.

4. Induktion af anæstesi

  1. Steriliser øret med skiftevis 2% chlorhexidinskrubbe og alkohol mindst tre gange. Indsæt A 22-18 G 1 i intravenøst kateter i den marginale ørevene, og bekræft blodgennemstrømningen. Skyl kateteret med saltvand, og fastgør kateteret med kirurgisk tape (figur 1B).
  2. Intubér grisen med et endotrakealt rør af passende størrelse (7-9 mm), når muskelafslapning er opnået ved indånding af anæstesi via masken. Kontroller muskelafslapningen ved tab af kæbetone og en palpebral refleks, der observeres.
    1. Åbn røret, og test manchetlækagen ved hjælp af en luftsprøjte. Indsæt røret ved hjælp af et laryngoskop30.
    2. Pust manchetten op, og fastgør røret, når korrekt placering er bekræftet. Tilslut grisen til rebreathing-kredsløbet.
      BEMÆRK: Røret bindes på plads over trynen, og rullegaze bruges til at fastgøre det. Auskultation af brystet udføres med et stetoskop for at bekræfte den korrekte placering af røret.
      BEMÆRK: Under anæstesi tilføres luft hvert 5.-10. minut ved at lukke pop-off-ventilen og trykke rebreathingposen ned, indtil trykmanometeret når 20 mm / Hg for at forhindre positionel atelektase.
  3. Overvåg dyret og dybden af anæstesi.
    1. Tilslut grisen til en multiparametermonitor. Monitoren vil løbende aflæse iltmætning (SpO 2), puls, slutvandskuldioxid (EtCO2), respirationsfrekvens og temperatur. Optag vitalerne hvert 10. minut under hele proceduren.
    2. Vurder dybden af anæstesi ved at teste smertereflekserne med en bagbens tåklemme, inden såret påbegyndes.
      BEMÆRK: Når det er nødvendigt, juster bedøvelsesfordamperen for at administrere yderligere anæstesi, eller vent et par minutter. Kontroller smertereflekserne og palpebrale reflekser regelmæssigt under hele operationen.

5. Dyreforberedelse til brandsår

  1. Afbryd grisen fra anæstesimaskinen, og flyt den til procedurebordet. Placer grisen i agterlig liggende stilling, og sørg for at fastgøre alle de tilsluttede linjer og rør (figur 1C).
  2. Tilslut grisen igen til anæstesimaskinen, og holdO2 ved 0,8-1,5 l / min og isofluran ved 1% -3% indtil procedurens afslutning.
  3. Indgiv IV væsker (LRS) til grisen med en dryphastighed på 8-10 ml / kg / time. Overvåg anæstesien som i trin 4.3.

6. Antiseptisk forberedelse og mærkning af hudforbrændingsstedet

  1. Forbered sårområdet ved at barbere og påføre hårfjerningscremen som beskrevet nedenfor (figur 2).
    1. Barber griseryggen i et område på ca. 25 cm bredde fra rygsøjlen hele vejen til axillen på begge sider ved hjælp af elektriske klippere.
    2. Påfør hårfjerningscremen på det afklippede område, og lad det sidde i 3-7 min. Fjern cremen sammen med håret ved hjælp af rene absorberende håndklæder.
  2. Forberedelse af brændestedet
    1. Skrub det område, der skal såres, med skiftevis 2% chlorhexidinscrub og 70% isopropylalkohol mindst tre gange i ca. 5 min. Sørg for, at skrubben påføres i et bullseye-mønster (starter i midten og bevæger sig udad i en spiral) af personale iført sterile handsker.
    2. Marker sårstederne ved hjælp af en steril forbrændingsskabelon og en kirurgisk hudmarkør (figur 2B). Marker seks til otte sår (2 i x 2 tommer) symmetrisk på ryggen.
    3. Dæk områderne omkring de markerede steder med en steril drapering for at reducere kontaminering (figur 2C).

7. Burn sårprocedure

  1. Brug en brændeanordning, såsom en internt fremstillet brugerdefineret brænder bestående af en 2 tommer x 2 i rustfrit stålblok (vægt: 352 g) forbundet til en metalpen, en elektronisk mikrostat og en elektronisk vægt (samlet vægt: 1,714 g; Figur 3).
    1. Indstil brænderen til den ønskede temperatur. Måltemperaturen justeres for sår i fuld tykkelse ved 150 °C (figur 3A). For at gøre dette skal du justere indstillingspunktet (SP) på styreenheden til 150 °C. Indstil det lave sætpunkt til 145 °C og det høje sætpunkt til 155 °C (figur 1D).
  2. Opret et brændsår i fuld tykkelse på 2 tommer x 2 tommer ved hjælp af opvarmede blokke i rustfrit stål, der er forbundet til brændeanordningen, og placer dem på huden i 60 s (figur 3B, C). Under påføring af forbrændingen skal du bruge den elektroniske vægt for at sikre, at brænderen påfører ensartet tryk.

