Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Svinmodell av biofilminfektion och osynliga sår

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65301
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery, Indiana University School of Medicine

Summary

Kroniska sår som är resistenta mot antibiotika är ett stort hot mot sjukvården. Biofilminfektioner är envisa och fientliga och kan orsaka bristfällig funktionell sårförslutning. Vi rapporterar en kliniskt relevant svinmodell av biofilminfekterade kroniska fullhudssår. Denna modell är kraftfull för mekanistiska studier såväl som för att testa interventioner.

Abstract

Biofilminfektion är en viktig bidragande orsak till sårkronicitet. Etableringen av kliniskt relevant experimentell sårbiofilminfektion kräver involvering av värdens immunsystem. Iterativa förändringar i värden och patogenen under bildandet av sådan kliniskt relevant biofilm kan endast inträffa in vivo. Svinsårmodellen är erkänd för sina fördelar som en kraftfull preklinisk modell. Det finns flera rapporterade metoder för att studera sårbiofilmer. In vitro - och ex vivo-system är bristfälliga när det gäller värdens immunsvar. Korttidsstudier in vivo innebär akuta reaktioner och tillåter därför inte biofilmsmognad, vilket är känt för att ske kliniskt. Den första långtidsstudien av svinsår rapporterades 2014. Studien erkände att biofilminfekterade sår kan stängas enligt planimetry, men hudbarriärfunktionen på det drabbade stället kan misslyckas med att återställas. Senare validerades denna observation kliniskt. Konceptet med funktionell sårförslutning var därmed fött. Sår som är stängda men som har brister i hudens barriärfunktion kan ses som osynliga sår. I detta arbete strävar vi efter att rapportera de metodologiska detaljer som är nödvändiga för att reproducera den långsiktiga svinmodellen av biofilminfekterad svår brännskada, vilket är kliniskt relevant och har translationellt värde. Detta protokoll ger detaljerad vägledning om hur man etablerar en 8 veckors sårbiofilminfektion med P . aeruginosa (PA01). Åtta fullhudsbrännskador skapades symmetriskt på ryggen hos tama vita grisar, som inokulerades med (PA01) dag 3 efter brännskada; Därefter utfördes icke-invasiva bedömningar av sårläkningen vid olika tidpunkter med hjälp av laserspeckelavbildning (LSI), högupplöst ultraljud (HUSD) och transepidermal vattenförlust (TEWL). De inokulerade brännskadorna täcktes med ett förband i fyra lager. Biofilmer, som etablerats och bekräftats strukturellt av SEM på dag 7 efter inokulering, äventyrade den funktionella sårförslutningen. Ett sådant negativt resultat kan upphävas som svar på lämpliga åtgärder.

Introduction

Biofilminfektion komplicerar brännskador och kroniska sår och orsakar kronicitet 1,2,3,4,5. Inom mikrobiologin studeras i första hand biofilmens mekanismer, med fokus på mikroberna 1,6. Lärdomarna från dessa studier är av största vikt ur en biologisk vetenskaplig synvinkel men behöver inte nödvändigtvis vara tillämpliga på kliniskt relevanta patogena biofilmer 6,7,8. Kliniskt relevanta strukturella aggregat för biofilm bör inkludera mikrobiella såväl som värdfaktorer 8,9,10. En sådan mikromiljö gör det möjligt att inkludera iterativa interaktioner mellan värd och mikrob, vilket är avgörande för att utveckla en kliniskt relevant biofilm 7,8. I en sådan process är deltagandet av immunceller och blodburna faktorer avgörande11,12. De interaktioner mellan värd och mikrober som ligger till grund för kliniska patogena biofilmer, som ses i kroniska sår, sker under lång tid. Således måste varje experimentellt tillvägagångssätt som syftar till att utveckla en translationellt relevant modell för biofilmsinfektion ta hänsyn till dessa faktorer. Så vi försökte utveckla en kliniskt reproducerbar modell för kronisk biofilminfektion hos svin.

Även om studier på människor helt klart representerar det bästa sättet att studera läkningsresultat, är de ofta inte bäst lämpade för att ta itu med de underliggande mekanismerna och nya mekanistiska paradigm. Etiska problem begränsar användningen av studiedesign som kräver insamling av flera biopsier från ett kroniskt sår vid olika tidpunkter. Det är därför viktigt att ha en väletablerad och reproducerbar djurmodell för att möjliggöra invasiva studier för en grundlig undersökning av biofilmens öde 7,13. Valet av djurmodell beror på flera faktorer, inklusive vetenskaplig/translationell relevans och logistik. Svinsystemet är allmänt erkänt som den mest translationellt värdefulla experimentella modellen för att studera hudsårhos människor. Således rapporterar detta arbete en etablerad svinmodell av biofilminfekterade fullhudsbrännskador. Detta arbete är baserat på flera originalpublikationer som rapporterats i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denna studie valdes ett kliniskt isolat av multiresistent Pseudomonas aeruginosa (PA01) för att infektera såret. P. aeruginosa är en vanlig orsak till sårinfektioner 2,18,19,20. Det är en gramnegativ bakterie som kan vara svår att behandla på grund av dess resistens mot vissa antibiotika11,19,21. Ingen av de biofilmsmodeller som hittills rapporterats har involverat 8 veckors långtidsstudier 22,23,24,25,26. Kroniska sår är de som förblir öppna i 4 veckor eller mer 14,27,28. Det finns inga andra kroniska sårbiofilmmodeller rapporterade i litteraturen. Detta arbete behandlar begreppet funktionell sårförslutning 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Alla djurstudier utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147. Studien genomfördes vid Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University. Vi använde en kvinnlig vit gris (70-80 lb) i detta protokoll.

1. Acklimatisering av djur

  1. Vid ankomsten av grisarna till anläggningen, inhyss djuren individuellt i samma rum i minst 3 dagar för acklimatisering och social interaktion.
  2. Ge grisarna en välbalanserad kost. Bestäm mängden som ska utfodras baserat på vikten och följ rekommendationerna från tillverkaren.
  3. Se till att djuret fastar i 6-12 timmar före ingreppet för att förhindra illamående, kräkningar och aspiration av magvätska under narkos.

2. Inställning av operationsrum

  1. Förbered anestesimaskinen och se till att den är redo med återandningskretsen.
  2. Ordna rummet för operation, enligt beskrivningen nedan (Figur 1A).
    1. Täck operationsbordet med ett sterilt draperi och lägg en cirkulerande vattenfilt under för att underlätta termoregleringen.
    2. Ställ upp ett bord med induktionsmaterial och operationsförberedelsematerial. Ställ upp ett bord med brännarenheterna och kontrollboxarna. Ställ in bildåtergivningsutrustningen och se till att den är påslagen.

3. Sedering av svinet

  1. Söva grisen med en intramuskulär injektion av TKX (Telazol 4,4 mg/kg; ketamin 2,2 mg/kg; xylazin 2,2 mg/kg) i en dos av 1 ml/50 lb. Behåll grisen i ingreppsrummet på 1%-3% isofluran som levereras via en mask.
  2. Administrera (preoperativa) smärtstillande medel till svinen i enlighet med IACUC-protokollet. Några exempel är följande: buprenorfin 0,3 mg/ml, 0,01-0,05 mg/kg IM; karprofen 50 mg/ml, 4 mg/kg IM eller SQ; Fentanyl transdermal 100 μg/h placerad på örats ytterblad. gabapentin 300 mg kapslar, 3-10 mg/kg peroralt intag.
    OBS: För alla brännskador och biopsiprocedurer kommer 1 dos gabapentin att ges dagen före operationen och 1 dos karprofen kommer att ges på dagen för ingreppet. För huvudbränningsingreppet kommer ett fentanylplåster att placeras och 1 full dos buprenorfin kommer att ges under kirurgisk förberedelse.

4. Induktion av anestesi

  1. Sterilisera örat med omväxlande 2 % klorhexidinskrubb och alkohol minst tre gånger. För in A 22-18 G 1 i den intravenösa katetern i den marginella öronvenen och bekräfta blodflödet. Spola katetern med koksaltlösning och fixera katetern med kirurgtejp (Figur 1B).
  2. Intubera grisen med en endotrakealtub av lämplig storlek (7-9 mm) när muskelavslappning har uppnåtts genom inandning av anestesi via masken. Kontrollera muskelavslappningen genom att en förlust av käktonus och en palpebral reflex observeras.
    1. Öppna tuben och testa manschettläckaget med en spruta med luft. Sätt i röret med hjälp av ett laryngoskop30.
    2. Blås upp manschetten och fäst röret när korrekt placering har bekräftats. Anslut grisen till återandningskretsen.
      OBS: Röret knyts på plats över nosen och rullväv används för att säkra den. Auskultation av bröstkorgen utförs med ett stetoskop för att bekräfta att röret är korrekt placerat.
      OBS: Under anestesi tillförs luft var 5-10:e minut genom att stänga avstängningsventilen och trycka ner andningspåsen tills tryckmanometern når 20 mm/Hg för att förhindra positionell atelektas.
  3. Övervaka djuret och anestesidjupet.
    1. Anslut grisen till en monitor med flera parametrar. Monitorn kommer kontinuerligt att läsa av syremättnaden (SpO 2), pulsfrekvensen, koldioxid i slutet av tidvattnet (EtCO2), andningsfrekvens och temperatur. Anteckna vitala värden var 10:e minut under hela proceduren.
    2. Bedöm anestesidjupet genom att testa smärtreflexerna med ett bakbensnyp i tån innan såret påbörjas.
      OBS: Vid behov, justera bedövningsförångaren för att administrera ytterligare bedövning, eller vänta några minuter. Kontrollera smärtreflexerna och de palpebrala reflexerna regelbundet under hela operationen.

5. Förberedelse för brännskador på djur

  1. Koppla bort grisen från anestesimaskinen och flytta den till operationsbordet. Placera grisen i akterliggande läge och se till att säkra alla anslutna ledningar och rör (Figur 1C).
  2. Återanslut grisen till anestesimaskinen och håll O2 på 0,8-1,5 l/min och isofluran på 1%-3% tills proceduren är slut.
  3. Administrera intravenös vätska (LRS) till grisen med en dropphastighet på 8-10 ml/kg/timme. Övervaka anestesin enligt steg 4.3.

6. Antiseptisk beredning och markering av brännskadan på huden

  1. Förbered sårområdet genom att raka dig och applicera hårborttagningskrämen, enligt beskrivningen nedan (Figur 2).
    1. Raka grisryggen på ett område som är cirka 25 cm brett från ryggraden hela vägen till armhålan på båda sidor med hjälp av en elektrisk klippare.
    2. Applicera hårborttagningskrämen på det klippta området och låt sitta i 3-7 minuter. Ta bort krämen tillsammans med håret med rena absorberande handdukar.
  2. Förberedelse av brännplatsen
    1. Skrubba området som ska skadas med omväxlande 2 % klorhexidinskrubb och 70 % isopropylalkohol minst tre gånger i cirka 5 minuter. Se till att skrubben appliceras i ett bullseye-mönster (börjar i mitten och rör sig utåt i en spiral) av personal som bär sterila handskar.
    2. Markera sårställena med en steril brännskademall och en kirurgisk hudmarkör (Figur 2B). Markera sex till åtta sår (2 tum x 2 tum) symmetriskt på ryggen.
    3. Täck områdena runt de markerade platserna med ett sterilt draperi för att minska kontamineringen (Figur 2C).

7. Procedur för brännskador

  1. Använd en brännanordning, t.ex. en egentillverkad specialbrännare som består av ett 2 x 2 tum stort block i rostfritt stål (vikt: 352 g) anslutet till en metallpenna, en elektronisk mikrostat och en elektronisk våg (totalvikt: 1 714 g; Figur 3).
    1. Ställ in brännaren på önskad temperatur. Justera måltemperaturen för fullhudssår till 150 °C (Figur 3A). Ställ in börvärdet (SP) på styrenheten till 150 °C. Ställ in det låga börvärdet på 145 °C och det höga börvärdet på 155 °C (Figur 1D).
  2. Skapa ett brännsår i full tjocklek på 2 tum x 2 tum genom att använda uppvärmda block av rostfritt stål som är anslutna till brännskadeanordningen och placera dem på huden i 60 s (Figur 3B, C). Under appliceringen av brännskadan, använd den elektroniska vågen för att säkerställa att jämnt tryck appliceras av brännaren.

8. Bedömning av brännskador och bilddiagnostik

  1. Digital fotografering
    1. Ta bilder av såren med en DSLR-kamera och ett 17–55 mm ultraljudsvidvinkelobjektiv med elektrofokus (EFS) och en ficklampa.
    2. Ta ett digitalt foto av hela grisen tillbaka, inklusive ett plakat med grisens identifiering, tidpunkt och datum. Ta sedan bilder för varje sår separat som visar ett plakat med gris-ID, sår-ID och tidpunkt samt en linjal.
    3. Beräkna sårytan som procentandelen av den ursprungliga sårstorleken vid varje tidpunkt för insamling fram till dag 56.
      OBS: I detta arbete beräknades sårarean vid varje tidpunkt (d0, d7, d14, d28 och d56) som en procentandel av den ursprungliga sårarean på d0.
  2. Laserspeckelavbildning (LSI)
    1. För laserspeckelavbildning, använd en blodperfusionskamera baserad på laserfläckkontrastanalys (LASCA) för att bedöma sårets mikrovaskulära perfusion i realtid.
    2. Ta bilderna av alla sår i en enda inspelning. Justera det uppmätta värdet för arbetsavståndet från laserkameran till såret så att det är konsekvent för avbildningen av varje sår (Figur 4A).
    3. Spela in perfusionen med en serie bilder tagna under ett intervall på 10-15 s. Efter att ett sår har avbildats pausas inspelningen automatiskt och inspelningen återupptas när kameran har justerats för det efterföljande såret. Varje gång inspelningen pausas läggs en markör till för att identifiera såret.
  3. Transepidermal vattenförlust (TEWL)
    1. Mät TEWL för varje sår med hjälp av en standardenhet, en TEWL-sond och programvara (Figur 4B). För varje sår, placera ett rent sondskydd över sondspetsen, som kommer att vara i kontakt med sårvävnaden.
    2. Placera sonden försiktigt och jämnt på huden och starta avläsningen genom att trycka på Start-knappen på enheten.
    3. Mät varje sår fem gånger, först i mitten och sedan i varje hörn. Exportera sedan alla avläsningar till ett kalkylblad (Figur 4B).
  4. Harmoniskt ultraljud (HUSD)
    1. Utför HUSD-kartläggning genom att skanna såret med en ultraljudssond (US) från mittlinjen (kotpelaren) med början från normal hud mot grisens lateralsida där det finns normal hud igen. Följ detta skanningsmönster för varje sår i både B-läge och vävnadselastografiläge med hjälp av ultraljudsmaskinen (Figur 4C).
      1. För skanning i B-läge, applicera steril ultraljudsgel på sårområdet och applicera lite på ML-615 högupplöst sond. Kommentera varje registrering med såridentifieringsetiketten. Starta inspelningen och flytta sonden långsamt från mittlinjen ner i såret tills den normala huden på andra sidan nås.
        När skanningen är klar sparas inspelningen och exporteras från maskinen för analys.
      2. För elastografi, ställ ultraljudsmaskinen till elasto läge genom att trycka på Elasto knappen. Skanna såret igen på samma sätt som vid skanning i B-läge, och se till att ett jämnt tryck på sonden bibehålls så att elastografins färgindikator (gröna staplar) förblir synlig under hela inspelningen.
        OBS: Lämpligt tryck kan bestämmas av skalstapeln på inspelningen, som visas grönt när rätt kontakt görs (Figur 4D).
      3. Ändra anteckningen efter att varje sår har avbildats i både B-läge och elastoläge (två registreringar per sår). Ändra kommentaren i programvaran så att den innehåller information för nästa sår och upprepa processen för de efterföljande såren.

9. Bandage och förband

  1. Täck brännsåren individuellt med genomskinliga filmförband eller testförbandet (Figur 5A, B). Placera ett större genomskinligt filmförband över hela sårområdet (Figur 5C).
  2. Applicera ett andra lager rullgasväv löst runt hela grisens stam för att absorbera eventuellt vätskeutsöndring som kommer från såren. Rulla grisen fram och tillbaka från sidan till något på ryggen för att linda bandagematerialet runt grisen.
  3. Täck gasbindan löst med ett lager flexibelt elastiskt bandage (Figur 5D). Se till att bandaget inte sitter för hårt, eftersom applicering för hårt kan begränsa andningen och sätta tryck på buken, vilket kan resultera i rektal prolaps eller olika komplikationer.
    OBS: Det elastiska bandaget är töjbart och kan lätt dras åt för hårt under applicering. Att dra av den från rullen och låta den ligga över kanten på den tidigare wrapen kan hjälpa till att förhindra att den dras åt för hårt.
  4. Täck det elastiska bandaget med ett sista lager av 4 i elastisk tejp (Figur 4E). Återigen, se till att appliceringen inte är för hårt, men se till att förbandet är säkrat i den övre och nedre kanten för att förhindra att det glider ner när grisen rör sig efter proceduren.

10. Djuråterhämtning och postoperativ vård

  1. Återhämtning
    1. Avbryt anestesigasen när såran, bildproceduren och bandaget är klar. Låt grisen stå på syrgas i minst 5 minuter.
    2. Efter att ha återvänt till det primära djurutrymmet ska grisen flyttas från transport-/lyftbordet till en skummatta i buren. Höj den automatiska vattenautomaten och ta bort j-mataren för att förhindra skador på grisen under återhämtningen.
    3. Täck grisen med filtar (inklusive en varmluftsfilt) om hypotermi föreligger. Övervaka och registrera vitala värden inklusive temperatur, puls, andningsfrekvens och SpO2 var 10-15:e minut.
    4. Övervaka grisen kontinuerligt tills den kan behålla sternal liggande på egen hand. När grisen är helt återställd sänker du bröstvårtsvattnaren, och sedan kan grisen också utfodras.
  2. Smärtbedömning
    1. Utför en postoperativ smärtbedömning med hjälp av ett modifierat Glasgow-smärtbedömningsformulär. Se till att smärtbedömningarna genomförs av antingen labb- eller LARC-personal minst var 12:e timme under de första 3-4 dagarna postoperativt. Frekvensen av smärtbedömning bestäms av den behandlande veterinären. Om djuret får högre poäng än 5 ska det administreras smärtlindring vid räddningsbehandling (buprenorfin eller hydromorfon).
    2. Ge analgesi genom att administrera en dos buprenorfin 0,01-0,05 mg/kg intramuskulärt före ingreppet, med en andra dos 8-12 timmar senare.
    3. Placera ett fentanylplåster (100 mikrogram/timme) på örats ytteröra före brännskadan.
    4. Injicera karprofen 4 mg/kg IM eller SQ före proceduren, och sedan en gång dagligen IM, SQ eller PO i 2 dagar eller enligt anvisningar från LARC-veterinären.
    5. Ge gabapentin 3-10 mg/kg oralt, med en dos som ges dagen före ingreppet, morgonen för ingreppet, kvällen efter ingreppet och sedan var 12:e timme i 3-5 dagar.
  3. Diet
    1. Se till att grisarna är återställda och ge dem sedan fri tillgång till vatten och mat i enlighet med deras viktbaserade ranson två gånger dagligen.
    2. Ge matberikning (färsk frukt och grönsaker, fryst frukt, marshmallows, yoghurt, pudding, etc.), och använd dessa för att locka till att äta om en minskad aptit observeras.
  4. Byte av förband
    1. Byt bandage minst en gång i veckan eller oftare om bandaget blir smutsigt eller för att tillgodose behandlingsstrategier.
    2. Byt bandage efter avbildning medan du fortfarande är under narkos, eller söva grisen med endast TKX för ett förbandsbyte.
    3. För att byta ut bandaget, börja med att försiktigt ta bort det smutsiga bandaget med Lister bandagesax eller traumasax, var uppmärksam på att inte låta utsidan av förbandet komma i kontakt med såren.
    4. Rengör området runt såren vid behov med 0,9 % NaCl på ren gasväv och torka området försiktigt. Följ procedurstegen för bandage som beskrivs i avsnitt 9.
      OBS: Om experimentella förband appliceras kan dessa appliceras innan såren täcks med det genomskinliga filmförbandet.
  5. Bildfrekvens
    1. Skaffa bildbehandling (digitala foton, LSI, TEWL och HUSD) vid olika tidpunkter under studien. Samla in bilddata på dag −3 (brännskador), dag 0 (inokulering) och dag 7, dag 14, dag 28, dag 35 och dag 56 efter inokulering.

11. Beredning och inokulering av biofilm

  1. Förberedelse av inokulat
    1. Förbered en starttallrik av en glycerolfrysbuljong av Pseudomonas aeruginosa (PA01) för en ren kultur av bakterien. Odla en P. aeruginosa-kultur i Luria-Bertani agar (LBA) med låg salthalt och inkubera vid 37 °C över natten.
    2. Inokulera 5 ml Luria−Bertani-buljong (LBB) med en enda P. aeruginosa-koloni nästa dag och inkubera över natten vid 37 °C med skakning vid 200 rpm.
    3. För att erhålla logfasceller inokuleras 200 μl av nattkulturen till 5 ml LBB och inkuberas i skakapparaten vid 200 varv per minut vid 37 °C i 2,5 timmar.
    4. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med en spektrofotometer. Bered seriespädningar upp till 1 x 10−9 med 100 μl från odlingen i 900 μl sterilt LBB.
      OBS: Vi började med outspädda prover och slutade med 1 x 10 7 CFU/ml. Vi erhöll räknebara kolonier i 1 x 10 7-utspädningen, så vi betraktade denna utspädning som den avslutande utspädningen.
    5. Sprid ut 100 μl av varje spädning på LBA och inkubera över natten vid 37 °C. Enligt vanliga mikrobiologiska protokoll, använd utspädningar som visar räkningsbara kolonier (30-300) för antalet kolonier och erhåll de kolonibildande enheterna (CFU).
  2. Inokulering av såret
    1. Inokulera 200 μl från nattodlingen till 5 ml LB-buljong och inkubera i shakern vid 37 °C i 2,5 timmar.
    2. Mät den optiska densiteten i dagkulturen vid 600 nm (OD600). För PA01-inokulering, använd 3 x 10 8 CFU/ml (250 μl 1 x 108 CFU/ml PA01 inokuleras per sår). Transportera ympen till djuranläggningen i en behållare för biologisk risk.
    3. Sprid inokulet över ytan på de exponerade såren på dag 3 efter förbränningen med hjälp av en pipett och sprid ut det jämnt med hjälp av en engångsspridare (figur 6). Håll såren öppna i cirka 15 minuter innan du bandagerar.
      OBS: Alla kirurgiska ingrepp, vaccination, vävnadsbiopsier, avbildning och bandage görs under narkos som i avsnitt 3 och 4.
  3. Bekräfta att smitta har konstaterats
    OBS: För att bekräfta att såren har blivit framgångsrikt infekterade efter vaccinationen används flera tillvägagångssätt, och sårprover jämförs med prover som samlats in från normal hud; Nedan följer några exempel.
    1. För patologibaserad analys av prover som samlats in vid olika tidpunkter, använd räkningen av kolonibildande enheter för att uppskatta en infektion (CFU; Figur 7E, F).
      1. Samla in 6 mm sårvävnad genom stansbiopsi. Märk och väg tomma 5 ml rundbottnade rör. Överför proverna till rören och väg rören med proverna.
      2. Tärna vävnaden med en skalpell på en steril yta. Utför alla steg i en BSL2-kåpa.
        OBS: För att säkerställa att vävnaderna lätt homogeniseras bör storleken vara mycket liten (men inte mindre än 0,5 mm)
      3. Lägg provet i röret och tillsätt 1 ml PBS. Blanda och mal vävnaden med en malningssond av hård vävnad.
      4. Späd homogenatet i serie (outspätt till 1 x 10−5) och platta 50 μL av varje spädning i selektiva (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) och icke-selektiva (LBA) medier.
      5. Inkubera alla spädningar under aeroba förhållanden vid 37 °C i 18–24 timmar. Avbilda plattorna med rätt ljusförhållanden.
      6. Välj plattor med 30-300 kolonier, om ingen av plattorna har nått den koncentrationen, använd den outspädda plattan. Använd ImageJ för att räkna antalet samhällen och beräkna CFU per platta genom att multiplicera medelvärdet med den slutliga utspädningsfaktorn.
    2. Ta bilderna från prover som samlats in från dag 7 efter inokulering och andra tidpunkter med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM) för att bekräfta närvaron av bakteriebiofilmer (Figur 7G).
      OBS: Dag 7 efter inokulering valdes eftersom det är dagen för etablering av biofilminfektion och början av uppmjukning av brännskadeskor, vilket möjliggör penetration av de amerikanska vågorna och därmed visualisering av de djupare vävnaderna. I figur 4 kan du kontrollera bilden av det amerikanska brännsåret dag 3, som visar den tjocka läderartade sårskorpan som hindrar de amerikanska vågorna från att passera till de djupare vävnaderna.
    3. Färga de delar av sårbiopsierna med specifika antikroppar mot P. aeruginosa för att bekräfta förekomsten av den specifika bakterien, vilket visas i en tidigare publikation13 (Figur 7H).
    4. Utför nästa generations sekvensering (NGS), som publicerats i Sinha et al.31. Kvantifiera bakteriernas 16srRNA från de infekterade såren och de normala oinfekterade hudproverna som samlats in vid olika tidpunkter med början på dag 7 efter inokulering till slutet av studien.

12. Insamling av biopsi

  1. Samla in vävnadsbiopsierna för analys efter bildtagning dag 7, dag 14, dag 28 och dag 56 efter inokulering. Ta biopsier från varje sår endast en gång för att minimera störningen av läkningsprocessen.
    OBS: Alla kirurgiska ingrepp, vaccination, vävnadsbiopsier, avbildning och bandage görs under narkos som i avsnitt 3 och 4.
    1. Infiltrera området runt såret med 0,5 % bupivakain. Skär en 3-4 mm bred remsa från den ena kanten av såret till den andra, behåll små marginaler av normal hud på båda sidor, med hjälp av en engångsskalpell med ett blad i storlek 10. Placera remsan i ett märkt koniskt rör fyllt med 4 % buffrat formalin för fixering.
      OBS: För tidig tidsavbildning och biopsiprocedurer kommer en full dos buprenorfin att ges under operationsförberedelserna. Vid biopsi vid sen tidpunkt kommer en halv dos buprenorfin att ges under operationsförberedelserna. Efter alla brännskador och biopsiprocedurer kommer gabapentin att ges två gånger dagligen i upp till 7 dagar enligt råd från den behandlande veterinären. Karprofen kommer att ges i flera dagar efter operationen eller enligt råd från den behandlande veterinären.
    2. Skär en 6 mm stansbiopsi från såret (antingen från sårbädden eller sårkanten). Samla in från sårkanten, inklusive en del av den normala huden och sårbädden, för olika typer av analys.
    3. Ta bort provet med steriliserad pincett och dissekerande sax. Placera biopsiprovet i lämpligt rör eller kassett för bearbetning och analys.
    4. För CFU, SEM, RNA och FPPE, bevara proverna i rör med en lämplig buffert. Till exempel kan prover placeras i OCT i kassetter för laserfångstmikroskopi (LCM) och immunhistokemi (IHC).
    5. Uppnå hemostas efter att proverna har samlats in genom att försiktigt trycka på såret med en steril gasbinda. Täck såret med icke-vidhäftande förband och bandage som i avsnitt 9.

13. Eutanasi och vävnadsinsamling

  1. Söva grisen på avlivningsdagen med TKX och bedöva med isofluran. Placera en intravenös kateter i den marginella öronvenen enligt stegen som beskrivs i avsnitt 3. Intubera grisen enligt stegen i avsnitt 4.
  2. Ta bort bandaget när grisen är sövd och rengör området runt såren.
  3. Komplett digital fotografering, LSI, TEWL och HUSD-avbildning. Ta proverna från såren och den normala huden genom att följa stegen i avsnitt 12.
  4. När alla nödvändiga prover har samlats in, avlivas grisen på ett humant sätt under narkos genom en intravenös injektion av kommersiellt tillgänglig eutanasilösning (natriumpentobarbital). Använd ett stetoskop för att auskultera för att bekräfta att hjärtslagen upphör och spontanandningen.
  5. Utför en sekundär avlivningsmetod, enligt SOM IACUC:s krav, genom att använda en skalpell för att inducera pneumothorax. Överför griskroppen till en tunna och transportera den till frysen för att hämtas för förbränning.

Representative Results

En standardiserad brännskadeanordning användes för att skapa fullhudsbrännskador vid 150 °C i 1 minut, vilket resulterade i en homogen djup brännskada med en enhetlig marginal av erytem och inflammation (Figur 3 och Figur 7). Varje gris fick åtta fullhudsbrännskador på ryggen, som visas i figur 3C.

Den icke-invasiva realtidsbedömningen av brännskadorna med högupplöst ultraljud av B-mode för att bekräfta sårdjupet och progressionen av sårläkning över tid visade förstörelsen av alla hudlager upp till det subkutana fettet (Figur 4). Laserspeckelavbildning (LSI) användes för ytterligare karakterisering av sårperfusionen (Figur 4A).

Brännskadorna uppvisade en tjock pyogen hinna på sårytan dag 7 efter inokuleringen, vilket bekräftade infektionen och etableringen av brännskadeskadans biofilm (Figur 7A). Digital planimetri visade en ökad såryta dag 3 efter inokulering med PAO1 på grund av det inflammatoriska svaret vid sårstället och marginalerna (Figur 7A,B). Även om sårområdet började krympa dag 14 efter vaccinationen, observerades ofullständig läkning till cirka 25 % av den ursprungliga sårstorleken vid dag 56, vilket indikerar sårens kronicitet (Figur 7B). Sårkronicitet och försämrad sårläkning bekräftades ytterligare av TEWL, som visade hög transepidermal vattenförlust. TEWL-resultaten återspeglade förlusten av hudbarriärens funktion jämfört med normal hud vid alla tidpunkter, vilket tyder på en funktionsnedsättning av läkningen av brännskadorna (Figur 7B). Detta bekräftades också av hämningen av de täta korsningsproteinerna ZO-1 och 213 och försämringen av återställandet av hudens barriärfunktion, vilket återspeglades i de höga TEWL-värdena som sågs vid dag 35 (mitten) och dag 56 (sen) trots den visuella sårförslutningen (figur 7I).

Brinndjupet validerades ytterligare genom H&E-färgning, som visade distorsion och nekros i alla histologiska hudlager, som visas i figur 7C. Den etablerade biofilmen av PA01 validerades ytterligare dag 7 efter inokulering med CFU (Figur 7E,F), SEM-avbildning (Figur 7G) och immunofluorescensfärgning (Figur 7H).

Figure 1
Figur 1: Inställningar för proceduren . (A) Förberedelse av operationsbord. (B) Öronvenskanylering för intravenös vätska och läkemedelsadministrering. C) Värmefilt som skyddar grisen mot hypotermi under försöket. (D) Inställning av brännare och timer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Sterilisering och märkning av operationsområdet . (A) Hårklippning och sterilisering. (B) Markering av brännskadestället med hjälp av en steril standardmall för åtta sår (varje sår är 2 tum x 2 tum). C) Slutmärkning med hjälp av en steril hudmarkör. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Induktion av brännsår. (A,B) Standardiserad brännare med en tryckmätare och automatiserad styrenhet (2 tum x 2 tum) applicerad på det förmarkerade sårstället. (C) Hela ryggen visar de åtta fullhudsbrännskadorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Avbildning och bedömning av icke-invasiva brännskador. (A) Laserfläckavbildning (LSI) med korrekt orientering av laserstråleindikatorn mot mitten av såret visas i bilden till vänster; Bilden på höger sida visar LSI-enheten och kartan över hudens vaskulära perfusion i realtid. (B) Applicering av transepidermal vattenförlust (TEWL) sond på sårstället på fem olika ställen (fyra sårhörn och mitten som visas i bilden i nedre högra hörnet) visas i bilden till vänster; bilden på höger sida är en representativ realtidsskärm av TEWL-mätningen. (C) Harmonisk ultraljudsskanning av brännsåret med hjälp av en högupplöst 16 MHz ultraljudssond visas på vänster sida; Bilden till höger visar ultraljudsenheten och skärminspelningen i realtid. (D) Strukturella (B-lägesbilder, gråskaleultraljud) och biomekaniska (elastografi, färgultraljud) bilder av brännskadestället vid inokuleringsdagen och dag 7 efter inokuleringen. Sårdjupet indikeras av den gula streckade linjen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Sårförband och bandagering . (A) Applicering av det genomskinliga filmförbandet för varje sår separat. (B) Alla dorsalinokulerade brännskador är täckta med det första lagret av förband. (C) Ett större genomskinligt filmförband placeras över hela sårområdet. D) Anbringande av det andra lagret gasbinda och ett löst lager av töjbart elastiskt bandage runt hela svinets bål för att absorbera eventuell vätska som kommer från såren. (E) Täckning av hela sårområdet med ett sista lager på 4 i adhesivt förband. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Bakteriell inokulering. (A) Uppställning för inokulering av Pseudomonas aeruginosa (PA01) på dag 3 efter förbränning. B) Lokal applicering av inokulet med en pipett med en volym på 500 μl för varje sår. C) Inokulatet sprids jämnt över sårytan med hjälp av en steril engångsspridare. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Sårläkningsförlopp och biofilmbekräftelse. A) Representativa bilder av sårförslutningen under studiens tidslinje. Skalstreck = 1 cm. (B) Kvantifiering av sårområdet och TEWL-mätningar under studiens tidslinje (n = 6). Uppgifterna representeras som medelvärde ± SD. N.S. hänvisar till TEWL-värdet för normal hud. (C) Schematisk bild som visar olika sårbiopsiställen. D. H&E-färgning med motsvarande Massons trikroma färgning som visar distorsion och nekros av alla hudlager på dag 3 efter förbränning och dag 7 efter inokulering. Skalstapel = 500 μm. (E) Representativa digitala bilder av icke-selektiv agar (Luria-Bertani-agar) och selektiv agar (Pseudomonas Isolation Agar) med bakteriekolonier odlade från sårbäddsvävnad från svin. Det selektiva mediet möjliggör noggrann räkning av endast PA01-samhällena. (F) En beräkning av en provkolonibildande enhet (CFU) från antalet kolonier som tagits från behandlade sårbiopsier dag 7 efter inokulering visas. (G) Representativa svepelektronmikroskopibilder (SEM) av de inokulerade brännskadorna dag 7 efter inokulering som visar den etablerade PA01-biofilmen, med en inzoomad bild på höger sida. Skalstapel = 1 μm. De röda pilspetsarna pekar på extracellulära polymera ämnen (EPS). (H) P. aeruginosa på brännsåren visualiserades med hjälp av anti-Pseudomonas (grön) antikropp; Immunofluorescensbilderna från dag 7 efter inokulering av sårbiopsier visar kraftig kolonisering av sårvävnaderna av P. aeruginosa. Skalstreck = 100 μm. (I) Representativ mosaik (skalstreck = 200 μm) och motsvarande inzoomade (skalstreck = 50 μm) bilder av ZO-1- och ZO-2-färgade snitt på dag 35 och dag 56 efter inokuleringen, som visar minskat uttryck av proteinerna efter den inducerade infektionen. De OCT-inbäddade frysta sektionerna (10 μm) färgades med anti-ZO-1 (grön) eller anti-ZO-2 (grön). Sektionerna motfärgades med DAPI. Stapeldiagrammen visar kvantifieringen av ZO-1- och ZO-2-signalintensiteten. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SD (n = 3); * p < 0,05 jämfört med spontana. Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis envägsanalys av varianstester utfördes för att testa signifikansen. Figur 7H,I har modifierats från Roy et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för att sätta upp en svinmodell av kronisk sårbiofilminfektion för experimentella studier. Flera svinbiofilmsmodeller har rapporterats tidigare 22,23,24,25,26, men ingen av dem är svinmodeller som involverar 8 veckors långtidsstudier. Kroniska sår är de som förblir öppna i 4 veckor eller mer 14,27,28. Det finns inga andra kroniska sårbiofilmmodeller rapporterade i litteraturen. Detta arbete behandlar begreppet funktionell sårförslutning 2,7,13,15,17,29. En studie som genomfördes 2014 var den första som rapporterade att biofilminfekterade sår kan stängas utan att barriärfunktionen7 återställs. Mätningen av hudbarriärens funktion i det läkande såret med hjälp av transepidermal vattenförlust (TEWL) rapporteras i detta arbete.

Anatomiskt och fysiologiskt är svinets hud, jämfört med huden hos andra smådjur, närmare den mänskliga huden32,33,34. Både grishud och mänsklig hud har en tjock epidermis 33, och tjockleksförhållandet mellan dermal och epidermal varierar från 10:1 till13:1 hos gris, vilket är jämförbart med 34,35 hos människor. Histologiskt och biomekaniskt visar huden hos människor och grisar likheter i rete-åsar, subdermalt fett, dermalt kollagen, hårfördelning, adnexala strukturer och blodkärlens storlek och fördelning36,37,38. Funktionellt delar både grisar och människor likheter i sammansättningen av lipid-, protein- och keratinkomponenterna i epidermisskiktet, såväl som jämförbara immunhistologiska mönster37,38. Grisars immunsystem, jämfört med andra smådjurs, har större likheter med människans immunsystem, vilket innebär att grisar är en lämplig modell för studier av värdinteraktioner som är integrerade i komplexiteten hos den patologiska biofilmen vid sårinfektioner39. Den kritiska bedömningen av för- och nackdelar med olika djurmodeller har lett till konsensus om att grisar utgör en effektiv modell för att studera sårläkning34,38. Dessutom utvecklar tamgrisar spontant kroniska bakterieinfektioner, vilket observerats hos människor10. Brännskadeanordningen som används för att skapa såren är en avancerad och automatiserad brännskadeanordning som levererar värmeenergi baserat på en temperaturavläsning från det riktade hudstället22,40. Ett sådant tillvägagångssätt förbättrar strängheten och reproducerbarheten av brännskadan. Användningen av humana kliniska isolat av bakterier för att infektera grissår ger mervärde som en preklinisk modell.

Brännskador är komplexa och orsakar flera systemiska störningar20,41. Därför är det viktigt att återuppliva grisen med tillräcklig vätska och förhindra hypotermi under anestesi och återhämtning. Flera faktorer kan störa sårläkningen, inklusive näring efter brännskada, vätska och smärta42. Det är därför viktigt att noggrant övervaka närings- och smärtbedömningarna. Smärta efter brännskador kan vara svår och påverka djurets beteende och kost. Interventioner för att ta itu med beteendeproblem måste övervägas aktivt. Regelbunden och kontinuerlig smärtbedömning och hantering är absolut nödvändigt. Ett grundligt smärtbedömningsblad med en mycket detaljerad smärthanteringsplan ingår i detta protokoll. För att undvika korskontaminering mellan såren bör särskild uppmärksamhet ägnas åt att applicera det första lagret av förbandet på varje sår separat. Kritisk försiktighet bör iakttas vid hantering av alla biologiskt farliga material och vid noggrann desinfektion av utrustning, verktyg och hela operationssalen. Appliceringen av flera lager av förbandet förhindrar att grisen exponerar såren under sina ansträngningar att gnugga eller klia tillbaka klådan.

Grisen i den aktuella modellen var inte komprometterad av underliggande metabola störningar (t.ex. diabetes), och därför var effekten som studerades enbart effekten av den bakteriella biofilminfektionen på sårläkning. Modellen lämpar sig dock för induktion av diabetes (med hjälp av streptozotocin till exempel) och skulle kunna användas för att studera biofilmsinfektion i relation till en underliggande metabol sjukdom. Den andra begränsningen i modellen är den kontrollerade infektionsinställningen med hjälp av bakterien P. aeruginosa. Det förväntas att grisens normala mikroflora i huden också kan växa i såret och påverka läkningen. Ytterligare analys med NGS eller andra avancerade tekniker för att avgränsa det mikrobiella innehållet i såret är nödvändig. Den nuvarande modellen kan också tillämpas på blandinfektioner med olika mikrobiella arter (t.ex. svamp, virus osv.). Detta är en viktig faktor, eftersom kliniskt relevanta sår sannolikt kommer att befolkas av blandade mikrober, vilket kan påverka sårläkningen på olika sätt.

Det finns många potentiella fördelar med denna modell, inklusive likheten med komplexiteten och de långsiktiga följdsjukdomarna hos mänskliga kroniska sår, den automatiserade och reproducerbara brännskadeprocessen och användningen av kliniskt isolerade bakteriearter. Användningen av flera icke-invasiva avbildningsmetoder representerar ett kraftfullt tillvägagångssätt för att samla in användbara fysiologiska data som karakteriserar såret. Slutligen är bedömningen av den funktionella sårläkningen genom återställande av hudens barriärfunktion baserat på TEWL avgörande. Sammanfattningsvis visas ett robust, enkelt, detaljerat och lättanvänt protokoll för att utveckla en biofilminfekterad allvarlig brännskada med hjälp av ett grismodellsystem i detta arbete.

Disclosures

Författarna redovisar inga motstridiga intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, för deras stöd och veterinärvård av djuren under studien. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health-anslagen NR015676, NR013898 och DK125835 och försvarsdepartementets anslag W81XWH-11-2-0142. Dessutom gynnades detta arbete av följande National Institutes of Health-utmärkelser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 och NS42617.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26x30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4x4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Svinmodell Biofilminfektion sårkronicitet värdimmunsystem kliniskt relevant preklinisk modell in vivo in vitro ex vivo korttidsstudie långtidsstudie hudbarriärfunktion funktionell sårförslutning osynliga sår metodologiska detaljer svår brännskada translationellt värde P. aeruginosa (PA01) 8 veckors infektion
Svinmodell av biofilminfektion och osynliga sår
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Masry, M., Bhasme, P.,… More

El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter