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Immunology and Infection

बायोफिल्म संक्रमण और अदृश्य घावों का सूअर मॉडल

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65301
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery, Indiana University School of Medicine

Summary

पुराने घाव जो एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोधी हैं, स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक बड़ा खतरा हैं। बायोफिल्म संक्रमण जिद्दी और शत्रुतापूर्ण हैं और कार्यात्मक घाव बंद होने की कमी का कारण बन सकते हैं। हम बायोफिल्म-संक्रमित पूर्ण-मोटाई वाले पुराने घावों के नैदानिक रूप से प्रासंगिक सूअर मॉडल की रिपोर्ट करते हैं। यह मॉडल यंत्रवत अध्ययन के साथ-साथ परीक्षण हस्तक्षेपों के लिए शक्तिशाली है।

Abstract

घाव की जीर्णता में बायोफिल्म संक्रमण का प्रमुख योगदान है। नैदानिक रूप से प्रासंगिक प्रयोगात्मक घाव बायोफिल्म संक्रमण की स्थापना के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी की आवश्यकता होती है। इस तरह के नैदानिक रूप से प्रासंगिक बायोफिल्म के गठन के दौरान मेजबान और रोगज़नक़ में पुनरावृत्त परिवर्तन केवल विवो में हो सकते हैं। स्वाइन घाव मॉडल को एक शक्तिशाली पूर्व-नैदानिक मॉडल के रूप में इसके फायदे के लिए पहचाना जाता है। घाव बायोफिल्म का अध्ययन करने के लिए कई रिपोर्ट किए गए दृष्टिकोण हैं। इन विट्रो और पूर्व विवो सिस्टम में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संदर्भ में कमी है। विवो अध्ययनों में अल्पकालिक में तीव्र प्रतिक्रियाएं शामिल होती हैं और इस प्रकार, बायोफिल्म परिपक्वता की अनुमति नहीं देते हैं, जैसा कि चिकित्सकीय रूप से होने के लिए जाना जाता है। पहला दीर्घकालिक स्वाइन घाव बायोफिल्म अध्ययन 2014 में रिपोर्ट किया गया था। अध्ययन ने माना कि बायोफिल्म संक्रमित घाव प्लैनिमेट्री द्वारा निर्धारित के रूप में बंद हो सकते हैं, लेकिन प्रभावित साइट की त्वचा बाधा कार्य बहाल करने में विफल हो सकती है। बाद में, इस अवलोकन को चिकित्सकीय रूप से मान्य किया गया था। कार्यात्मक घाव बंद करने की अवधारणा इस प्रकार पैदा हुई थी। घाव बंद लेकिन त्वचा बाधा समारोह में कमी अदृश्य घावों के रूप में देखा जा सकता है। इस काम में, हम बायोफिल्म-संक्रमित गंभीर जलने की चोट के दीर्घकालिक सूअर मॉडल को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक पद्धतिगत विवरणों की रिपोर्ट करना चाहते हैं, जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है और इसका अनुवाद मूल्य है। इस प्रोटोकॉल एक की स्थापना पर विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करता है 8 सप्ताह घाव biofilm संक्रमण का उपयोग कर पी. aeruginosa (PA01). आठ पूर्ण-मोटाई जलने वाले घावों को घरेलू सफेद सूअरों के पृष्ठीय पर सममित रूप से बनाया गया था, जिन्हें दिन 3 के बाद जलने पर (PA01) के साथ टीका लगाया गया था; इसके बाद, घाव भरने के गैर-आक्रामक आकलन लेजर स्पेकल इमेजिंग (LSI), उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासाउंड (HUSD), और ट्रांसएपिडर्मल पानी के नुकसान (TEWL) का उपयोग करके अलग-अलग समय बिंदुओं पर आयोजित किए गए थे। टीका लगाए गए जले हुए घावों को चार-परत ड्रेसिंग के साथ कवर किया गया था। बायोफिल्म्स, जैसा कि एसईएम द्वारा 7 दिन के बाद टीकाकरण में संरचनात्मक रूप से स्थापित और पुष्टि की गई थी, ने कार्यात्मक घाव बंद होने से समझौता किया। इस तरह के प्रतिकूल परिणाम उचित हस्तक्षेपों के जवाब में उलट के अधीन है।

Introduction

बायोफिल्म संक्रमण जलने और पुराने घावों को जटिल बनाता है और जीर्णता 1,2,3,4,5 का कारण बनता है। सूक्ष्म जीव विज्ञान में, बायोफिल्म तंत्र का मुख्य रूप से अध्ययन किया जाता है, जिसमें रोगाणुओं 1,6 पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। इन अध्ययनों से सीखा सबक एक जैविक विज्ञान के दृष्टिकोण से सर्वोपरि महत्व के हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि चिकित्सकीय प्रासंगिक रोगजनक biofilms 6,7,8 के लिए लागू किया जा सकता है. नैदानिक प्रासंगिक बायोफिल्म संरचनात्मक समुच्चय माइक्रोबियल के साथ ही मेजबान कारकों 8,9,10 शामिल होना चाहिए. इस तरह के एक microenvironment मेजबान microbe पुनरावृत्त बातचीत, जो एक चिकित्सकीय प्रासंगिक biofilm 7,8 विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं को शामिल करने के लिए अनुमति देता है. ऐसी प्रक्रिया में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और रक्त जनित कारकों की भागीदारी महत्वपूर्ण11,12 है. नैदानिक रोगजनक बायोफिल्म अंतर्निहित मेजबान-सूक्ष्म जीव बातचीत, जैसा कि पुराने घावों में देखा जाता है, लंबे समय तक होता है। इस प्रकार, बायोफिल्म संक्रमण के अनुवाद संबंधी प्रासंगिक मॉडल को विकसित करने के उद्देश्य से किसी भी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को इन कारकों के लिए जिम्मेदार होना चाहिए। इसलिए, हमने एक नैदानिक रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सूअर क्रोनिक बायोफिल्म संक्रमण मॉडल विकसित करने की मांग की।

जबकि मानव अध्ययन स्पष्ट रूप से उपचार परिणामों का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, अक्सर वे अंतर्निहित तंत्र और नए यंत्रवत प्रतिमानों को संबोधित करने के लिए सबसे उपयुक्त नहीं होते हैं। नैतिक चिंताएं अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक पुराने घाव से कई बायोप्सी के संग्रह की आवश्यकता वाले अध्ययन डिजाइनों के उपयोग को सीमित करती हैं। इसलिए, बायोफिल्म भाग्य 7,13 की पूरी तरह से परीक्षा के लिए आक्रामक अध्ययन को सक्षम करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पशु मॉडल होना महत्वपूर्ण है। एक पशु मॉडल का चयन कई कारकों पर निर्भर करता है, जिसमें वैज्ञानिक / अनुवाद संबंधी प्रासंगिकता और रसद शामिल हैं। पोर्सिन प्रणाली को व्यापक रूप से मानव त्वचा के घावों का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल मानाजाता है। इस प्रकार, यह काम बायोफिल्म-संक्रमित पूर्ण-मोटाई जलने की चोट के एक स्थापित सूअर मॉडल की रिपोर्ट करता है। यह काम साहित्य 2,7,13,14,15,16,17 में रिपोर्ट किए गए कई मूल प्रकाशनों पर आधारित है। इस अध्ययन में, घाव को संक्रमित करने के लिए मल्टीड्रग-प्रतिरोधी स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (PA01) का एक नैदानिक पृथक चुना गया था। एरुगिनोसा घावसंक्रमण 2,18,19,20 का एक सामान्य कारण है। यह एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु है कि कुछ एंटीबायोटिक दवाओं11,19,21 के लिए अपने प्रतिरोध के कारण इलाज के लिए मुश्किल हो सकता है. अब तक रिपोर्ट किए गए स्वाइन बायोफिल्म मॉडल में से कोई भी 8 सप्ताह के दीर्घकालिक अध्ययन 22,23,24,25,26 शामिल नहीं है। क्रोनिक घाव वे हैं जो 4 सप्ताह या उससे अधिक 14,27,28 के लिए खुले रहते हैं। साहित्य में कोई अन्य पुराने घाव बायोफिल्म मॉडल की सूचना नहीं है। यह कार्य कार्यात्मक घाव बंद होने की धारणा को संबोधित करताहै 2,7,13,15,17,29.

Protocol

सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) #21147 द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे। अध्ययन इंडियाना विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु संसाधन केंद्र (एलएआरसी) में आयोजित किया गया था। हमने इस प्रोटोकॉल में एक मादा घरेलू सफेद सुअर (70-80 पौंड) का इस्तेमाल किया।

1. पशु अनुकूलन

  1. सुविधा के लिए सूअरों के आगमन पर, जानवरों को व्यक्तिगत रूप से एक ही कमरे में कम से कम 3 दिनों के लिए अनुकूलन और सामाजिक संपर्क के लिए रखें।
  2. सूअरों को एक अच्छी तरह से संतुलित आहार खिलाएं। वजन के आधार पर खिलाई गई राशि तय करें, और निर्माता से सिफारिशों का पालन करें।
  3. सुनिश्चित करें कि पशु के लिए उपवास किया जाता है 6-12 मतली को रोकने के लिए प्रक्रिया से पहले घंटे, उल्टी, और पेट तरल पदार्थ की आकांक्षा जबकि संज्ञाहरण के तहत.

2. सर्जरी कक्ष सेटअप

  1. एनेस्थीसिया मशीन तैयार करें, और सुनिश्चित करें कि यह रिब्रीदिंग सर्किट के साथ तैयार है।
  2. सर्जरी के लिए कमरे की व्यवस्था, के रूप में नीचे वर्णित (चित्रा 1 ए).
    1. एक बाँझ पर्दे के साथ प्रक्रिया तालिका को कवर करें, और थर्मोरेग्यूलेशन में सहायता के लिए नीचे एक परिसंचारी पानी का कंबल रखें।
    2. प्रेरण आपूर्ति और सर्जरी तैयारी सामग्री के साथ एक तालिका सेट करें। बर्नर उपकरणों और नियंत्रण बक्से के साथ एक तालिका सेट करें। इमेजिंग उपकरण सेट करें, और सुनिश्चित करें कि यह चालू है।

3. सुअर का बेहोश करना

  1. 1 एमएल/50 एलबी की खुराक पर टीकेएक्स (टेलाज़ोल 4.4 मिलीग्राम/किग्रा; केटामाइन 2.2 मिलीग्राम/किग्रा; ज़ाइलाज़ीन 2.2 मिलीग्राम/किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ सुअर को बेहोश करें। एक मुखौटा के माध्यम से वितरित 1% -3% isoflurane पर प्रक्रिया कक्ष में सुअर को बनाए रखें।
  2. IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार सूअरों को (प्री-ऑपरेटिव) एनाल्जेसिक का प्रशासन करें; कुछ उदाहरण इस प्रकार हैं: ब्यूप्रेनोर्फिन 0.3 मिलीग्राम / एमएल, 0.01-0.05 मिलीग्राम / किग्रा आईएम; कारप्रोफेन 50 मिलीग्राम / एमएल, 4 मिलीग्राम / किग्रा आईएम या एसक्यू; Fentanyl ट्रांसडर्मल 100 mcg/h कान के पिन्ना पर रखा जाता है; गैबापेंटिन 300 मिलीग्राम कैप्सूल, 3-10 मिलीग्राम /
    नोट: सभी बर्न और बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए, सर्जरी से एक दिन पहले गैबापेंटिन की 1 खुराक दी जाएगी और प्रक्रिया के दिन कार्प्रोफेन की 1 खुराक दी जाएगी। मुख्य जलने की प्रक्रिया के लिए, एक फेंटेनाइल पैच रखा जाएगा, और सर्जिकल तैयारी के दौरान ब्यूप्रेनोर्फिन की 1 पूरी खुराक दी जाएगी।

4. संज्ञाहरण का प्रेरण

  1. कम से कम तीन बार बारी-बारी से 2% क्लोरहेक्सिडिन स्क्रब और अल्कोहल के साथ कान को जीवाणुरहित करें। सीमांत कान नस में अंतःशिरा कैथेटर में एक 22-18 जी 1 डालें, और रक्त प्रवाह की पुष्टि करें। खारा के साथ कैथेटर फ्लश, और सर्जिकल टेप (चित्रा 1 बी) के साथ कैथेटर को ठीक करें।
  2. एक उचित आकार endotracheal ट्यूब के साथ सुअर इंटुबैट (7-9 मिमी) एक बार मांसपेशियों में छूट मास्क के माध्यम से संज्ञाहरण के साँस लेना द्वारा प्राप्त किया गया है. जबड़े की टोन के नुकसान और एक पैल्पेब्रल रिफ्लेक्स देखे जाने से मांसपेशियों में छूट की जांच करें।
    1. ट्यूब खोलें, और हवा की एक सिरिंज का उपयोग कफ रिसाव का परीक्षण. एक लैरींगोस्कोप30 की सहायता से ट्यूब डालें।
    2. कफ फुलाएं, और उचित प्लेसमेंट की पुष्टि होने के बाद ट्यूब को सुरक्षित करें। सुअर को रिब्रीदिंग सर्किट से कनेक्ट करें।
      नोट: ट्यूब को थूथन के ऊपर जगह में बांधा जाता है, और इसे सुरक्षित करने के लिए रोल धुंध का उपयोग किया जाता है। ट्यूब के उचित स्थान की पुष्टि करने के लिए छाती का ऑस्केल्टेशन स्टेथोस्कोप के साथ किया जाता है।
      नोट: संज्ञाहरण के दौरान, हवा पॉप-ऑफ वाल्व बंद करके और पुनराश्वास बैग को दबाने से हर 5-10 मिनट की आपूर्ति की जाती है जब तक कि दबाव मैनोमीटर स्थितीय एटेलेक्टैसिस को रोकने के लिए 20 मिमी /
  3. पशु और संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी.
    1. सुअर को एक बहु-पैरामीटर मॉनिटर से कनेक्ट करें। मॉनिटर लगातार ऑक्सीजन संतृप्ति (SpO 2), पल्स रेट, एंड ज्वारीय कार्बन डाइऑक्साइड (EtCO2), श्वसन दर और तापमान को पढ़ेगा। प्रक्रिया के दौरान हर 10 मिनट में महत्वपूर्ण रिकॉर्ड करें।
    2. घाव शुरू करने से पहले एक हिंद पैर पैर की अंगुली चुटकी के साथ दर्द सजगता का परीक्षण करके संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें।
      नोट: जब आवश्यक हो, अतिरिक्त संज्ञाहरण को प्रशासित करने के लिए संवेदनाहारी वेपोराइज़र को समायोजित करें, या कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। सर्जरी के दौरान नियमित रूप से दर्द सजगता और पैल्पेब्रल रिफ्लेक्सिस की जाँच करें।

5. जलने के घाव के लिए जानवरों की तैयारी

  1. एनेस्थीसिया मशीन से सुअर को डिस्कनेक्ट करें, और इसे प्रक्रिया तालिका में ले जाएं। सुअर को स्टर्नल रिकम्बेंसी स्थिति में रखें, और सभी जुड़ी लाइनों और ट्यूबों (चित्रा 1 सी) को सुरक्षित करना सुनिश्चित करें।
  2. सुअर को संज्ञाहरण मशीन से फिर से कनेक्ट करें, और प्रक्रिया के अंत तक O2 को 0.8-1.5 L/min और isoflurane को 1% -3% पर बनाए रखें।
  3. सुअर को 8-10 एमएल/किग्रा/घंटा की ड्रिप दर से IV तरल पदार्थ (LRS) दें। चरण 4.3 के रूप में संज्ञाहरण की निगरानी.

6. एंटीसेप्टिक तैयारी और त्वचा जला साइट के अंकन

  1. शेविंग और बालों को हटाने क्रीम लागू करके घाव क्षेत्र तैयार करें, जैसा कि नीचे वर्णित है (चित्र 2)।
    1. विद्युत कतरनी का उपयोग करके दोनों तरफ एक्सिला तक कशेरुक स्तंभ से लगभग 25 सेमी चौड़ाई के क्षेत्र में सुअर डोरसम को शेव करें।
    2. कटे हुए क्षेत्र में बालों को हटाने वाली क्रीम लागू करें, और 3-7 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें। साफ शोषक तौलिये का उपयोग करके बालों के साथ क्रीम निकालें।
  2. बर्न साइट की तैयारी
    1. लगभग 5 मिनट के लिए कम से कम तीन बार बारी-बारी से 2% क्लोरहेक्सिडिन स्क्रब और 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ घायल होने वाले क्षेत्र को साफ़ करें। सुनिश्चित करें कि बाँझ दस्ताने पहनने वाले कर्मियों द्वारा स्क्रब को बुल्सआई पैटर्न (केंद्र से शुरू करना और सर्पिल में बाहर की ओर बढ़ना) में लगाया जाता है।
    2. एक बाँझ जला टेम्पलेट और एक शल्य चिकित्सा त्वचा मार्कर(चित्रा 2बी)का उपयोग घाव साइटों निशान. पृष्ठीय पर सममित रूप से छह से आठ घावों (2 इंच x 2 इंच) को चिह्नित करें।
    3. संदूषण (चित्रा 2सी) को कम करने के लिए एक बाँझ कपड़ा के साथ चिह्नित साइटों के आसपास के क्षेत्रों को कवर.

7. जलने की प्रक्रिया

  1. एक बर्न डिवाइस का उपयोग करें, जैसे कि एक इन-हाउस-फैब्रिकेटेड कस्टम बर्नर जिसमें स्टेनलेस स्टील ब्लॉक में 2 इंच x 2 (वजन: 352 ग्राम) एक धातु स्टाइलस, एक इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्टेट और एक इलेक्ट्रॉनिक स्केल (कुल वजन: 1,714 ग्राम; चित्र 3)।
    1. बर्नर को वांछित तापमान पर सेट करें। 150 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3 ए) पर पूर्ण मोटाई घावों के लिए लक्ष्य तापमान समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, नियंत्रण इकाई पर सेट पॉइंट (एसपी) को 150 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें। कम सेटपॉइंट को 145 डिग्री सेल्सियस और उच्च सेटपॉइंट को 155 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1डी)पर सेट करें।
  2. जला डिवाइस से जुड़े गर्म स्टेनलेस स्टील ब्लॉक का उपयोग करके और उन्हें 60 एस (चित्रा 3 बी, सी) के लिए त्वचा पर रखकर एक्स 2 में 2 की पूर्ण मोटाई जला घाव बनाएं। बर्न के आवेदन के दौरान, बर्नर द्वारा समान दबाव लागू किया जा रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक पैमाने का उपयोग करें।

8. बर्न घाव मूल्यांकन और इमेजिंग

  1. डिजिटल फोटोग्राफी
    1. एक डीएसएलआर कैमरा और एक इलेक्ट्रो-फोकस शॉर्ट बैक फोकस (ईएफएस), 17-55 मिमी अल्ट्रासोनिक वाइड-एंगल लेंस और एक टॉर्च का उपयोग करके घावों की छवि।
    2. पूरे सुअर की एक डिजिटल तस्वीर लें, जिसमें सुअर की पहचान, टाइमपॉइंट और तारीख के साथ एक तख्ती शामिल है। फिर, प्रत्येक घाव के लिए अलग-अलग चित्र लें जिसमें सुअर आईडी, घाव आईडी और टाइमपॉइंट और एक शासक के साथ एक तख्ती दिखाई दे।
    3. 56 दिन तक संग्रह के प्रत्येक समयबिंदु पर मूल घाव के आकार के प्रतिशत के रूप में घाव क्षेत्र की गणना करें।
      नोट: इस काम में, घाव क्षेत्र की गणना प्रत्येक टाइमपॉइंट (d0, d7, d14, d28, और d56) पर d0 पर मूल घाव क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में की गई थी।
  2. लेजर धब्बेदार इमेजिंग (LSI)
    1. लेजर धब्बेदार इमेजिंग के लिए, वास्तविक समय में घाव microvascular छिड़काव छिड़काव का आकलन करने के लिए लेजर धब्बेदार विपरीत विश्लेषण (LASCA) प्रौद्योगिकी पर आधारित एक रक्त छिड़काव इमेजर का उपयोग करें.
    2. एक ही रिकॉर्डिंग में सभी घावों की तस्वीरें लें। लेजर कैमरे से घाव तक काम करने की दूरी के मापा मूल्य को समायोजित करें ताकि यह प्रत्येक घाव(चित्रा 4ए)की इमेजिंग के अनुरूप हो।
    3. 10-15 एस की अवधि में ली गई छवियों की एक श्रृंखला द्वारा छिड़काव रिकॉर्ड करें। घाव की छवि बनाने के बाद, रिकॉर्डिंग स्वचालित रूप से रुक जाती है, और कैमरे को बाद के घाव के लिए समायोजित करने के बाद रिकॉर्डिंग फिर से शुरू हो जाती है। हर बार जब रिकॉर्डिंग रुकती है, तो घाव की पहचान करने के लिए एक मार्कर जोड़ा जाता है।
  3. ट्रांसएपिडर्मल पानी की हानि (TEWL)
    1. एक मानक इकाई, एक टीईडब्ल्यूएल जांच, और सॉफ्टवेयर(चित्रा 4बी)का उपयोग कर प्रत्येक घाव के लिए टीईडब्ल्यूएल को मापें। प्रत्येक घाव के लिए, जांच टिप पर एक साफ जांच कवर रखें, जो घाव के ऊतकों के संपर्क में होगा।
    2. जांच को धीरे से और समान रूप से त्वचा पर रखें, और यूनिट पर स्टार्ट बटन दबाकर रीडिंग शुरू करें।
    3. प्रत्येक घाव को पांच बार मापें, पहले केंद्र में और फिर प्रत्येक कोने पर। फिर, सभी रीडिंग को स्प्रेडशीट (चित्रा 4बी) में निर्यात करें।
  4. हार्मोनिक अल्ट्रासाउंड (HUSD)
    1. सामान्य त्वचा से सुअर के पार्श्व पक्ष की ओर शुरू होने वाली मिडलाइन (कशेरुक स्तंभ) से अल्ट्रासाउंड (यूएस) जांच के साथ घाव को स्कैन करके एचयूएसडी मैपिंग करें जहां फिर से सामान्य त्वचा है। अल्ट्रासाउंड मशीन (चित्रा 4 सी) का उपयोग कर बी-मोड और ऊतक इलास्टोग्राफी मोड दोनों में प्रत्येक घाव के लिए इस स्कैनिंग पैटर्न का पालन करें।
      1. बी-मोड स्कैनिंग के लिए, घाव क्षेत्र में बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें, और एमएल -615 उच्च-रिज़ॉल्यूशन जांच पर कुछ लागू करें। घाव पहचान लेबल के साथ प्रत्येक रिकॉर्डिंग एनोटेट करें। रिकॉर्डिंग शुरू करें, और जांच को धीरे-धीरे मिडलाइन से घाव के नीचे ले जाएं जब तक कि दूसरी तरफ की सामान्य त्वचा तक न पहुंच जाए।
        नोट: स्कैनिंग खत्म करने के बाद, रिकॉर्डिंग को विश्लेषण के लिए मशीन से सहेजा और निर्यात किया जाता है।
      2. इलास्टोग्राफी के लिए, एलास्टो बटन दबाकर अल्ट्रासाउंड मशीन को इलास्टो मोड पर स्विच करें। घाव को फिर से उसी तरह से स्कैन करें जैसे बी-मोड स्कैनिंग में, यह सुनिश्चित करना कि जांच का एक समान दबाव बनाए रखा जाता है ताकि इलास्टोग्राफी कलर इंडिकेटर (हरी सलाखों) को रिकॉर्डिंग के दौरान दिखाई देने की अनुमति मिल सके।
        नोट: उचित दबाव रिकॉर्डिंग पर स्केल बार द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जो सही संपर्क किए जाने पर हरा दिखाई देता है (चित्रा 4 डी)।
      3. प्रत्येक घाव को बी-मोड और इलास्टो मोड (प्रति घाव दो रिकॉर्डिंग) दोनों में इमेज करने के बाद एनोटेशन बदलें। अगले घाव के लिए जानकारी शामिल करने के लिए सॉफ्टवेयर में टिप्पणी बदलें, और बाद के घावों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।

9. पट्टी और ड्रेसिंग

  1. पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग या परीक्षण ड्रेसिंग (चित्रा 5 ए, बी) के साथ व्यक्तिगत रूप से जले हुए घावों को कवर करें। पूरे घाव क्षेत्र (चित्रा 5 सी) पर एक बड़ा पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग रखें।
  2. घावों से आने वाले किसी भी तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए सुअर के पूरे ट्रंक के चारों ओर रोल धुंध की एक दूसरी परत लागू करें। सुअर के चारों ओर पट्टी सामग्री लपेटने के लिए सुअर को उसकी तरफ से थोड़ा पीछे रोल करें।
  3. लचीली लोचदार पट्टी (चित्रा 5 डी) की एक परत के साथ धुंध को ढीला कवर। सुनिश्चित करें कि पट्टी बहुत तंग नहीं है, क्योंकि इसे बहुत कसकर लागू करने से श्वास प्रतिबंधित हो सकता है और पेट पर दबाव पड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप रेक्टल प्रोलैप्स या अन्य जटिलताएं हो सकती हैं।
    नोट: लोचदार पट्टी खिंचाव है और आवेदन के दौरान आसानी से ओवरटाइट किया जा सकता है। इसे रोल से खींचकर और इसे पिछले रैप के किनारे पर बिछाने की अनुमति देने से ओवरटाइटनिंग को रोकने में मदद मिल सकती है।
  4. लोचदार टेप (चित्रा 4E) में 4 की एक अंतिम परत के साथ लोचदार पट्टी को कवर. फिर से, सुनिश्चित करें कि आवेदन बहुत तंग नहीं है, लेकिन सुनिश्चित करें कि ड्रेसिंग ऊपर और नीचे किनारे पर सुरक्षित है ताकि इसे नीचे फिसलने से रोका जा सके क्योंकि सुअर प्रक्रिया के बाद घूमता है।

10. पशु वसूली और पश्चात की देखभाल

  1. वसूली
    1. घाव, इमेजिंग प्रक्रिया और पट्टी के पूरा होने पर संवेदनाहारी गैस को बंद कर दें। सुअर को कम से कम 5 मिनट के लिए ऑक्सीजन पर रहने दें।
    2. प्राथमिक बाड़े में लौटने के बाद, परिवहन/लिफ्ट टेबल से पिंजरे में फोम रिकवरी मैट तक सुअर को स्थानांतरित करें। स्वचालित वॉटरर उठाएं, और वसूली के दौरान सुअर को चोट से बचाने के लिए जे-फीडर को हटा दें।
    3. हाइपोथर्मिया मौजूद होने पर सुअर को कंबल (गर्म हवा के कंबल सहित) से ढक दें। हर 10-15 मिनट में तापमान, नाड़ी, श्वसन दर और SpO2 सहित महत्वपूर्ण अंगों की निगरानी और रिकॉर्ड करें।
    4. सुअर की लगातार निगरानी करें जब तक कि वह स्वतंत्र रूप से स्टर्नल रिकम्बेंसी को बनाए रखने में सक्षम न हो जाए। एक बार जब सुअर पूरी तरह से ठीक हो जाता है, तो निप्पल वॉटरर को कम करें, और फिर सुअर को भी खिलाया जा सकता है।
  2. दर्द का आकलन
    1. एक संशोधित ग्लासगो दर्द स्कोरिंग फॉर्म का उपयोग करके पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द मूल्यांकन करें। सुनिश्चित करें कि दर्द का आकलन प्रयोगशाला या एलएआरसी कर्मचारियों द्वारा कम से कम हर 12 घंटे में पहले 3-4 दिनों के बाद पूरा किया जाता है। दर्द स्कोरिंग की आवृत्ति उपस्थित पशुचिकित्सा द्वारा निर्धारित की जाती है। यदि जानवर 5 से ऊपर स्कोर करता है, तो बचाव एनाल्जेसिया (ब्यूप्रेनोर्फिन या हाइड्रोमोर्फोन) का प्रशासन करें।
    2. ब्यूप्रेनोर्फिन 0.01-0.05 मिलीग्राम/किग्रा आईएम पूर्व-प्रक्रिया की एक खुराक का प्रशासन करके एनाल्जेसिया प्रदान करें, दूसरी खुराक 8-12 घंटे बाद दी गई।
    3. जलने से पहले कान के पिन्ना पर एक फेंटेनाइल पैच (100 एमसीजी /
    4. कार्प्रोफेन 4 मिलीग्राम / किग्रा आईएम या एसक्यू प्री-प्रक्रिया इंजेक्ट करें, और फिर 2 दिनों के लिए दैनिक आईएम, एसक्यू, या पीओ या एलएआरसी पशुचिकित्सा द्वारा निर्देशित के रूप में।
    5. गैबापेंटिन 3-10 मिलीग्राम / किग्रा मौखिक रूप से दें, प्रक्रिया से एक दिन पहले एक खुराक दी जा रही है, प्रक्रिया की सुबह, प्रक्रिया के बाद शाम, और फिर 3-5 दिनों के लिए हर 12 घंटे।
  3. आहार
    1. सुनिश्चित करें कि सूअरों को बरामद किया गया है, और फिर प्रतिदिन दो बार उनके वजन-आधारित राशन के अनुसार पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच की अनुमति दें।
    2. खाद्य संवर्धन (ताजे फल और सब्जियां, जमे हुए फल, मार्शमॉलो, दही, हलवा, आदि) प्रदान करें, और कम भूख देखी जाने पर खाने को लुभाने के लिए इनका उपयोग करें।
  4. ड्रेसिंग परिवर्तन
    1. पट्टियों को कम से कम एक बार साप्ताहिक या अधिक बार बदलें यदि पट्टियाँ गंदी हो जाती हैं या उपचार रणनीतियों को समायोजित करने के लिए।
    2. संज्ञाहरण के तहत अभी भी इमेजिंग के बाद पट्टियाँ बदलें, या ड्रेसिंग परिवर्तन के लिए केवल TKX के साथ सुअर को बेहोश करें।
    3. पट्टी को बदलने के लिए, लिस्टर बैंडेज कैंची या आघात कैंची का उपयोग करके गंदी पट्टी को सावधानीपूर्वक हटाकर शुरू करें, ड्रेसिंग के बाहर घावों के संपर्क में न आने देने के लिए सावधान रहें।
    4. यदि आवश्यक हो तो घावों के आसपास के क्षेत्र को साफ धुंध पर 0.9% NaCl का उपयोग करें, और क्षेत्र को धीरे से सुखाएं। धारा 9 में उल्लिखित बैंडिंग के लिए प्रक्रिया चरणों का पालन करें।
      नोट: यदि प्रयोगात्मक ड्रेसिंग लागू की जा रही है, तो इन्हें पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ घावों को कवर करने से पहले लागू किया जा सकता है।
  5. इमेजिंग आवृत्ति
    1. पूरे अध्ययन में विभिन्न समय बिंदुओं पर इमेजिंग (डिजिटल फोटो, LSI, TEWL, और HUSD) प्राप्त करें। दिन -3 (जला घाव), दिन 0 (टीकाकरण), और 7 दिन, दिन 14, दिन 28, दिन 35, और दिन 56 के बाद टीकाकरण पर इमेजिंग डेटा एकत्र करें।

11. बायोफिल्म तैयारी और टीकाकरण

  1. इनोकुलम की तैयारी
    1. जीवाणु की शुद्ध संस्कृति के लिए Pseudomonas aeruginosa (PA01) के ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक से एक स्टार्टर प्लेट तैयार करें। कम नमक Luria−Bertani अगर (एलबीए) में एक पी aeruginosa संस्कृति बढ़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस रात भर में सेते हैं.
    2. अगले दिन एक एकल पी aeruginosa कॉलोनी के साथ कम नमक Luria-Bertani शोरबा (LBB) के 5 एमएल Inoculate, और 200 rpm पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
    3. लॉग चरण कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, एलबीबी के 5 एमएल में रातोंरात संस्कृति के 200 माइक्रोन को टीका लगाएं, और 2.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर शेकर में इनक्यूबेट करें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। बाँझ एलबीबी के 900 माइक्रोन में संस्कृति से 100 माइक्रोन का उपयोग करके 1 एक्स 10−9 तक धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें।
      नोट: हमने undiluted नमूनों के साथ शुरू किया और 1 x 10 7 CFU/mL.We ने 1 x 107 कमजोर पड़ने में गणनीय कॉलोनियों को प्राप्त किया, इसलिए हमने इस कमजोर पड़ने को समाप्त कमजोर पड़ने के रूप में माना।
    5. एलबीए पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोन फैलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रोटोकॉल के अनुसार, कॉलोनी गिनती के लिए गणनीय कालोनियों (30-300) दिखा कमजोर पड़ने का उपयोग करें, और कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) प्राप्त.
  2. घाव का टीकाकरण
    1. एलबी शोरबा के 5 एमएल में रातोंरात संस्कृति से 200 माइक्रोन टीका लगाएं, और 2.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर में सेते हैं।
    2. 600 एनएम (OD600) पर दिन संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें. PA01 इनोक्यूलेशनसाठी, 3 x 10 8 CFU/mL वापरा (250 μL of 1 x 108 CFU/mL PA01 प्रति घावला inoculated आहे). एक biohazard कंटेनर में पशु सुविधा के लिए inoculum परिवहन.
    3. एक विंदुक का उपयोग कर दिन 3 के बाद जला पर उजागर घावों की सतह भर में inoculum तितर-बितर, और समान रूप से एक डिस्पोजेबल स्प्रेडर (चित्रा 6) का उपयोग कर फैल गया. पट्टी बांधने से पहले लगभग 15 मिनट के लिए घावों को खुला रखें।
      नोट: सभी सर्जिकल प्रक्रियाएं, टीकाकरण, ऊतक बायोप्सी, इमेजिंग, और पट्टी सामान्य संज्ञाहरण के तहत वर्गों 3 और 4 में के रूप में किया जाता है।
  3. संक्रमण की स्थापना की पुष्टि
    नोट: यह पुष्टि करने के लिए कि टीकाकरण के बाद घाव सफलतापूर्वक संक्रमित हो गए हैं, कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जाता है, और घाव के नमूनों की तुलना सामान्य त्वचा से एकत्र किए गए नमूनों से की जाती है; नीचे कुछ उदाहरण दिए गए हैं।
    1. अलग-अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए नमूनों के पैथोलॉजी-आधारित विश्लेषण के लिए, संक्रमण का अनुमान लगाने के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती का उपयोग करें (सीएफयू; चित्रा 7ई, एफ)।
      1. पंच बायोप्सी द्वारा घाव के ऊतकों के 6 मिमी लीजिए. लेबल और खाली 5 एमएल दौर नीचे ट्यूबों वजन. नमूनों को ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और नमूनों के साथ ट्यूबों का वजन करें।
      2. एक बाँझ सतह पर एक स्केलपेल के साथ ऊतक पासा. BSL2 हुड में सभी चरणों का पालन करें।
        नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतकों को आसानी से समरूप बनाया गया है, आकार बहुत छोटा होना चाहिए (लेकिन 0.5 मिमी से कम नहीं)
      3. ट्यूब में नमूना रखो, और पीबीएस के 1mL जोड़ें. एक कठिन ऊतक पीसने की जांच का उपयोग करके ऊतक को मिलाएं और पीस लें।
      4. क्रमिक रूप से पतला (1 x 10−5 तक undiluted) homogenate, और चयनात्मक (Pseudomonas अलगाव अगर, PIA) और nonselective (LBA) मीडिया में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 μL।
      5. 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक शर्तों के तहत सभी कमजोर पड़ने सेते हैं। उचित प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के साथ प्लेटों की छवि बनाएं।
      6. 30-300 कालोनियों के साथ प्लेटों का चयन करें, अगर प्लेटों में से कोई भी उस एकाग्रता तक नहीं पहुंच गया है, undiluted थाली का उपयोग करें. कॉलोनी संख्या गिनती करने के लिए ImageJ का प्रयोग करें, और अंतिम कमजोर पड़ने कारक से औसत मूल्य गुणा करके प्लेट प्रति CFU की गणना.
    2. बैक्टीरियल बायोफिल्म्स(चित्रा 7जी)की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके दिन 7 पोस्ट-टीकाकरण और अन्य टाइमपॉइंट्स से एकत्र किए गए नमूनों से छवियों को प्राप्त करें।
      नोट: दिन 7 पोस्ट-इनोक्यूलेशन का चयन किया गया था क्योंकि यह बायोफिल्म संक्रमण की स्थापना का दिन है और बर्न एस्चर सॉफ्टनिंग की शुरुआत है, जो अमेरिकी तरंगों के प्रवेश की अनुमति देता है और इस प्रकार, गहरे ऊतकों का दृश्य। चित्रा 4 में, दिन 3 यूएस बर्न घाव छवि की जांच करें, जो मोटी चमड़े के एस्चर को दिखाती है जो अमेरिकी तरंगों को गहरे ऊतकों से गुजरने से रोकती है।
    3. विशिष्ट बैक्टीरिया की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पी. aeruginosa के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ घाव बायोप्सी के वर्गों दाग, के रूप में एक पिछले प्रकाशन13 (चित्रा 7H) में दिखाया गया है.
    4. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) का प्रदर्शन करें, जैसा कि सिन्हा एट अल 31 में प्रकाशित हुआ है। संक्रमित घावों से बैक्टीरिया 16srRNA की मात्रा निर्धारित करें और अध्ययन के अंत तक 7 के बाद टीकाकरण के बाद दिन से शुरू होने वाले अलग-अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए सामान्य असंक्रमित त्वचा के नमूने।

12. बायोप्सी संग्रह

  1. दिन 7, दिन 14, दिन 28, और दिन 56 के बाद टीकाकरण पर इमेजिंग के बाद विश्लेषण के लिए ऊतक बायोप्सी लीजिए। उपचार प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए केवल एक बार प्रत्येक घाव से बायोप्सी एकत्र करें।
    नोट: सभी सर्जिकल प्रक्रियाएं, टीकाकरण, ऊतक बायोप्सी, इमेजिंग, और पट्टी सामान्य संज्ञाहरण के तहत वर्गों 3 और 4 में के रूप में किया जाता है।
    1. 0.5% bupivacaine के साथ घाव के आसपास के क्षेत्र में घुसपैठ। घाव के एक किनारे से दूसरे तक 3-4 मिमी चौड़ी पट्टी काटें, दोनों पक्षों में सामान्य त्वचा के छोटे मार्जिन रखते हुए, आकार 10 ब्लेड के साथ एक डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग करें। निर्धारण के लिए 4% बफर फॉर्मेलिन से भरा एक लेबल शंक्वाकार ट्यूब में पट्टी रखें.
      नोट: प्रारंभिक टाइमपॉइंट इमेजिंग और बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए, सर्जिकल तैयारी के दौरान ब्यूप्रेनोर्फिन की एक पूरी खुराक दी जाएगी। देर से टाइमपॉइंट बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए, सर्जिकल तैयारी के दौरान ब्यूप्रेनोर्फिन की आधी खुराक दी जाएगी। सभी बर्न और बायोप्सी प्रक्रियाओं के बाद, गैबापेंटिन को उपस्थित पशुचिकित्सा द्वारा सलाह के अनुसार 7 दिनों तक बीआईडी दिया जाएगा। कार्प्रोफेन दिनों के बाद या उपस्थित पशुचिकित्सा द्वारा सलाह के अनुसार दिया जाएगा।
    2. घाव से 6 मिमी पंच बायोप्सी काटें (या तो घाव बिस्तर या घाव के किनारे से)। घाव के किनारे से लीजिए, सामान्य त्वचा और घाव बिस्तर के हिस्से सहित, विश्लेषण के विभिन्न प्रकार के लिए.
    3. निष्फल संदंश और विदारक कैंची का उपयोग कर नमूना निकालें. प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए उपयुक्त ट्यूब या कैसेट में बायोप्सी नमूना रखें।
    4. सीएफयू, एसईएम, आरएनए, और एफपीपीई के लिए, एक उपयुक्त बफर के साथ ट्यूबों में नमूनों को संरक्षित करें। उदाहरण के लिए, नमूनों लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी (एलसीएम) और immunohistochemistry (आईएचसी) के लिए कैसेट में OCT में रखा जा सकता है.
    5. नमूने धीरे एक बाँझ धुंध के साथ घाव दबाने से एकत्र कर रहे हैं के बाद हेमोस्टेसिस प्राप्त करें. गैर-पक्षपाती ड्रेसिंग, और पट्टी के साथ घाव को कवर करें जैसा कि धारा 9 में है।

13. इच्छामृत्यु और ऊतक संग्रह

  1. टीकेएक्स के साथ इच्छामृत्यु के दिन सुअर को बेहोश करें, और आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी करें। खंड 3 में उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए सीमांत कान नस में एक अंतःशिरा कैथेटर रखें। धारा 4 में दिए गए चरणों का पालन करते हुए सुअर को इंटुबेट करें।
  2. सुअर को संवेदनाहारी करने के बाद पट्टी को हटा दें, और घावों के आसपास के क्षेत्र को साफ करें।
  3. पूर्ण डिजिटल फोटोग्राफी, LSI, TEWL, और HUSD इमेजिंग। धारा 12 में उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए घावों और सामान्य त्वचा से नमूने एकत्र करें।
  4. एक बार सभी आवश्यक नमूने एकत्र हो जाने के बाद, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इच्छामृत्यु समाधान (सोडियम पेंटोबार्बिटल) के अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से संज्ञाहरण के तहत सुअर को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें। दिल की धड़कन और सहज श्वसन की समाप्ति की पुष्टि करने के लिए गुदाभ्रंश के लिए स्टेथोस्कोप का उपयोग करें।
  5. इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि करें, जैसा कि एसओएम आईएसीयूसी द्वारा आवश्यक है, न्यूमोथोरैक्स को प्रेरित करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करके। सुअर के शव को एक बैरल में स्थानांतरित करें, और भस्मीकरण के लिए उठाए जाने वाले फ्रीजर में परिवहन करें।

Representative Results

एक मानकीकृत जला डिवाइस एरिथेमा और सूजन (चित्रा 3 और चित्रा 7) की एक समान मार्जिन के साथ एक समरूप गहरी जला में जिसके परिणामस्वरूप 1 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण मोटाई जला घावों बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रत्येक सुअर को उनकी पीठ पर आठ पूर्ण-मोटाई वाले जलने के घाव मिले, जैसा कि चित्र 3C में दर्शाया गया है।

बी-मोड उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासाउंड द्वारा जलने के घावों के गैर-इनवेसिव वास्तविक समय के मूल्यांकन ने घाव की गहराई और समय के साथ घाव भरने की प्रगति की पुष्टि करने के लिए चमड़े के नीचे की वसा(चित्रा 4)तक सभी त्वचा परतों के विनाश को दिखाया। लेजर धब्बेदार इमेजिंग (एलएसआई) घाव छिड़काव (चित्रा 4 ए) के आगे लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया था.

जलने के घावों ने दिन 7 के बाद टीकाकरण द्वारा घाव की सतह पर एक मोटी पाइोजेनिक झिल्ली दिखाई, इस प्रकार संक्रमण और जला घाव बायोफिल्म (चित्रा 7ए)की स्थापना की पुष्टि की। डिजिटल प्लैनिमेट्री ने घाव स्थल और मार्जिन (चित्रा 7ए, बी) पर भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण पीएओ 1 के साथ टीकाकरण के बाद 3 दिन में एक बढ़ा हुआ घाव क्षेत्र दिखाया। हालांकि घाव क्षेत्र दिन 14 के बाद टीकाकरण से हटना शुरू हो गया, मूल घाव के आकार के लगभग 25% तक अपूर्ण उपचार 56 दिन में देखा गया, जो घावों की जीर्णता का संकेत देता है (चित्र 7बी)। घाव की जीर्णता और बिगड़ा हुआ घाव भरने की पुष्टि टीईडब्ल्यूएल द्वारा की गई, जिसमें उच्च ट्रांसएपिडर्मल पानी का नुकसान दिखाया गया। टीईडब्ल्यूएल के परिणामों ने सभी मापा टाइमपॉइंट्स पर सामान्य त्वचा की तुलना में त्वचा बाधा समारोह के नुकसान को प्रतिबिंबित किया, इस प्रकार जलने के घाव भरने (चित्रा 7बी) की कार्यात्मक हानि का संकेत दिया। यह तंग जंक्शन प्रोटीन ZO-1 और 213 के दमन और त्वचा बाधा समारोह की बहाली की हानि से भी पुष्टि की गई थी, जैसा कि दृश्य घाव बंद होने के बावजूद दिन 35 (मध्य) और दिन 56 (देर से) में देखे गए उच्च TEWL मूल्यों में परिलक्षित होता है।

जला गहराई आगे एच द्वारा मान्य किया गया था&ई धुंधला, जो सभी हिस्टोलॉजिकल त्वचा परतों के विरूपण और परिगलन से पता चला, के रूप में चित्रा 7 सी में दिखाया गया है. पीए01 की स्थापित बायोफिल्म को सीएफयू (चित्रा 7ई, एफ), एसईएम इमेजिंग (चित्रा 7 जी), और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चित्रा 7एच) द्वारा 7 दिन के बाद टीकाकरण में मान्य किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया के लिए सेटअप । (ए) सर्जिकल टेबल तैयार करना। (बी) IV तरल पदार्थ और दवा प्रशासन के लिए कान की नस cannulation। (सी) प्रक्रिया के दौरान सुअर को हाइपोथर्मिया से बचाने के लिए थर्मल कंबल कवर। (डी) बर्नर और टाइमर सेटअप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सर्जिकल साइट नसबंदी और अंकन । (ए) बाल कतरन और नसबंदी। (बी) एक बाँझ आठ-घाव मानक टेम्पलेट का उपयोग करके जला साइट का अंकन (प्रत्येक घाव 2 में x 2 है)। (सी)एक बाँझ त्वचा मार्कर का उपयोग कर अंतिम अंकन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: घाव प्रेरण जलाओ । (ए, बी) एक दबाव नापने का यंत्र और स्वचालित नियंत्रक इकाई (2 इंच x 2 इंच) के साथ मानकीकृत बर्नर पूर्व-चिह्नित घाव साइट पर लागू होता है। (सी) पूरी पीठ आठ पूर्ण मोटाई जलने के घावों को दिखाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: noninvasive जला घाव इमेजिंग और मूल्यांकन. (ए) घाव के केंद्र में लेजर बीम संकेतक के उचित अभिविन्यास के साथ लेजर धब्बेदार इमेजिंग (एलएसआई) बाईं ओर की छवि में दिखाया गया है; दाईं ओर की छवि एलएसआई डिवाइस और वास्तविक समय त्वचा संवहनी छिड़काव मानचित्र दिखाती है। (बी) पांच अलग-अलग स्थानों पर घाव साइट पर ट्रांसएपिडर्मल पानी की हानि (टीईडब्ल्यूएल) जांच आवेदन (चार घाव कोनों और निचले-दाएं कोने की छवि में प्रदर्शित केंद्र) बाईं ओर की छवि में दिखाया गया है; दाईं ओर की छवि TEWL माप की एक प्रतिनिधि रीयल-टाइम कैप्चर की गई स्क्रीन है। (सी) एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 16 मेगाहर्ट्ज अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग करके जलने के घाव की हार्मोनिक अल्ट्रासाउंड स्कैनिंग बाईं ओर दिखाई गई है; दाईं ओर की छवि अल्ट्रासाउंड डिवाइस और रीयल-टाइम स्क्रीन रिकॉर्डिंग दिखाती है। (डी) संरचनात्मक (बी-मोड छवियों, ग्रेस्केल अल्ट्रासाउंड) और बायोमेकेनिकल (इलास्टोग्राफी, रंग अल्ट्रासाउंड) टीकाकरण के दिन और दिन 7 पोस्ट-टीकाकरण में जला घाव साइट की छवियां। घाव की गहराई पीले धराशायी रेखा द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: घाव ड्रेसिंग और पट्टी। (ए) प्रत्येक घाव के लिए अलग से पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग का अनुप्रयोग। (बी) सभी पृष्ठीय टीका जला घावों ड्रेसिंग की पहली परत के साथ कवर कर रहे हैं. (सी) पूरे घाव क्षेत्र पर एक बड़ा पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग रखा गया है। (डी) धुंध की दूसरी परत का आवेदन और सुअर के पूरे ट्रंक के चारों ओर खिंचाव लोचदार पट्टी की एक ढीली परत घावों से आने वाले किसी भी तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए। (ई) चिपकने वाली ड्रेसिंग में 4 की अंतिम परत के साथ पूरे घाव क्षेत्र को कवर करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: बैक्टीरियल टीकाकरण । (ए) दिन 3 पोस्ट-बर्न में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (PA01) टीकाकरण के लिए सेटअप। (बी)प्रत्येक घाव के लिए 500 माइक्रोन मात्रा का उपयोग करके एक विंदुक के साथ इनोकुलम का सामयिक अनुप्रयोग। (सी) इनोकुलम घाव की सतह पर समान रूप से एक बाँझ डिस्पोजेबल स्प्रेडर का उपयोग करके फैलाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: घाव भरने की प्रगति और बायोफिल्म पुष्टि । (ए) अध्ययन की समयरेखा पर घाव बंद होने की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 1 सेमी। (बी) घाव क्षेत्र की मात्रा और अध्ययन की समयरेखा पर टीईडब्ल्यूएल माप (एन = 6)। डेटा को एसडी के माध्य ± रूप में दर्शाया जाता है। एनएस सामान्य त्वचा के टीईडब्ल्यूएल मूल्य को संदर्भित करता है। (सी) योजनाबद्ध आरेख विभिन्न घाव बायोप्सी साइटों दिखा रहा है। डी। एच एंड ई अपने इसी मेसन के ट्राइक्रोम धुंधला हो जाना दिन 3 पोस्ट-बर्न और दिन 7 पोस्ट-इनोक्यूलेशन में सभी त्वचा परतों के विरूपण और परिगलन दिखा रहा है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (ई) गैर चयनात्मक अगर के प्रतिनिधि डिजिटल छवियों (Luria-Bertani अगर) और चयनात्मक अगर (Pseudomonas अलगाव अगर) बैक्टीरिया कालोनियों के साथ पोर्सिन घाव बिस्तर ऊतक से उगाया. चयनात्मक माध्यम केवल PA01 कालोनियों की सटीक गिनती को सक्षम बनाता है। (एफ) संसाधित दिन 7 पोस्ट-टीकाकरण घाव बायोप्सी से ली गई कॉलोनी गणना से एक नमूना कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) गणना दिखाई गई है। (जी) प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) दिन 7 पोस्ट-टीकाकरण में टीका जला घावों की छवियों स्थापित PA01 बायोफिल्म दिखा रही है, दाईं ओर ज़ूम-इन छवि के साथ. स्केल बार = 1 माइक्रोन। लाल तीर के निशान बाह्य कोशिकीय बहुलक पदार्थों (ईपीएस) की ओर इशारा करते हैं। (एच) पी. जला घावों पर aeruginosa विरोधी Pseudomonas (हरा) एंटीबॉडी का उपयोग कर कल्पना की गई; दिन की immunofluorescence छवियों 7 पोस्ट-टीका घाव बायोप्सी द्वारा घाव के ऊतकों के भारी उपनिवेशण दिखाने पी. aeruginosa. स्केल बार = 100 माइक्रोन। (I) प्रतिनिधि मोज़ेक (स्केल बार = 200 माइक्रोन) और इसी ज़ूम-इन (स्केल बार = 50 माइक्रोन) दिन 35 और दिन 56 पोस्ट-इनोक्यूलेशन पर ZO-1- और ZO-2-दाग वाले वर्गों की छवियां, प्रेरित संक्रमण के बाद प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन। OCT-एम्बेडेड जमे हुए वर्गों (10 माइक्रोन) विरोधी ZO-1 (हरा) या विरोधी ZO-2 (हरा) का उपयोग कर दाग रहे थे. डीएपीआई का उपयोग करके वर्गों को प्रति-दाग दिया गया था। बार ग्राफ ZO-1 और ZO-2 सिग्नल तीव्रता की मात्रा का ठहराव प्रस्तुत करते हैं। डेटा एसडी (एन = 3) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; * पी < सहज लोगों की तुलना में 0.05। मान-व्हिटनी या क्रुस्कल-वालिस महत्व का परीक्षण करने के लिए विचरण परीक्षणों का एक तरफ़ा विश्लेषण किया गया था। चित्रा 7 एच, मैं रॉय एट अल.13 से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह रिपोर्ट प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए क्रोनिक घाव बायोफिल्म संक्रमण का एक सूअर मॉडल स्थापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है। कई स्वाइन बायोफिल्म मॉडल पहले 22,23,24,25,26 बताए गए हैं, लेकिन उनमें से कोई भी स्वाइन मॉडल नहीं है जिसमें 8 सप्ताह के दीर्घकालिक अध्ययन शामिल हैं। क्रोनिक घाव वे हैं जो 4 सप्ताह या उससे अधिक 14,27,28 के लिए खुले रहते हैं। साहित्य में कोई अन्य पुराने घाव बायोफिल्म मॉडल की सूचना नहीं है। यह कार्य कार्यात्मक घाव बंद होने की धारणा को संबोधित करताहै 2,7,13,15,17,29. 2014 में किए गए एक अध्ययन में सबसे पहले रिपोर्ट की गई थी कि बायोफिल्म संक्रमित घाव बाधा समारोह7 की बहाली के बिना बंद हो सकते हैं। ट्रांसएपिडर्मल पानी के नुकसान (टीईडब्ल्यूएल) का उपयोग करके घाव भरने में त्वचा बाधा समारोह का माप इस काम में बताया गया है।

शारीरिक और शारीरिक रूप से, पोर्सिन त्वचा, अन्य छोटे जानवरों की त्वचा की तुलना में, मानव त्वचा32,33,34के करीब है। सुअर और मानव त्वचा दोनों में मोटी एपिडर्मिस 33 होती है, और त्वचीय-एपिडर्मल मोटाई अनुपात सुअर में 10: 1 से13: 1 तक होता है, जो मनुष्यों के लिए 34,35 के बराबर है। हिस्टोलॉजिकल और बायोमैकेनिकली रूप से, मनुष्यों और सूअरों की त्वचा रीटे-लकीरें, सबडर्मल वसा, त्वचीय कोलेजन, बाल वितरण, एडनेक्सल संरचनाओं, और रक्त वाहिका आकार और वितरण36,37,38में समानताएं दिखाती है। कार्यात्मक रूप से, दोनों सूअरों और मनुष्यों लिपिड, प्रोटीन, और एपिडर्मल परत के केरातिन घटकों, साथ ही तुलनीय immunohistological पैटर्न37,38 की संरचना में समानताएं साझा करते हैं. पोर्सिन प्रतिरक्षा प्रणाली, अन्य छोटे जानवरों की तुलना में, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ उच्च समानताएं साझा करती है, जिसका अर्थ है कि सूअर मेजबान इंटरैक्शन पर अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल हैं जो घाव के संक्रमण39 में पैथोलॉजिकल बायोफिल्म की जटिलताओं के अभिन्न अंग हैं। विभिन्न पशु मॉडल द्वारा की पेशकश की पेशेवरों और विपक्ष के महत्वपूर्ण मूल्यांकन आम सहमति है कि सूअरों घाव भरने34,38 का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल का प्रतिनिधित्व करने के लिए नेतृत्व किया है. इसके अतिरिक्त, घरेलू सूअर अनायास पुराने जीवाणु संक्रमण विकसित करते हैं, जैसा कि मनुष्यों में देखागया है। घावों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला बर्न डिवाइस एक उन्नत और स्वचालित बर्न डिवाइस है जो लक्षित त्वचा साइट22,40 से पढ़े गए तापमान के आधार पर गर्मी ऊर्जा प्रदान करता है। इस तरह के दृष्टिकोण से जलने की चोट की कठोरता और प्रजनन क्षमता में सुधार होता है। सुअर के घावों को संक्रमित करने के लिए बैक्टीरिया के मानव नैदानिक आइसोलेट्स का उपयोग पूर्व-नैदानिक मॉडल के रूप में मूल्य जोड़ता है।

जला चोटों जटिल हैं और कई प्रणालीगत गड़बड़ी20,41 का कारण बनता है. इस प्रकार, पर्याप्त तरल पदार्थ के साथ सुअर को पुनर्जीवित करना और संज्ञाहरण और वसूली के दौरान हाइपोथर्मिया को रोकना महत्वपूर्ण है। कई कारक घाव भरने में हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसमें जलने के बाद का पोषण, तरल पदार्थ और दर्द42 शामिल हैं। इसलिए, पोषण और दर्द के आकलन की करीबी निगरानी महत्वपूर्ण है। जलने के बाद का दर्द गंभीर हो सकता है और जानवर के व्यवहार और आहार को प्रभावित कर सकता है। व्यवहार संबंधी चिंताओं को दूर करने के लिए हस्तक्षेप पर सक्रिय रूप से विचार किया जाना चाहिए। नियमित और निरंतर दर्द स्कोरिंग और प्रबंधन अनिवार्य है। एक बहुत विस्तृत दर्द प्रबंधन योजना के साथ एक पूरी तरह से दर्द मूल्यांकन शीट इस प्रोटोकॉल में शामिल है. घावों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक घाव पर ड्रेसिंग की पहली परत को अलग से लागू करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। सभी जैव-खतरनाक सामग्रियों को संभालने और उपकरण, उपकरण और पूरे सर्जिकल रूम के पूरी तरह से कीटाणुशोधन करते समय महत्वपूर्ण देखभाल की जानी चाहिए। ड्रेसिंग की कई परतों का आवेदन सुअर को खुजली को रगड़ने या खरोंच करने के अपने प्रयास के दौरान घावों को उजागर करने से रोकता है।

वर्तमान मॉडल में सुअर को अंतर्निहित चयापचय संबंधी विकारों (जैसे, मधुमेह) से समझौता नहीं किया गया था, और इसलिए, अध्ययन किया जा रहा प्रभाव विशुद्ध रूप से घाव भरने पर जीवाणु बायोफिल्म संक्रमण का प्रभाव था। हालांकि, मॉडल खुद को मधुमेह के प्रेरण (उदाहरण के लिए स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन का उपयोग करके) के लिए उधार देता है और इसका उपयोग अंतर्निहित चयापचय विकार के संबंध में बायोफिल्म संक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। मॉडल की अन्य सीमा पी. एरुगिनोसा, एक जीवाणु का उपयोग करके नियंत्रित संक्रमण सेटिंग है। यह उम्मीद की जाती है कि सुअर की सामान्य त्वचा सूक्ष्म वनस्पति भी घाव में बढ़ रही है और उपचार को प्रभावित कर सकती है। घाव की माइक्रोबियल सामग्री को चित्रित करने के लिए एनजीएस या अन्य उन्नत तकनीकों का उपयोग करके आगे का विश्लेषण आवश्यक है। वर्तमान मॉडल को अलग-अलग माइक्रोबियल प्रजातियों (जैसे, फंगल, वायरल, आदि) के साथ मिश्रित संक्रमणों पर भी लागू किया जा सकता है। यह एक महत्वपूर्ण तत्व है, क्योंकि नैदानिक रूप से प्रासंगिक घावों को मिश्रित रोगाणुओं द्वारा आबादी होने की संभावना है, जो घाव भरने को अलग-अलग प्रभावित कर सकते हैं।

इस मॉडल में कई संभावित फायदे हैं, जिनमें मानव पुराने घावों की जटिलता और दीर्घकालिक अनुक्रम की समानता, स्वचालित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जलने की प्रक्रिया और नैदानिक रूप से पृथक जीवाणु प्रजातियों का उपयोग शामिल है। कई गैर-इनवेसिव इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग घाव की विशेषता वाले उपयोगी शारीरिक डेटा एकत्र करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, TEWL के आधार पर त्वचा बाधा समारोह की बहाली के माध्यम से कार्यात्मक घाव भरने का आकलन महत्वपूर्ण है। अंत में, पोर्सिन मॉडल सिस्टम का उपयोग करके बायोफिल्म-संक्रमित गंभीर जलने की चोट विकसित करने के लिए एक मजबूत, सरल, विस्तृत और उपयोग में आसान प्रोटोकॉल इस काम में दिखाया गया है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला पशु संसाधन केंद्र (एलएआरसी), इंडियाना विश्वविद्यालय को उनके समर्थन और अध्ययन के दौरान जानवरों की पशुचिकित्सा देखभाल के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान NR015676, NR013898 और DK125835 और रक्षा विभाग अनुदान W81XWH-11-2-0142 द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अलावा, इस काम को निम्नलिखित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से लाभ हुआ पुरस्कार: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 और NS42617।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26x30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4x4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373

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References

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स्वाइन मॉडल बायोफिल्म संक्रमण घाव कालक्रम मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली नैदानिक रूप से प्रासंगिक पूर्व-नैदानिक मॉडल विवो में इन विट्रो पूर्व विवो अल्पकालिक अध्ययन दीर्घकालिक अध्ययन त्वचा बाधा समारोह कार्यात्मक घाव बंद अदृश्य घाव पद्धतिगत विवरण गंभीर जलने की चोट अनुवाद मूल्य पी. एरुगिनोसा (PA01) 8 सप्ताह का संक्रमण
बायोफिल्म संक्रमण और अदृश्य घावों का सूअर मॉडल
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El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).

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