8. Vurdering og billeddannelse af brandsår

  1. Digital fotografering
    1. Billede sårene ved hjælp af et DSLR-kamera og et elektrofokus kort tilbagefokus (EFS) 17-55 mm ultralyd vidvinkelobjektiv og en lommelygte.
    2. Tag et digitalt foto af hele grisen tilbage, inklusive et plakat med grisens identifikation, tidspunkt og dato. Tag derefter billeder for hvert sår separat, der viser et skilt med svine-id, sår-id og tidspunkt og en lineal.
    3. Beregn sårområdet som procentdelen af den oprindelige sårstørrelse på hvert indsamlingstidspunkt indtil dag 56.
      BEMÆRK: I dette arbejde blev sårområdet beregnet på hvert tidspunkt (d0, d7, d14, d28 og d56) som en procentdel af det oprindelige sårområde på d0.
  2. Laserspeckle imaging (LSI)
    1. Til laserspeckle-billeddannelse skal du bruge et blodperfusionskamera baseret på laserspecklekontrastanalyseteknologien (LASCA) til at vurdere sårmikrovaskulær perfusion i realtid.
    2. Tag billederne af alle sårene i en enkelt optagelse. Juster den målte værdi af arbejdsafstanden fra laserkameraet til såret, så den er konsistent for billeddannelsen af hvert sår (figur 4A).
    3. Optag perfusionen ved en række billeder taget over et tidsrum på 10-15 s. Når et sår er afbildet, stopper optagelsen automatisk, og optagelsen genoptages, når kameraet er justeret for det efterfølgende sår. Hver gang optagelsen stopper, tilføjes en markør for at identificere såret.
  3. Transepidermalt vandtab (TEWL)
    1. Mål TEWL for hvert sår ved hjælp af en standardenhed, en TEWL-sonde og software (figur 4B). For hvert sår placeres et rent sondedæksel over sondespidsen, som vil være i kontakt med sårvævet.
    2. Placer sonden forsigtigt og jævnt på huden, og start aflæsningen ved at trykke på Start-knappen på enheden.
    3. Mål hvert sår fem gange, først i midten og derefter i hvert hjørne. Eksporter derefter alle aflæsningerne til et regneark (figur 4B).
  4. Harmonisk ultralyd (HUSD)
    1. Udfør HUSD-kortlægning ved at scanne såret med en ultralydssonde (US) fra midterlinjen (rygsøjlen) startende fra normal hud mod den laterale side af grisen, hvor der igen er normal hud. Følg dette scanningsmønster for hvert sår i både B-tilstand og vævselastografitilstand ved hjælp af ultralydsmaskinen (figur 4C).
      1. Til B-mode scanning skal du anvende steril ultralydsgel på sårområdet og anvende noget på ML-615 højopløsningssonden. Anmærk hver optagelse med såridentifikationsetiketten. Start optagelsen, og flyt sonden langsomt fra midterlinjen ned i såret, indtil den normale hud på den anden side er nået.
        BEMÆRK: Når scanningen er afsluttet, gemmes optagelsen og eksporteres fra maskinen til analyse.
      2. For elastografi skal du skifte ultralydsmaskinen til elasto-tilstand ved at trykke på Elasto-knappen . Scan såret igen på samme måde som ved B-tilstandsscanning, og sørg for, at sondens ensartede tryk opretholdes, så elastografifarveindikatoren (grønne bjælker) forbliver synlig under hele optagelsen.
        BEMÆRK: Passende tryk kan bestemmes af skalabjælken på optagelsen, som vises grønt, når den korrekte kontakt foretages (figur 4D).
      3. Skift annotationen, når hvert sår er afbildet i både B-tilstand og elasto-tilstand (to optagelser pr. sår). Skift kommentaren i softwaren for at inkludere oplysningerne om det næste sår, og gentag processen for de efterfølgende sår.

9. Bandage og dressing

  1. Dæk brandsårene enkeltvis med gennemsigtige filmbandager eller testbandagen (figur 5A, B). Anbring en større gennemsigtig filmbandage over hele sårområdet (figur 5C).
  2. Påfør et andet lag rullegaze løst rundt om hele svinens stamme for at absorbere ethvert væskeekssudat, der kommer fra sårene. Rul grisen frem og tilbage fra siden til lidt på ryggen for at vikle bandagematerialet rundt om grisen.
  3. Dæk gasbindet løst med et lag fleksibel elastisk bandage (figur 5D). Sørg for, at bandagen ikke er for stram, da påføring af den for stramt kan begrænse vejrtrækningen og lægge pres på maven, hvilket kan resultere i rektal prolaps eller forskellige komplikationer.
    BEMÆRK: Den elastiske bandage er elastisk og kan let overspændes under påføring. Hvis du trækker den af rullen og lader den ligge over kanten af den forrige wrap, kan det hjælpe med at forhindre overspænding.
  4. Dæk den elastiske bandage med et sidste lag på 4 i elastisk tape (figur 4E). Sørg igen for, at påføringen ikke er for stram, men sørg for, at bandagen er fastgjort i øverste og nederste kant for at forhindre, at den glider ned, når grisen bevæger sig rundt efter proceduren.

10. Dyrs restitution og postoperativ pleje

  1. Opsving
    1. Afbryd bedøvelsesgassen efter afslutningen af såret, billeddannelsesproceduren og bandagering. Lad grisen forblive på ilt i mindst 5 min.
    2. Flyt grisen, når den er vendt tilbage til det primære anlæg, fra transport-/løftebordet til en skumgenvindingsmåtte i buret. Hæv den automatiske vander, og fjern j-feederen for at forhindre skade på grisen under genopretning.
    3. Dæk grisen med tæpper (herunder et varmt lufttæppe), hvis hypotermi er til stede. Overvåg og registrer vitaliteten, herunder temperatur, puls, respirationshastighed og SpO2 hvert 10.-15. minut.
    4. Overvåg grisen kontinuerligt, indtil den er i stand til at opretholde bryst liggetid uafhængigt. Når grisen er helt genoprettet, sænk brystvorten vander, og så kan grisen også fodres.
  2. Vurdering af smerter
    1. Udfør en postoperativ smertevurdering ved hjælp af en modificeret Glasgow smertescoringsformular. Sørg for, at smertevurderingerne udføres af enten laboratorie- eller LARC-personale mindst hver 12. time i de første 3-4 dage postoperativt. Hyppigheden af smerte scoring bestemmes af den behandlende dyrlæge. Hvis dyret scorer over 5, skal du administrere redningsanalgesi (buprenorphin eller hydromorfon).
    2. Giv analgesi ved at administrere en dosis buprenorphin 0,01-0,05 mg/kg i.m. før proceduren, med en anden dosis givet 8-12 timer senere.
    3. Placer et fentanylplaster (100 mcg/t) på pinna i øret før brandsåret.
    4. Injicer carprofen 4 mg/kg IM eller SQ før proceduren, og derefter en gang dagligt IM, SQ eller PO i 2 dage eller som anvist af LARC-dyrlægen.
    5. Giv gabapentin 3-10 mg/kg oralt, med en dosis, der gives dagen før proceduren, morgenen for proceduren, aftenen efter proceduren og derefter hver 12. time i 3-5 dage.
  3. Diæt
    1. Sørg for, at grisene er genoprettet, og lad derefter fri adgang til vand og mad i henhold til deres vægtbaserede ration to gange dagligt.
    2. Sørg for fødevareberigelse (frisk frugt og grøntsager, frossen frugt, skumfiduser, yoghurt, budding osv.), Og brug disse til at lokke til at spise, hvis der observeres nedsat appetit.
  4. Dressing skift
    1. Skift bandagerne mindst en gang om ugen eller oftere, hvis bandagerne bliver snavsede eller for at imødekomme behandlingsstrategier.
    2. Skift bandagerne efter billeddannelse, mens du stadig er under anæstesi, eller bedøm grisen med kun TKX til bandageskift.
    3. For at udskifte bandagen skal du starte med forsigtigt at fjerne den snavsede bandage ved hjælp af Lister-bandagesaks eller traumesaks, og vær opmærksom på ikke at lade ydersiden af bandagen komme i kontakt med sårene.
    4. Rens området omkring sårene, hvis det er nødvendigt, med 0,9% NaCl på rent gaze, og tør området forsigtigt. Følg proceduretrinnene for bandagering, der er beskrevet i afsnit 9.
      BEMÆRK: Hvis der anvendes eksperimentelle bandager, kan disse påføres, før sårene dækkes med den gennemsigtige filmbandage.
  5. Billedfrekvens
    1. Få billeddannelse (digitale fotos, LSI, TEWL og HUSD) på forskellige tidspunkter i hele undersøgelsen. Indsaml billeddata på dag -3 (brandsår), dag 0 (podning) og dag 7, dag 14, dag 28, dag 35 og dag 56 efter podning.

11. Forberedelse og podning af biofilm

  1. Forberedelse af podning
    1. Forbered en startplade fra en glycerolfrysebestand af Pseudomonas aeruginosa (PA01) til en ren kultur af bakterien. Dyrk en P. aeruginosa-kultur i Luria-Bertani agar (LBA) med lavt saltindhold, og inkuber ved 37 °C natten over.
    2. Pod 5 ml Luria-Bertani bouillon med lavt saltindhold (LBB) med en enkelt P. aeruginosa-koloni den næste dag, og inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 200 o / min.
    3. For at opnå logfaseceller podes 200 μL af natkulturen i 5 ml LBB og inkuberes i rysteren ved 200 rpm ved 37 °C i 2,5 timer.
    4. Den optiske massefylde måles ved 600 nm (OD600) ved hjælp af et spektrofotometer. Forbered serielle fortyndinger op til 1 x 10-9 ved anvendelse af 100 μL fra kulturen i 900 μL steril LBB.
      BEMÆRK: Vi startede med ufortyndede prøver og sluttede med 1 x 10 7 CFU/ml.Vi opnåede tællelige kolonier i 1 x 107 fortyndingen, så vi betragtede denne fortynding som slutfortyndingen.
    5. 100 μL af hver fortynding fordeles på LBA og inkuberes natten over ved 37 °C. I henhold til standard mikrobiologiske protokoller skal du bruge fortyndinger, der viser tællelige kolonier (30-300) til kolonitællingen, og opnå kolonidannende enheder (CFU).
  2. Inokulering af såret
    1. Der podes 200 μL fra natkulturen i 5 ml LB-bouillon, og der inkuberes i rysteren ved 37 °C i 2,5 timer.
    2. Mål den optiske tæthed af dagkulturen ved 600 nm (OD600). Til PA01-podning skal du bruge 3 x 10 8 CFU/ml (250 μL 1 x 108 CFU/ml PA01 podes pr. sår). Transport podningen til dyreanlægget i en biologisk farlig beholder.
    3. Podematerialet spredes over overfladen af de udsatte sår på dag 3 efter forbrænding ved hjælp af en pipette, og fordel jævnt ved hjælp af en engangsspreder (figur 6). Hold sårene åbne i ca. 15 minutter, før du bandager.
      BEMÆRK: Alle kirurgiske procedurer, podning, vævsbiopsier, billeddannelse og bandage udføres under generel anæstesi som i afsnit 3 og 4.
  3. Bekræftelse af etablering af infektion
    BEMÆRK: For at bekræfte, at sårene er blevet inficeret med succes efter podningen, anvendes flere tilgange, og sårprøver sammenlignes med prøver indsamlet fra normal hud; Nedenfor er nogle eksempler.
    1. Til patologibaseret analyse af prøver indsamlet på forskellige tidspunkter skal du bruge antallet af kolonidannende enheder til at estimere en infektion (CFU; Figur 7E, F).
      1. Opsaml 6 mm sårvæv ved stansebiopsi. Mærk og vej tomme 5 ml rundbundede rør. Prøverne overføres til glassene, og rørene vejes med prøverne.
      2. Skær vævet i tern med en skalpel på en steril overflade. Udfør alle trin i en BSL2-hætte.
        BEMÆRK: For at sikre, at vævene let homogeniseres, skal størrelsen være meget lille (men ikke mindre end 0,5 mm)
      3. Sæt prøven i røret, og tilsæt 1 ml PBS. Bland og slib vævet ved hjælp af en hård vævsslibesonde.
      4. Serialt fortyndes homogenatet (ufortyndet til 1 x 10-5) og plade 50 μL af hver fortynding i selektive (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) og ikke-selektive (LBA) medier.
      5. Alle fortyndingerne inkuberes under aerobe forhold ved 37 °C i 18-24 timer. Billede pladerne med korrekte lysforhold.
      6. Vælg plader med 30-300 kolonier, hvis ingen af pladerne har nået denne koncentration, skal du bruge den ufortyndede plade. Brug ImageJ til at tælle kolonitallene, og beregn CFU'en pr. plade ved at gange gennemsnitsværdien med den endelige fortyndingsfaktor.
    2. Hent billederne fra prøver indsamlet fra dag 7 efter podning og andre tidspunkter ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM) for at bekræfte tilstedeværelsen af bakteriebiofilmene (figur 7G).
      BEMÆRK: Dag 7 efter podning blev valgt, fordi det er dagen for etablering af biofilminfektion og begyndelsen på blødgøring af brændeskar, hvilket muliggør indtrængning af de amerikanske bølger og dermed visualisering af de dybere væv. I figur 4 skal du kontrollere dag 3 US burn wound image, som viser den tykke læderagtige sårskorpe, der forhindrer de amerikanske bølger i at passere igennem til de dybere væv.
    3. Plet sektionerne af sårbiopsierne med specifikke antistoffer mod P. aeruginosa for at bekræfte tilstedeværelsen af de specifikke bakterier, som vist i en tidligere publikation13 (figur 7H).
    4. Udfør næste generations sekventering (NGS), som offentliggjort i Sinha et al.31. Kvantiter bakterierne 16srRNA fra de inficerede sår og de normale uinficerede hudprøver indsamlet på forskellige tidspunkter fra dag 7 efter podning til afslutningen af undersøgelsen.

12. Indsamling af biopsi

  1. Indsamle vævsbiopsier til analyse efter billeddannelse på dag 7, dag 14, dag 28 og dag 56 efter podning. Saml biopsier fra hvert sår kun én gang for at minimere interferensen med helingsprocessen.
    BEMÆRK: Alle kirurgiske procedurer, podning, vævsbiopsier, billeddannelse og bandage udføres under generel anæstesi som i afsnit 3 og 4.
    1. Infiltrer området omkring såret med 0,5% bupivacain. Skær en 3-4 mm bred strimmel fra den ene kant af såret til den anden, og hold små margener af normal hud i begge sider ved hjælp af en engangsskalpel med et blad i størrelse 10. Placer strimlen i et mærket konisk rør fyldt med 4% bufret formalin til fiksering.
      BEMÆRK: Til tidlig tidsbilleddannelse og biopsiprocedurer vil en fuld dosis buprenorphin blive givet under kirurgisk forberedelse. For sene tidspunkter biopsi procedurer, en halv dosis af buprenorphin vil blive givet under kirurgisk prep. Efter alle forbrændings- og biopsiprocedurer vil gabapentin blive givet BID i op til 7 dage som anbefalet af den behandlende dyrlæge. Carprofen vil blive givet i flere dage efter operationen eller som anbefalet af den behandlende dyrlæge.
    2. Skær en 6 mm stansbiopsi af såret (enten fra sårbunden eller sårkanten). Opsaml fra sårkanten, herunder en del af den normale hud og sårlejet, til forskellige typer analyser.
    3. Fjern prøven ved hjælp af steriliseret tang og dissekering saks. Biopsiprøven anbringes i det dertil egnede rør eller kassette til behandling og analyse.
    4. For CFU, SEM, RNA og FPPE opbevares prøverne i reagensglas med en passende buffer. For eksempel kan prøver placeres i OCT i kassetter til laserfangstmikroskopi (LCM) og immunhistokemi (IHC).
    5. Opnå hæmostase, efter at prøverne er opsamlet ved forsigtigt at trykke såret med en steril gasbind. Dæk såret med ikke-klæbende bandage og bandage som i punkt 9.

13. Eutanasi og vævsindsamling

  1. Bedøm grisen på eutanasidagen med TKX, og bedøm med isofluran. Anbring et intravenøst kateter i den marginale ørevene ved at følge trinene beskrevet i punkt 3. Intubere grisen ved at følge trinnene i punkt 4.
  2. Fjern bandagen, når grisen er bedøvet, og rengør området omkring sårene.
  3. Komplet digital fotografering, LSI, TEWL og HUSD-billeddannelse. Udtag prøverne fra sårene og normal hud ved at følge trinene beskrevet i punkt 12.
  4. Når alle de krævede prøver er indsamlet, aflives grisen humant, mens den stadig er under anæstesi via en intravenøs injektion af kommercielt tilgængelig eutanasiopløsning (natriumpentobarbital). Brug et stetoskop til auskultation for at bekræfte ophør af hjerteslag og spontan åndedræt.
  5. Udfør en sekundær metode til eutanasi, som krævet af SOM IACUC, ved at bruge en skalpel til at inducere pneumothorax. Overfør svinekroppen til en tønde, og transporter den til fryseren for at blive afhentet til forbrænding.

Representative Results

En standardiseret forbrændingsanordning blev brugt til at skabe brændesår i fuld tykkelse ved 150 ° C i 1 min, hvilket resulterede i en homogen dyb forbrænding med en ensartet margen for erytem og betændelse (figur 3 og figur 7). Hvert svin fik otte brændesår i fuld tykkelse på ryggen, som vist i figur 3C.

Den ikke-invasive realtidsvurdering af brandsårene ved hjælp af B-mode ultralyd med høj opløsning for at bekræfte sårdybden og progressionen af sårheling over tid viste ødelæggelsen af alle hudlag op til det subkutane fedt (figur 4). Laser speckle imaging (LSI) blev anvendt til yderligere karakterisering af sårperfusionen (figur 4A).

Brandsårene viste en tyk pyogen membran på såroverfladen på dag 7 efter podningen, hvilket bekræftede infektionen og etableringen af brandsårets biofilm (figur 7A). Digital planimetry viste et øget sårområde på dag 3 efter podning med PAO1 på grund af det inflammatoriske respons på sårstedet og margenerne (figur 7A, B). Selvom sårområdet begyndte at skrumpe på dag 14 efter podning, blev der observeret ufuldstændig heling til ca. 25% af den oprindelige sårstørrelse på dag 56, hvilket indikerer sårenes kronicitet (figur 7B). Sårkronicitet og nedsat sårheling blev yderligere bekræftet af TEWL, som viste højt transepidermalt vandtab. TEWL-resultaterne afspejlede tabet af hudbarrierefunktion sammenlignet med normal hud på alle målte tidspunkter, hvilket indikerer funktionsnedsættelse af brandsårshelingen (figur 7B). Dette blev også bekræftet af undertrykkelsen af de stramme forbindelsesproteiner ZO-1 og 213 og svækkelsen af genoprettelsen af hudens barrierefunktion, hvilket afspejles i de høje TEWL-værdier, der ses på dag 35 (midt) og dag 56 (sent) på trods af den visuelle sårlukning (figur 7I).

Brændedybden blev yderligere valideret ved H&E-farvning, som viste forvrængning og nekrose af alle de histologiske hudlag, som vist i figur 7C. Den etablerede biofilm af PA01 blev yderligere valideret på dag 7 efter podning ved CFU (figur 7E, F), SEM-billeddannelse (figur 7G) og immunofluorescensfarvning (figur 7H).

Figure 1
Figur 1: Opsætning af proceduren . (A) Forberedelse af kirurgisk bord. (B) Ørevenekanylering for IV-væsker og lægemiddeladministration. C) Termisk tæppebelægning for at beskytte grisen mod hypotermi under proceduren. (D) Opsætning af brænder og timer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sterilisering og mærkning på operationsstedet . (A) Klipning og sterilisering af hår. (B) Mærkning af forbrændingsstedet ved hjælp af en steril otte-viklet standardskabelon (hvert sår er 2 tommer x 2 tommer). C) Endelig mærkning ved hjælp af en steril hudmarkør. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Induktion af brandsår. (A,B) Standardiseret brænder med manometer og automatiseret styreenhed (2 tommer x 2 tommer) påført det forudmærkede sårsted. (C) Hele ryggen viser de otte brandsår i fuld tykkelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Noninvasiv billeddannelse og vurdering af brandsår. (A) Laserspeckle imaging (LSI) med korrekt orientering af laserstråleindikatoren til midten af såret er vist i billedet til venstre; billedet i højre side viser LSI-enheden og realtidskortet over vaskulær perfusion af huden. (B) Påføring af transepidermalt vandtab (TEWL) på sårstedet fem forskellige steder (fire sårhjørner og midten vist på billedet i nederste højre hjørne) vises på billedet til venstre; billedet i højre side er en repræsentativ realtidsoptaget skærm af TEWL-målingen. (C) Harmonisk ultralydsscanning af brandsåret ved hjælp af en 16 MHz ultralydssonde med høj opløsning vises på venstre side; Billedet til højre viser ultralydsenheden og skærmoptagelsen i realtid. (D) Strukturelle (B-mode billeder, gråtoner ultralyd) og biomekaniske (elastografi, farve ultralyd) billeder af brandsårsstedet på podningsdagen og dag 7 efter podning. Sårdybden er angivet med den gule stiplede linje. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sårbandage og bandagebandage . (A) Påføring af den gennemsigtige filmbandage for hvert sår separat. (B) Alle dorsale podede brandsår er dækket af det første lag bandage. (C) En større gennemsigtig filmbandage placeres over hele sårområdet. (D) Påføring af det andet lag gaze og et løst lag elastisk bandage rundt om hele svinestammen for at absorbere ethvert væskeekssudat, der kommer fra sårene. (E) Dækning af hele sårområdet med et sidste lag på 4 i klæbende bandage. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Bakteriel podning . (A) Opsætning til Pseudomonas aeruginosa (PA01)-podningen på dag 3 efter forbrænding. (B) Topisk påføring af podematerialet med en pipette med et volumen på 500 μL for hvert sår. (C) Podematerialet fordeles jævnt over såroverfladen ved hjælp af en steril engangsspreder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Sårhelingsfremskridt og bekræftelse af biofilm. (A) Repræsentative billeder af sårlukningen over undersøgelsens tidslinje. Skalastang = 1 cm. (B) Kvantificering af sårarealet og TEWL-målinger over undersøgelsens tidslinje (n = 6). Dataene er repræsenteret som middelværdi ± SD. N.S. henviser til TEWL-værdien af normal hud. (C) Skematisk diagram, der viser forskellige sårbiopsisteder. D. H&E-farvning med den tilsvarende Massons trikromfarvning, der viser forvrængning og nekrose af alle hudlagene på dag 3 efter forbrænding og dag 7 efter podning. Skalabjælke = 500 μm. (E) Repræsentative digitale billeder af ikke-selektiv agar (Luria-Bertani agar) og selektiv agar (Pseudomonas Isolation Agar) med bakteriekolonier dyrket af svinesårbundsvæv. Det selektive medium muliggør kun nøjagtig optælling af PA01-kolonierne. (F) Der vises en stikprøveberegning af kolonidannende enhed (CFU) ud fra kolonitællingerne taget fra behandlede dag 7 sårbiopsier efter podning. (G) Repræsentative scanningelektronmikroskopibilleder (SEM) af de podede brandsår på dag 7 efter podning, der viser den etablerede PA01-biofilm med et zoomet billede på højre side. Skalabjælke = 1 μm. De røde pilespidser peger på ekstracellulære polymere stoffer (EPS). (H) P. aeruginosa på brandsårene blev visualiseret ved hjælp af anti-Pseudomonas (grønt) antistof; immunofluorescensbillederne fra dag 7 efter podning af sårbiopsier viser kraftig kolonisering af sårvævet af P. aeruginosa. Skalabjælke = 100 μm. (I) Repræsentativ mosaik (skalabjælke = 200 μm) og tilsvarende zoomede (skalabjælke = 50 μm) billeder af ZO-1- og ZO-2-farvede sektioner på dag 35 og dag 56 efter podning, der viser reduceret ekspression af proteinerne efter den inducerede infektion. De OCT-indlejrede frosne sektioner (10 μm) blev farvet ved hjælp af anti-ZO-1 (grøn) eller anti-ZO-2 (grøn). Sektionerne blev modfarvet ved hjælp af DAPI. Søjlediagrammerne viser kvantificeringen af ZO-1 og ZO-2 signalintensiteten. Dataene præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 3); * p < 0,05 sammenlignet med spontane. Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis envejsanalyse af varianstest blev udført for at teste betydningen. Figur 7H,I er blevet ændret fra Roy et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne rapport indeholder en detaljeret protokol for opstilling af en svinemodel for kronisk sårbiofilminfektion til eksperimentelle undersøgelser. Flere svinebiofilmmodeller er tidligere rapporteret 22,23,24,25,26, men ingen af dem er svinemodeller, der involverer 8 ugers langtidsundersøgelser. Kroniske sår er dem, der forbliver åbne i 4 uger eller mere 14,27,28. Der er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapporteret i litteraturen. Dette arbejde omhandler begrebet funktionel sårlukning 2,7,13,15,17,29. En undersøgelse foretaget i 2014 var den første til at rapportere, at biofilminficerede sår kan lukke uden genoprettelse af barrierefunktion7. Måling af hudbarrierefunktionen i det helende sår ved hjælp af transepidermalt vandtab (TEWL) rapporteres i dette arbejde.

Anatomisk og fysiologisk er svinehuden sammenlignet med huden hos andre små dyr tættere på den menneskelige hud32,33,34. Både svine- og menneskehud har en tyk epidermis 33, og forholdet mellem dermal og epidermal tykkelse varierer fra 10: 1 til13: 1 hos svin, hvilket kan sammenlignes med mennesker34,35. Histologisk og biomekanisk viser huden hos mennesker og svin ligheder i rete-ridges, subdermalt fedt, dermal kollagen, hårfordeling, adnexale strukturer og blodkarstørrelse og fordeling36,37,38. Funktionelt deler både svin og mennesker ligheder i sammensætningen af lipid-, protein- og keratinkomponenterne i det epidermale lag samt sammenlignelige immunhistologiske mønstre37,38. Immunsystemet hos svin sammenlignet med andre små dyr deler højere ligheder med det menneskelige immunsystem, hvilket betyder, at svin er en passende model til undersøgelser af værtsinteraktionerne, der er integreret i kompleksiteten af den patologiske biofilm i sårinfektioner39. Den kritiske vurdering af fordele og ulemper ved forskellige dyremodeller har ført til konsensus om, at grise repræsenterer en effektiv model til undersøgelse af sårheling34,38. Derudover udvikler tamsvin spontant kroniske bakterielle infektioner, som observeret hos mennesker10. Forbrændingsanordningen, der bruges til at skabe sårene, er en avanceret og automatiseret forbrændingsenhed, der leverer varmeenergi baseret på en temperaturaflæsning fra det målrettede hudsted22,40. En sådan tilgang forbedrer strengheden og reproducerbarheden af forbrændingsskaden. Brugen af humane kliniske isolater af bakterier til at inficere svinesårene tilføjer værdi som en præklinisk model.

Forbrændingsskader er komplekse og forårsager flere systemiske forstyrrelser20,41. Det er således vigtigt at genoplive grisen med tilstrækkelige væsker og forhindre hypotermi under anæstesi og genopretning. Flere faktorer kan forstyrre sårhelingen, herunder ernæring efter forbrænding, væsker og smerter42. Tæt overvågning af ernærings- og smertevurderingerne er derfor af betydning. Smerter efter forbrænding kan være alvorlige og påvirke dyrets adfærd og kost. Interventioner til at løse adfærdsmæssige bekymringer skal overvejes aktivt. Regelmæssig og kontinuerlig smertescoring og styring er afgørende. Et grundigt smertevurderingsark med en meget detaljeret smertehåndteringsplan er inkluderet i denne protokol. For at undgå krydskontaminering mellem sårene skal der lægges særlig vægt på at påføre det første lag af bandagen på hvert sår separat. Der skal udvises kritisk omhu ved håndtering af alle biofarlige materialer og ved udførelse af grundig desinfektion af udstyr, værktøjer og hele operationsrummet. Anvendelsen af flere lag af bandagen forhindrer grisen i at udsætte sårene under deres bestræbelser på at gnide eller ridse kløen tilbage.

Grisen i den nuværende model blev ikke kompromitteret af underliggende metaboliske lidelser (f.eks. diabetes), og derfor var den effekt, der blev undersøgt, udelukkende virkningen af bakteriel biofilminfektion på sårheling. Modellen egner sig imidlertid til induktion af diabetes (f.eks. ved hjælp af streptozococin) og kan bruges til at studere biofilminfektion i forhold til en underliggende metabolisk lidelse. Den anden begrænsning af modellen er den kontrollerede infektionsindstilling ved hjælp af P. aeruginosa, en bakterie. Det forventes, at grisens normale hudmikroflora også kan vokse i såret og kan påvirke helingen. Yderligere analyse ved hjælp af NGS eller andre avancerede teknikker til at afgrænse sårets mikrobielle indhold er nødvendig. Den nuværende model kan også anvendes på blandede infektioner med forskellige mikrobielle arter (f.eks. svampe, virale osv.). Dette er et vigtigt element, da klinisk relevante sår sandsynligvis vil blive befolket af blandede mikrober, hvilket kan påvirke sårheling forskelligt.

Der er mange potentielle fordele ved denne model, herunder ligheden med kompleksiteten og langsigtede følgevirkninger af humane kroniske sår, den automatiserede og reproducerbare forbrændingsproces og brugen af klinisk isolerede bakteriearter. Brugen af flere ikke-invasive billeddannelsesmetoder repræsenterer en kraftfuld tilgang til indsamling af nyttige fysiologiske data, der karakteriserer såret. Endelig er vurderingen af den funktionelle sårheling via genoprettelse af hudens barrierefunktion baseret på TEWL kritisk. Afslutningsvis vises en robust, enkel, detaljeret og brugervenlig protokol til udvikling af en biofilminficeret alvorlig forbrændingsskade ved hjælp af et svinemodelsystem i dette arbejde.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, for deres støtte og dyrlægepleje af dyrene under undersøgelsen. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health tilskud NR015676, NR013898 og DK125835 og Department of Defense grant W81XWH-11-2-0142. Derudover nød dette arbejde godt af følgende National Institutes of Health-priser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 og NS42617.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26x30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4x4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Svinemodel Biofilminfektion sårkrønicitet værtsimmunsystem klinisk relevant præklinisk model in vivo in vitro ex vivo korttidsundersøgelse langtidsundersøgelse hudbarrierefunktion funktionel sårlukning usynlige sår metodologiske detaljer alvorlig brandskade translationel værdi P. aeruginosa (PA01) 8 ugers infektion
Svinemodel af biofilminfektion og usynlige sår
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Masry, M., Bhasme, P.,… More

El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter