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Bioengineering

अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो और विवो में के लिए decellularized सेब व्युत्पन्न मचान

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65226
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4,5, 1,2,6,7
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

Summary

इस अध्ययन में, हम decellularization, शारीरिक लक्षण वर्णन, इमेजिंग, और संयंत्र आधारित biomaterials के vivo आरोपण के तरीकों, साथ ही सेल बोने और मचान में भेदभाव के लिए तरीकों का विस्तार. वर्णित विधियां हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पौधे आधारित बायोमैटेरियल्स के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं।

Abstract

प्लांट-व्युत्पन्न सेलूलोज़ बायोमैटेरियल्स को विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में नियोजित किया गया है। विवो अध्ययनों में प्राकृतिक स्रोतों से प्राप्त सेलूलोज़ से बने मचानों की उल्लेखनीय जैव-अनुकूलता दिखाई गई है। इसके अतिरिक्त, इन मचानों में संरचनात्मक विशेषताएं होती हैं जो कई ऊतकों के लिए प्रासंगिक होती हैं, और वे स्तनधारी कोशिकाओं के आक्रमण और प्रसार को बढ़ावा देती हैं। डिसेलुलराइज्ड सेब हाइपेंथियम ऊतक का उपयोग करते हुए हाल के शोध ने इसके छिद्र आकार की समानता को ट्रैब्युलर हड्डी के साथ-साथ ओस्टोजेनिक भेदभाव का प्रभावी ढंग से समर्थन करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। वर्तमान अध्ययन ने हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग (बीटीई) अनुप्रयोगों के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की क्षमता की जांच की और इन विट्रो और विवो मैकेनिकल गुणों में उनका मूल्यांकन किया। MC3T3-E1 प्रीओस्टियोब्लास्ट्स को सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में वरीयता दी गई थी जिन्हें तब उनकी ओस्टोजेनिक क्षमता और यांत्रिक गुणों के लिए मूल्यांकन किया गया था। क्षारीय फॉस्फेट और एलिज़रीन लाल एस धुंधला भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत मचानों में ओस्टोजेनिक भेदभाव की पुष्टि की। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा ने मचानों में व्यापक सेल आक्रमण और खनिजकरण का प्रदर्शन किया। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) ने मचानों की सतह पर खनिज समुच्चय का खुलासा किया, और ऊर्जा-फैलाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) ने फॉस्फेट और कैल्शियम तत्वों की उपस्थिति की पुष्टि की। हालांकि, सेल भेदभाव के बाद यंग के मापांक में उल्लेखनीय वृद्धि के बावजूद, यह स्वस्थ हड्डी के ऊतकों की तुलना में कम रहा। विवो अध्ययनों में सेल घुसपैठ और चूहे calvaria में आरोपण के 8 सप्ताह के बाद decellularized सेब व्युत्पन्न मचान के भीतर बाह्य मैट्रिक्स के जमाव से पता चला. इसके अलावा, हड्डी दोष से मचानों को हटाने के लिए आवश्यक बल देशी कैल्वरियल हड्डी के पहले रिपोर्ट किए गए फ्रैक्चर लोड के समान था। कुल मिलाकर, यह अध्ययन पुष्टि करता है कि सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ बीटीई अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार है। हालांकि, इसके यांत्रिक गुणों और स्वस्थ हड्डी के ऊतकों के बीच असमानता इसके आवेदन को कम लोड-असर परिदृश्यों तक सीमित कर सकती है। लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों के यांत्रिक गुणों को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त संरचनात्मक पुन: इंजीनियरिंग और अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।

Introduction

चोट या बीमारी के कारण होने वाले बड़े हड्डी दोषों को अक्सर पूर्ण पुनर्जनन के लिए बायोमटेरियल ग्राफ्ट की आवश्यकता होती है1. हड्डी के ऊतकों के उत्थान में सुधार के लिए डिज़ाइन की गई वर्तमान तकनीकें नियमित रूप से ऑटोलॉगस, एलोजेनिक, ज़ेनोजेनिक या सिंथेटिक ग्राफ्ट का उपयोग करती हैं2. ऑटोलॉगस बोन ग्राफ्टिंग के लिए, बड़े हड्डी दोषों को ठीक करने के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" ग्राफ्टिंग अभ्यास माना जाता है, रोगी से हड्डी निकाली जाती है। हालांकि, इस ग्राफ्टिंग प्रक्रिया में आकार और आकार की सीमाओं, ऊतक उपलब्धता और नमूना साइट रुग्णता3 सहित कई कमियां हैं। इसके अलावा, ऑटोलॉगस ग्राफ्टिंग प्रक्रियाएं सर्जिकल साइट संक्रमण, बाद में फ्रैक्चर, नमूना या पुनर्निर्माण स्थल पर हेमेटोमा गठन, और पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द4 के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग (बीटीई) पारंपरिक हड्डी ग्राफ्टिंग विधियों के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करता है5. यह नए कार्यात्मक हड्डी ऊतक के निर्माण के लिए संरचनात्मक बायोमैटिरियल्स और कोशिकाओं को जोड़ती है। बीटीई के लिए बायोमैटिरियल्स डिजाइन करते समय, एक मैक्रोपोरस संरचना, सतह रसायन विज्ञान को संयोजित करना महत्वपूर्ण है जो सेल लगाव को बढ़ावा देता है, और यांत्रिक गुण जो देशी हड्डी6 के समान होते हैं। पिछले शोध ने संकेत दिया है कि बीटीई में उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स के लिए आदर्श ताकना आकार और लोचदार मापांक क्रमशः ग्राफ्टिंग साइट8 के आधार पर लगभग 100-200 माइक्रोन7 और 0.1-20 जीपीए हैं। इसके अलावा, मचानों की सरंध्रता और ताकना इंटरकनेक्टिविटी सेल माइग्रेशन, पोषक तत्व प्रसार और एंजियोजेनेसिस8 को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं।

बीटीई ने हड्डी ग्राफ्ट के वैकल्पिक विकल्पों के रूप में विकसित और मूल्यांकन किए गए विभिन्न बायोमैटिरियल्स के साथ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। इनमें से कुछ बायोमैटेरियल्स ऑस्टियोइंडक्टिव सामग्री, हाइब्रिड सामग्री और उन्नत हाइड्रोजेलहैं 8. ऑस्टियोइंडक्टिव सामग्री नवगठित हड्डी संरचनाओं के विकास को उत्तेजित करती है। हाइब्रिड सामग्री सिंथेटिक और/या प्राकृतिक पॉलिमर से बनी होती है8. उन्नत हाइड्रोगेल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की नकल करते हैं और हड्डी के ऊतकोंके एकीकरण को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक बायोएक्टिव कारकों को वितरित करने में सक्षम हैं। हाइड्रोक्सीपाटाइट एक पारंपरिक सामग्री है और इसकी संरचना और जैव-अनुकूलता9 के कारण बीटीई के लिए एक आम विकल्प है। बायोएक्टिव ग्लास बीटीई के लिए बायोमेट्रिक का एक अन्य प्रकार है, जिसे ऑस्टियोजेनेसिस10,11के लिए आवश्यक जीन को सक्रिय करने के लिए विशिष्ट सेल प्रतिक्रियाओं को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है। पॉली (ग्लाइकोलिक एसिड) और पॉली (लैक्टिक एसिड) सहित बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, बीटीई अनुप्रयोगों में भी बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है12. अंत में, प्राकृतिक या स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न पॉलिमर जैसे चिटोसन, चिटिन और बैक्टीरियल सेलूलोज़ ने भी बीटीई13 के लिए उत्साहजनक परिणामों का प्रदर्शन किया है। हालांकि, जबकि सिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर दोनों बीटीई के लिए क्षमता दिखाते हैं, वांछित मैक्रोस्ट्रक्चर के साथ एक कार्यात्मक मचान के विकास के लिए आमतौर पर व्यापक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

इसके विपरीत, देशी मैक्रोस्कोपिक सेलूलोज़ संरचनाओं को विभिन्न पौधों से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और हमारे शोध समूह ने पहले पौधों से विभिन्न ऊतक पुनर्निर्माण के लिए प्राप्त सेलूलोज़-आधारित मचानों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया था। दरअसल, एक साधारण सर्फेक्टेंट उपचार के बाद, हमने पौधे की सामग्री की अंतर्निहित संरचना का उपयोग किया, एक बहुमुखी बायोमटेरियल14 के रूप में इसकी क्षमता को उजागर किया। इसके अलावा, इन सेलूलोज़ आधारित मचानों इन विट्रो स्तनधारी सेल संस्कृति अनुप्रयोगों14 में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, biocomcompatible हैं, और समर्थन सहज चमड़े के नीचे संवहनी 14,15,16,17. हमारे शोध समूह और अन्य दोनों ने प्रदर्शित किया है कि इन मचानों को इच्छित अनुप्रयोग 14,15,16,17,18,19,20 के आधार पर विशिष्ट पौधों से प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पौधे के तनों और पत्तियों में मनाया संवहनी संरचना पशु ऊतकों19 में पाया संरचना के लिए एक हड़ताली समानता प्रदर्शित करता है. इसके अतिरिक्त, पौधों से व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों को आसानी से आकार दिया जा सकता है और वांछित विशेषताओं16 को प्राप्त करने के लिए सतह जैव रासायनिक संशोधनों के अधीन किया जा सकता है। हाल के एक अध्ययन में, हम decellularization प्रक्रिया के दौरान एक नमक बफर शामिल, बढ़ाया सेल लगाव दोनों इन विट्रो में और विवो सेटिंग्स16 में मनाया. एक ही अध्ययन में, हमने मचानों की सतह पर हाइड्रोगेल कास्टिंग करके समग्र बायोमैटेरियल्स में पौधे-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया। हाल के अध्ययनों में, संयंत्र व्युत्पन्न मचानों के functionalization उनकी प्रभावशीलता18 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, फोंटाना एट अल (2017) द्वारा किए गए एक अध्ययन से पता चला है कि मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के आसंजन को आरजीडी-लेपित विकोशियीकृत उपजी द्वारा समर्थित किया गया था, जबकि गैर-लेपित उपजी समान क्षमता18 का प्रदर्शन नहीं करते थे। इसके अलावा, लेखकों ने यह भी प्रदर्शित किया कि संशोधित नकली शरीर के तरल पदार्थ का उपयोग कृत्रिम रूप से विकोशियीकृत पौधे के तनों को खनिज बनाने के लिए किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों में, हमने पौधे से व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में मेकेनोसेंसिटिव ओस्टोजेनेसिस की अवधारणा का पता लगाया और बीटीई17,20 के लिए उनकी क्षमता का आकलन किया। इसके अलावा, ली एट अल (2019) ने इन विट्रो सेटिंग21 में हड्डी जैसे ऊतकों की खेती करने के लिए पौधे-व्युत्पन्न मचानों का उपयोग किया। विभिन्न पौधों के स्रोतों के व्यापक मूल्यांकन के माध्यम से, लेखकों ने सेब-व्युत्पन्न मचानों को मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) की संस्कृति और भेदभाव के लिए सबसे इष्टतम के रूप में पहचाना। इसके अलावा, लेखकों ने प्रस्तावित किया कि सेब-व्युत्पन्न मचानों की संरचनात्मक और यांत्रिक विशेषताएं इच्छित उद्देश्य के लिए उनकी उपयुक्तता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में लागू प्रारंभिक पौधे व्युत्पन्न मचान होने के नाते, सेब-व्युत्पन्न मचानों को बड़े पैमाने पर मानव हड्डी के समान वास्तुकला के अधिकारी के रूप में दिखाया गया है, विशेष रूप से व्यास14,21 में 100 से 200 माइक्रोन तक के उनके परस्पर जुड़े छिद्रों के संदर्भ में।

वर्तमान अध्ययन में, हमने बीटीई के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की क्षमता की जांच की और इन विट्रो और विवो दोनों में उनके यांत्रिक गुणों का विश्लेषण किया। हालांकि बीटीई 17,20,21 के लिए सेब-व्युत्पन्न मचानों की क्षमता पर अध्ययन किया गया है, लेकिन उनके यांत्रिक गुणों की जांच की गई है। परिणामों ने MC3T3-E1 प्रीओस्टियोब्लास्ट्स के वाइल्डस्प्रेड आक्रमण और ओस्टोजेनिक भेदभाव को दिखाया, जो मचानों में वरीयता प्राप्त थे जो 4 सप्ताह के लिए भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत थे। इन मचानों का यंग मापांक 192.0 ± 16.6 kPa था, जो रिक्त मचानों (बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान) (31.6 ± 4.8 kPa) और गैर-भेदभाव माध्यम (24.1 ± 8.8 kPa) में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों की तुलना में काफी अधिक था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्वस्थ मानव हड्डी ऊतक के यंग मापांक आम तौर पर त्रिकोणीय हड्डी के लिए 0.1-2 GPa और cortical हड्डी8 के लिए लगभग 15-20 GPa की सीमा के भीतर गिर जाता है. फिर भी, एक कृंतक कैल्वरियल दोष में 8 सप्ताह के आरोपण के बाद, सेल-सीडेड मचान आसपास की हड्डी में अच्छी तरह से एकीकृत दिखाई दिए, जैसा कि पुश-आउट परीक्षणों में 113.6 एन ± 18.2 एन के औसत शिखर बल द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जो देशी कैल्वरियल हड्डी22 के पहले रिपोर्ट किए गए फ्रैक्चर लोड के समान है। कुल मिलाकर, इस अध्ययन से प्राप्त परिणाम महत्वपूर्ण वादा दिखाते हैं, विशेष रूप से गैर-लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए। हालांकि, सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों में वर्तमान में एक प्रत्यारोपण स्थल पर आसपास के हड्डी के ऊतकों से ठीक मेल खाने के लिए आवश्यक यांत्रिक गुण नहीं हैं। नतीजतन, इन मचानों की पूरी क्षमता को अनलॉक करने के लिए और विकास की आवश्यकता है।

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Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और ओटावा पशु देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. पाड़ की तैयारी

  1. मैकिन्टोश सेब (कनाडा फैंसी) को 8 मिमी-मोटी स्लाइस में काटने के लिए मैंडोलिन स्लाइसर का उपयोग करें। सेब के स्लाइस के हाइपेंथियम ऊतक को 5 मिमी x 5 मिमी वर्गों में काटें।
  2. 2 दिनों के लिए 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) में वर्ग नमूने रखें।
  3. विआयनीकृत पानी के साथ विकोशियीकृत नमूने धो लें और शेष सर्फेक्टेंट को हटाने के लिए 100 मिमी CaCl2 में कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर उन्हें सेते हैं।
  4. 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में नमूने (यानी, मचान) निष्फल करें, उन्हें विआयनीकृत पानी से धो लें, और सेल सीडिंग से पहले उन्हें 24-अच्छी संस्कृति प्लेट में रखें।

2. सेल संस्कृति और पाड़ सीडिंग

  1. सेल कल्चर स्थितियों में 10 सेमी व्यास सेल संस्कृति-उपचारित व्यंजनों में MC3T3-E1 सबक्लोन 4 कोशिकाओं को बनाए रखें (95% हवा और 5% CO2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस)।
  2. ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम से बने सेल कल्चर माध्यम तैयार करें - अल्फा संशोधन (α-एमईएम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  3. एक बार वे 80% संगम तक पहुँचने के बाद trypsinization (0.05% trypsin-EDTA) द्वारा संस्कृति व्यंजन से कोशिकाओं को अलग करें.
  4. 3 मिनट के लिए सीए 200 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 2.5 x 107 एमएल प्रति कोशिकाओं पर α एमईएम में कोशिकाओं resuspend.
  5. पिपेट मचानों की सतह पर सेल निलंबन के एक 40 माइक्रोन विभाज्य है, और कोशिकाओं सेल संस्कृति की स्थिति में 1 घंटे के लिए पालन करते हैं. इसके बाद, संस्कृति प्लेट के प्रत्येक संस्कृति अच्छी तरह से करने के लिए संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें.
  6. 14 दिनों के लिए हर 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम को फिर से भरें।
  7. पहले वर्णित सेल संस्कृति माध्यम में 50 माइक्रोग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड और 4 एमएम सोडियम फॉस्फेट जोड़कर एक भेदभाव माध्यम तैयार करें।
  8. 4 सप्ताह के लिए भेदभाव माध्यम में मचानों को इनक्यूबेट करके MC3T3-E1 कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करें। हर 3-4 दिनों में माध्यम को फिर से भरें। समानांतर में, एक ही अवधि के लिए एक ही अवधि के लिए गैर-भेदभाव संस्कृति माध्यम (यानी, भेदभाव को प्रेरित करने के लिए पूरक के बिना मध्यम) में मचानों को सेते हैं, एक ही मध्यम परिवर्तन अनुसूची के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।

3. कंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छिद्र आकार माप

  1. फॉस्फेट-बफर-खारा (पीबीएस) के साथ विकोशियीकृत सेब-व्युत्पन्न मचानों को धोएं।
  2. आरटी पर अंधेरे में 25 मिनट के लिए 10% (वी / वी) calcofluor सफेद दाग के 1 एमएल में मचान सेते हैं.
  3. पीबीएस के साथ मचानों (एन = 3) को धोएं और एक डीएपीआई चैनल का उपयोग करके, 10x आवर्धन पर एक उच्च गति गुंजयमान कंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) के साथ पाड़ प्रति तीन बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों को धोएं, निम्नानुसार है:
    1. लेजर-उत्सर्जन फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन: 405 एनएम (लेजर); 425-475 एनएम (उत्सर्जन)
    2. इष्टतम छवि अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल रूप से लेजर पावर और डिटेक्टर समायोजित करें। एक 5 सुक्ष्ममापी कदम आकार के साथ 20 छवियों की एक जेड ढेर प्राप्त करें.
  4. ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, निम्नानुसार कॉन्फ़ोकल छवियों की प्रक्रिया और विश्लेषण करें:
    1. छवि बनाने के लिए Z-Project to Maximum Intensity फ़ंक्शन का उपयोग करें, और छिद्रों के किनारे को हाइलाइट करने के लिए Find Edges फ़ंक्शन लागू करें।
    2. फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके मैन्युअल रूप से छिद्रों को ट्रेस करें।
    3. प्रत्येक छिद्र को दीर्घवृत्त के रूप में फिट करें, प्रमुख अक्ष की लंबाई को मापें, सभी मापों को संकलित करें (वर्तमान अध्ययन में कुल 54 - प्रत्येक मचान के लिए 3 यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों में 6), और औसत लंबाई की गणना करें।

4. कंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल वितरण विश्लेषण

  1. सेल बीज वाले मचानों को पीबीएस के साथ तीन बार गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत करें। 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ scaffolds फिक्स.
  2. विआयनीकृत पानी के साथ प्रत्येक पाड़ को अच्छी तरह से धो लें, 5 मिनट के लिए ट्राइटन-एक्स 100 समाधान के साथ कोशिकाओं को पारगम्य करें, और पीबीएस के साथ फिर से धो लें।
  3. 40 मिनट के लिए 1% आवधिक एसिड के 1 एमएल में मचानों को इनक्यूबेट करें और विआयनीकृत पानी14,16 से कुल्ला।
  4. 100 एमएम सोडियम मेटाबाइसल्फाइट और 0.15 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड युक्त समाधान के 1 एमएल में मचानों को इनक्यूबेट करें, जो 100 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ पूरक है। समाधान में मचानों को पूरी तरह से विसर्जित करें।
  5. पीबीएस के साथ मचानों को धोएं और अंधेरे में 10 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल डीएपीआई समाधान में मचानों को इनक्यूबेट करके सेल नाभिक को दाग दें। अच्छी तरह से फिर से धो लें और इमेजिंग से पहले पीबीएस में मचानों की दुकान।
  6. छवि तीन अलग-अलग सेल-सीडेड मचानों की तीन बेतरतीब ढंग से चयनित सतहों को 10x आवर्धन पर एक उच्च गति गुंजयमान सीएलएसएम के साथ, डीएपीआई और टीआरआईटीसी चैनलों का उपयोग करते हुए, निम्नानुसार है:
    1. लेजर-उत्सर्जन फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन:
      डीएपीआई: लेजर: 405 एनएम; उत्सर्जन: 425-475 एनएम
      TRITC: लेजर: 561 एनएम; उत्सर्जन: 570-620 एनएम
    2. इष्टतम छवि अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल रूप से लेजर पावर और डिटेक्टर समायोजित करें। एक 5 सुक्ष्ममापी कदम आकार के साथ 20 छवियों की एक जेड ढेर प्राप्त करें.
  7. कन्फोकल छवियों को संसाधित करने और जेड-प्रोजेक्ट से अधिकतम तीव्रता फ़ंक्शन का उपयोग करके छवि विश्लेषण के लिए जेड-अक्ष में अधिकतम प्रक्षेपण बनाने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

5. क्षारीय फॉस्फेट विश्लेषण

  1. सेल बीज वाले मचानों को पीबीएस के साथ तीन बार गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत करें। 30 मिनट के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन के साथ मचानों को ठीक करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए खाली मचान (बीज कोशिकाओं के बिना मचान) को ठीक करें।
  2. विआयनीकृत पानी के 10 एमएल में एक बीसीआईपी / एनबीटी टैबलेट को भंग करके 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3'-इंडोलीफॉस्फेट और नाइट्रो-ब्लू टेट्राज़ोलियम (बीसीआईपी / एनबीटी) धुंधला समाधान तैयार करें।
  3. एक 0.05% ट्वीन समाधान के साथ तय मचानों को धो लें और आरटी पर 20 मिनट के लिए बीसीआईपी/एनबीटी समाधान के साथ दाग दें।
  4. 12-मेगापिक्सेल डिजिटल कैमरे के साथ सना हुआ मचानों की छवि।

6. कैल्शियम जमाव विश्लेषण

  1. सेल बीज वाले मचानों को पीबीएस के साथ तीन बार गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत करें। 30 मिनट के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन के साथ मचानों को ठीक करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए खाली मचान (बीज कोशिकाओं के बिना मचान) को ठीक करें।
  2. एक 2% (डब्ल्यू / वी) एलिज़रीन लाल एस (एआरएस) धुंधला समाधान तैयार करें।
  3. विआयनीकृत पानी के साथ तय मचानों धो लें और आरटी पर 1 घंटे के लिए एआरएस समाधान के साथ उन्हें दाग दें।
  4. 12-मेगापिक्सेल डिजिटल कैमरे के साथ सना हुआ मचानों की छवि।

7. खनिज विश्लेषण

  1. सेल बीज वाले मचानों को पीबीएस के साथ तीन बार गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत करें। 48 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ मचानों को ठीक करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए खाली मचान (बीज कोशिकाओं के बिना मचान) को ठीक करें।
  2. इथेनॉल की सांद्रता युक्त समाधान में नमूनों निर्जलीकरण 50% से 100% तक, के रूप में पहले वर्णित23.
  3. खनिज समुच्चय का विश्लेषण करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) और ऊर्जा-फैलाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) निम्नानुसार करें:
    1. एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर का उपयोग कर नमूने सूखी, निर्माता के प्रोटोकॉल24 के बाद.
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल25 के बाद, सोने की स्पटर कोटर का उपयोग करके मचानों पर 5-एनएम सोने का कोट लागू करें।
    3. 85x आवर्धन पर 3 केवी पर सेट स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ मचानों की सतह की छवि।
    4. 15 केवी पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की स्थापना द्वारा ईडीएस प्रदर्शन. मचान प्रति तीन यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों पर, खनिज कुल संरचना विश्लेषण के लिए ईडीएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।

8. यंग के मापांक माप

  1. सेल बीज वाले मचानों को उनके संबंधित इनक्यूबेशन माध्यम से निकालें और तुरंत नमूनों का परीक्षण करें।
  2. 1.5 एन लोड सेल से लैस कस्टम-निर्मित एकअक्षीय संपीड़न उपकरण का उपयोग करके, मचान ऊंचाई के 10% के अधिकतम संपीड़ित तनाव के लिए 3 मिमी · मिनट -1 की निरंतर दर पर मचानों (एन = 3 प्रति स्थिति) को संपीड़ित करें।
  3. तनाव-विकृति वक्रों के रैखिक भाग के ढलान से यंग मापांक ज्ञात कीजिए। वर्तमान अध्ययन में, मापांक 9% और 10% तनाव के बीच निर्धारित किया गया था।

9. ऊतक विज्ञान द्वारा सेल घुसपैठ और खनिजकरण विश्लेषण: इन विट्रो मचानों में

  1. सेल बीज वाले मचानों को पीबीएस के साथ तीन बार गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत करें।
  2. भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में पुन: निलंबन से पहले 48 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ सेल-सीडेड मचानों को ठीक करें।
  3. प्रोटोकॉल:
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, अगले चरणों में वर्णित संपूर्ण हिस्टोलॉजिकल तैयारी (एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और धुंधला) लुईस पेलेटियर हिस्टोलॉजी कोर फैसिलिटी (ओटावा विश्वविद्यालय) द्वारा किया गया था।
    1. निर्जलीकरण और पैराफिन में एम्बेडिंग के बाद, मचानों के अंदर 1 मिमी शुरू, 5-माइक्रोन मोटी धारावाहिक वर्गों में नमूने कटौती, और खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों माउंट.
    2. hematoxylin और eosin के साथ वर्गों दाग (एच एंड ई) या वॉन कोसा (वीके) दाग.
    3. 40x आवर्धन पर एक स्लाइड स्कैनर माइक्रोस्कोप के साथ वर्गों की छवि (गैर-भेदभाव माध्यम में एन = 1 मचान और वर्तमान अध्ययन में भेदभाव माध्यम में एन = 2 मचान)।
    4. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, नेत्रहीन सेल घुसपैठ (एच एंड ई धुंधला हो जाना) और खनिज (वीके धुंधला) का मूल्यांकन.

10. चूहा calvarial दोष मॉडल

  1. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा करें और स्थानीय पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित करें।
  2. ऊपर वर्णित धारा 1 के बाद परिपत्र (5 मिमी व्यास और 1 मिमी मोटाई) decellularized मचान तैयार करें और एक 5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग कर.
  3. एक स्थापित प्रोटोकॉल26 के बाद द्विपक्षीय क्रैनियोटॉमी करें, निम्नानुसार है:
    1. आइसोफ्लुरेन के साथ नर स्प्रैग-डॉली चूहों को एनेस्थेटाइज करें, पहले 3% पर जब तक वे बेहोश न हों, और फिर प्रक्रिया के दौरान 2-3% पर।
    2. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग overlying त्वचा काटने के द्वारा periosteum और कपाल बेनकाब. पेरीओस्टेम निकालें।
    3. 0.9% NaCl की निरंतर सिंचाई के तहत एक 5 मिमी व्यास trephine के साथ सुसज्जित एक दंत ड्रिल का उपयोग कर बाण के दोनों पार्श्विका हड्डियों में द्विपक्षीय दोष बनाएँ.
    4. किसी भी हड्डी के टुकड़े को हटाने के लिए 0.9% NaCl के साथ आसपास की हड्डी को साफ करें।
    5. दोषों में गोलाकार, विकोशियीकृत मचानों रखें।
    6. 4-0 टांके के साथ ऊपरी त्वचा को बंद करें।
  4. चूहों को भोजन और पानी तक असीमित पहुंच दें और उनकी दैनिक निगरानी करें।
  5. 8 सप्ताह के बाद आरोपण के बाद, सीओ2 साँस लेना और वक्ष वेध द्वारा चूहों को एक माध्यमिक इच्छामृत्यु उपाय के रूप में इच्छामृत्यु करें।
  6. कपाल बेनकाब और प्रत्यारोपण पुनः प्राप्त करने के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग खोपड़ी को कवर त्वचा को हटा दें.
  7. खोपड़ी के शीर्ष भाग को पूरी तरह से हटाने के लिए दंत ड्रिल का उपयोग करके ललाट और पश्चकपाल हड्डियों पर और दोनों पार्श्विका हड्डियों के किनारे पर खोपड़ी को काटें।

11. पुश-आउट टेस्ट

  1. USB-डेटा प्राप्ति मॉड्यूल के लिए एक एकअक्षीय संपीड़न डिवाइस (445 N लोड सेल के साथ) कनेक्ट करें।
  2. डेटा अधिग्रहण मॉड्यूल को डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन से लैस कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
  3. इसके तत्काल बाद कपाल निष्कर्षण के बाद, प्रत्येक नमूना जगह (एन = 7 वर्तमान अध्ययन में 4 जानवरों से प्रत्यारोपण) uniaxial संपीड़न डिवाइस के नमूना धारक पर इतना है कि हड्डी के पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है.
  4. 0.5 मिमी/मिनट पर सवार कम जब तक थोड़ा निकाले प्रत्यारोपण को छू.
  5. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 0.5 मिमी/मिनट की एक निरंतर गति से संपीड़न लागू करते हुए पूरा धक्का बाहर तक प्रत्यारोपण के माध्यम से सवार को कम करके परीक्षण आरंभ करें.
  6. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बल बनाम विस्थापन वक्र पर शिखर बल रिकॉर्ड.

12. ऊतक विज्ञान द्वारा सेल घुसपैठ और खनिजकरण विश्लेषण: विवो मचानों में

  1. निकाले गए कैल्वरिया और प्रत्यारोपण को 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में 72 घंटे के लिए 70% भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में पुन: निलंबित करने से पहले ठीक करें।
  2. प्रोटोकॉल:
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, अगले चरणों में वर्णित सभी हिस्टोलॉजिकल तैयारी (एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और धुंधला) एक्सेल लैब्स (मॉन्ट्रियल, क्यूसी, कनाडा) द्वारा किया गया था।
    1. तीन अलग अलग स्तरों (ऊपर, नीचे, और केंद्र की ओर) पर 6 माइक्रोन मोटी वर्गों में नमूने (मिथाइल methacrylate में एम्बेडेड) कटौती और खुर्दबीन स्लाइड पर उन्हें माउंट.
    2. एच एंड ई या मेसन-गोल्डनर के ट्राइक्रोम (एमजीटी) के साथ वर्गों को दाग दें।
  3. 40x आवर्धन (वर्तमान अध्ययन में 2 जानवरों से 4 explants) पर एक स्लाइड स्कैनर माइक्रोस्कोप के साथ वर्गों छवि.
  4. ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग, नेत्रहीन सेल घुसपैठ (एच & ई धुंधला हो जाना) और कोलेजन बयान (MGT धुंधला हो जाना) मूल्यांकन.

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Representative Results

ताकना आकार माप, सेल वितरण, और इन विट्रो खनिजकरण में (चित्रा 1 और चित्रा 2)
सेब ऊतक मचानों के देशी सेलुलर घटकों का पूरा हटाने एसडीएस और सीएसीएल2 (चित्रा 1ए)के साथ मचानों के इलाज के बाद हासिल किया गया था। मचानों ने एक अत्यधिक छिद्रपूर्ण संरचना का प्रदर्शन किया, जिसकी पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की गई थी। छवियों की मात्रा का ठहराव 154 माइक्रोन ± 40 माइक्रोन के औसत ताकना आकार का प्रदर्शन किया. ताकना आकार वितरण 73 माइक्रोन और 288 माइक्रोन के बीच था। हालांकि, अधिकांश छिद्र 100 माइक्रोन और 200 माइक्रोन(चित्रा 1सी)के बीच थे।

भेदभाव माध्यम में एक 4 सप्ताह संस्कृति अवधि के बाद, सेल बीज वाले मचानों व्यापक सफेद खनिज जमा(चित्रा 1 ए)का प्रदर्शन किया. कोशिकाओं वाले मचानों ने एक अपारदर्शी सफेद रंग प्रदर्शित किया, जो खनिजकरण का सुझाव देता है, जो खाली मचानों (बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान) में नहीं देखा गया था। इसके अलावा, कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण ने मचानों के भीतर एक सजातीय सेल वितरण का खुलासा किया (चित्र 1बी)।

कोशिकाओं के साथ बीज वाले या नहीं मचानों को क्रमशः एएलपी गतिविधि और खनिजकरण(चित्रा 1डी)का विश्लेषण करने के लिए बीसीआईपी/एनबीटी और एआरएस के साथ दाग दिया गया था। बीएसीपी/एनबीटी धुंधला हो जाना भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल बीज वाले मचानों के भीतर एएलपी गतिविधि (एक मजबूत बैंगनी रंग द्वारा चित्रित) में पर्याप्त वृद्धि का पता चला, रिक्त मचानों या गैर-भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल बीज वाले मचानों के विपरीत। इसी तरह, भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल बीज वाले मचानों ने एआरएस के साथ धुंधला होने पर अधिक तीव्र लाल रंग का प्रदर्शन किया, जो खाली मचानों या गैर-भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों की तुलना में अधिक खनिजकरण का संकेत देता है। पृष्ठभूमि धुंधला रिक्त मचानों में मनाया गया था, संभवतः विसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल में CaCl2 की उपस्थिति के कारण।

सेल घुसपैठ और खनिजकरण का विश्लेषण करने के लिए मचानों पर धुंधला (एच एंड ई और वीके) किया गया था, और एसईएम और ईडीएस का उपयोग खनिजकरण(चित्रा 2)का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एच&ई धुंधला हो जाना(चित्रा 2ए)गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल-बीज वाले मचानों में अच्छा सेल घुसपैठ दिखाया। परिधि में और मचानों में कई नाभिक दिखाई दे रहे थे। हल्के गुलाबी रंग में मचानों में कोलेजन की उपस्थिति भी देखी गई। इसके अलावा, भेदभाव माध्यम में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद मचानों पर किए गए वीके धुंधला होने से पता चला कि छिद्र की दीवारें दाग दी गई थीं, जबकि कैल्शियम जमा पूरी तरह से गैर-भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत मचानों में छिद्र दीवारों के बाहरी किनारों के साथ पाया गया था और हो सकता है विकोशियीकरण उपचार के दौरान कैल्शियम अवशोषण के परिणामस्वरूप। 4 सप्ताह के लिए भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल बीज वाले मचानों की सतह पर स्थानीयकृत खनिजकरण एसईएम विश्लेषण(चित्रा 2बी)द्वारा देखा गया था। अधिक विशेष रूप से, छिद्रों की परिधि पर गोलाकार समुच्चय जैसा दिखने वाला खनिज जमा देखा गया। इसके विपरीत, खाली मचानों या गैर-भेदभाव माध्यम में 4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत सेल-बीज वाले मचानों पर कोई खनिज समुच्चय नहीं देखा गया था। फॉस्फोरस (पी) और कैल्शियम (सीए) के अनुरूप विशिष्ट विशेषता चोटियों को ब्याज के चयनित क्षेत्रों के ईडीएस स्पेक्ट्रा में देखा गया था, विशेष रूप से भेदभाव माध्यम (चित्रा 2बी) में 4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों पर देखे गए खनिज जमा पर।

इन विट्रो बायोमेकेनिकल विश्लेषण (चित्रा 3) में
सेल बीज वाले मचानों के यंग के मापांक को गैर-भेदभाव या भेदभाव माध्यम (प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए एन = 3) में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद मापा गया था। इसकी तुलना यंग के रिक्त मचानों (बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान) के मापांक से की गई थी (चित्र 3)। रिक्त मचानों (31.6 kPa ± 4.8 kPa) और गैर-भेदभाव माध्यम (24.1 kPa ± 8.8 kPa; पी = 0.88)। इसके विपरीत, रिक्त मचानों (31.6 kPa ± 4.8 kPa) के मापांक और भेदभाव माध्यम (192.0 kPa ± 16.6 kPa) में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नोट किया गया था; पी < 0.001)। इसके अतिरिक्त, एक महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.001) गैर-भेदभाव और भेदभाव मीडिया में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों के यंग के मॉड्यूली के बीच देखा गया था। पूरक चित्रा 1 यंग के मापांक गणना के लिए एक विशिष्ट तनाव-तनाव वक्र दिखाता है।

विवो बायोमेकेनिकल प्रदर्शन और हड्डी पुनर्जनन (चित्रा 4 और चित्रा 5) में
सर्जिकल क्रैनियोटॉमी कुल 6 स्प्रैग-डॉली चूहों पर आयोजित की गई थी। द्विपक्षीय 5 मिमी व्यास दोष एक ट्रेफिन bur का उपयोग कर खोपड़ी के दोनों पार्श्विका हड्डियों में बनाया गया था, और बीज कोशिकाओं के बिना सेब व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचान calvarial दोष(चित्रा 4A)में प्रत्यारोपित किया गया. आरोपण के 8 सप्ताह बाद, जानवरों को इच्छामृत्यु दी गई थी, और उनकी खोपड़ी के ऊपरी हिस्से को यांत्रिक परीक्षण या हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एकत्र और संसाधित किया गया था।

दृश्य मूल्यांकन के आधार पर, मचान खोपड़ी के आसपास के ऊतकों में अच्छी तरह से एकीकृत लग रहा था। मेजबान कैल्वेरिया में मचानों (एन = 7) के एकीकरण का मात्रात्मक आकलन करने के लिए मैकेनिकल पुश-आउट परीक्षण किए गए थे। माप जानवरों की इच्छामृत्यु के तुरंत बाद एक अनियाक्सियल संपीड़न उपकरण(चित्रा 4बी)का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। परिणामों से पता चला कि शिखर बल 113.6 एन ± 18.2 एन (तालिका 1) था।

प्रत्यारोपित मचानों(चित्रा 5)के भीतर सेल घुसपैठ और बाह्य मैट्रिक्स के जमाव का आकलन करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण आयोजित किया गया था। एच एंड ई धुंधला मचान छिद्रों के भीतर सेलुलर घुसपैठ और संवहनी के सबूत का पता चला, जैसा कि मचानों के भीतर रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति से दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एमजीटी धुंधला मचानों के भीतर कोलेजन की उपस्थिति का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: पाड़ छवियों, ताकना आकार वितरण, और इन विट्रो खनिज में . (ए) देशी कोशिकाओं और सर्फेक्टेंट (बाएं) को हटाने के बाद एक सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचान की प्रतिनिधि तस्वीरें और ओस्टोजेनिक भेदभाव माध्यम (दाएं) में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद MC3T3-E1 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक मचान। स्केल बार 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) प्रतिनिधि कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप छवियों गैर भेदभाव माध्यम ("एनडी") या osteogenic भेदभाव माध्यम ("डी") में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद सेब व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचान में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं दिखा छवियों. स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके सेलूलोज़ (लाल) के लिए और डीएपीआई का उपयोग करके सेल नाभिक (नीला) के लिए मचानों पर धुंधला हो जाना किया गया था। (सी)विकोशियीकृत सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों का छिद्रित आकार वितरण, MC3T3-E1 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त होने से पहले, कन्फोकल छवियों के z-अक्ष में अधिकतम अनुमानों से। विश्लेषण 3 अलग-अलग मचानों में कुल 54 छिद्रों पर किया गया था (मचान प्रति ब्याज के 3 यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों में 6 छिद्र)। (डी)5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3'-इंडोलीफॉस्फेट और नाइट्रो-ब्लू टेट्राजोलियम (बीसीआईपी/एनबीटी) के साथ दाग मचानों की प्रतिनिधि छवियां क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि का आकलन करने के लिए और एलिज़रीन लाल एस (एआरएस) के साथ कैल्शियम जमाव की कल्पना करने के लिए, खनिज का संकेत (स्केल बार = 2 मिमी - सभी पर लागू होता है)। "रिक्त" (बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान) के रूप में लेबल किए गए मचानों ने बीसीआईपी/एनबीटी के साथ कोई धुंधला नहीं दिखाया, जो एएलपी गतिविधि की अनुपस्थिति का संकेत देता है। दूसरी ओर, सेल वरीयता प्राप्त मचानों भेदभाव माध्यम ("डी") में सुसंस्कृत उच्च एएलपी गतिविधि प्रदर्शित, एक और अधिक तीव्र नीले रंग द्वारा संकेत, गैर भेदभाव माध्यम ("एनडी") में सुसंस्कृत सेल वरीयता प्राप्त मचानों की तुलना में. एआरएस धुंधला हो जाना के लिए, दोनों खाली मचानों और गैर-भेदभाव माध्यम ("एनडी") में सुसंस्कृत मचानों ने भेदभाव माध्यम ("डी") में सुसंस्कृत मचानों की तुलना में लाल रंग की एक हल्की छाया का प्रदर्शन किया। भेदभाव माध्यम ("डी") में सुसंस्कृत मचानों में कैल्शियम जमाव की उपस्थिति एक तीव्र गहरे लाल रंग द्वारा चित्रित किया गया था। प्रत्येक विश्लेषण तीन अलग मचानों (एन = 3) पर प्रदर्शन किया गया था. यह आंकड़ा लेब्लांक लाटौर (2023)27 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हिस्टोलॉजी, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), और ऊर्जा-फैलाने वाले स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस) इन विट्रो मचानों का विश्लेषण। (ए) मचानों के शीर्ष हिस्टोलॉजिकल क्रॉस-सेक्शन की प्रतिनिधि छवियां। पैराफिन-एम्बेडेड मचानों को 5-माइक्रोन मोटी वर्गों में कटा हुआ था जो सेल घुसपैठ की कल्पना करने के लिए हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिए गए थे, या मचानों के भीतर खनिजकरण की कल्पना करने के लिए वॉन कोसा (वीके) के साथ। मचानों को MC3T3-E1 कोशिकाओं के साथ घुसपैठ किया गया था, जैसा कि परिधि पर और मचानों में दिखाई देने वाले नीले (नाभिक) और गुलाबी (साइटोप्लाज्म) धुंधला द्वारा दिखाया गया है। कोलेजन (पीला गुलाबी) भी दिखाई दे रहा था ("एच एंड ई - डी" का ज़ूम-इन इनसेट)। खनिजकरण केवल गैर-भेदभाव माध्यम ("एनडी") में सुसंस्कृत मचानों में छिद्र दीवारों की परिधि पर देखा गया था। भेदभाव माध्यम ("डी") में सुसंस्कृत मचानों में छिद्र की दीवारें पूरी तरह से काले रंग में दाग गई थीं। विश्लेषण गैर-भेदभाव माध्यम ("एनडी") में सुसंस्कृत एक मचान पर किया गया था और भेदभाव माध्यम ("डी") में सुसंस्कृत दो मचानों पर (कम आवर्धन चित्रों के लिए स्केल बार = 1 मिमी, उच्च आवर्धन चित्रों के लिए स्केल बार = 50 माइक्रोन)। (बी) एसईएम के साथ-साथ ईडीएस स्पेक्ट्रा द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। मचानों सोने के साथ स्पटर कोटिंग से गुजरना पड़ा और 3.0 केवी (स्केल बार = 100 माइक्रोन - सभी पर लागू) के वोल्टेज पर एक क्षेत्र-उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके imaged किया गया। प्रत्येक मचान पर ईडीएस स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण किया गया था। फास्फोरस (2.013 keV) और कैल्शियम (3.69 keV) चोटियों को प्रत्येक ईडीएस स्पेक्ट्रम पर दर्शाया जाता है। एसईएम और ईडीएस दोनों को तीन अलग-अलग मचानों पर किया गया था। रिक्त: बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान। यह आंकड़ा लेब्लांक लाटौर (2023)27 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: गैर-भेदभाव माध्यम ("एनडी") या भेदभाव माध्यम ("डी") में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद इन विट्रो मचानों में यंग का मॉड्यूली। डेटा को प्रत्येक स्थिति के लिए तीन प्रतिकृति नमूनों के माध्य (एसईएम) के माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व (* इंगित करता है p<0.05) विचरण (एनोवा) और टुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। रिक्त: बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचान। यह आंकड़ा लेब्लांक लाटौर (2023)27 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आरोपण के 8 सप्ताह के बाद आरोपण और पुश-आउट परीक्षण से पहले पाड़ फोटोग्राफ: (ए) आरोपण से पहले एक मचान की प्रतिनिधि तस्वीर; (बी) पुश-आउट परीक्षणों के लिए उपयोग किया जाने वाला एकअक्षीय संपीड़न उपकरण, एक तारांकन (*) द्वारा इंगित लोड सेल और एक तीर द्वारा इंगित नमूना के साथ। यह आंकड़ा लेब्लांक लाटौर (2023)27 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इन विट्रो मचानों में हिस्टोलॉजी विश्लेषण। आरोपण के 8 सप्ताह के बाद गैर-बीज वाले मचानों से हिस्टोलॉजिकल क्रॉस-सेक्शन की प्रतिनिधि छवियां। कोलेजन की कल्पना करने के लिए कोशिकाओं या मेसन-गोल्डनर के ट्राइक्रोम (एमजीटी) की कल्पना करने के लिए वर्गों को या तो हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया था। तीर लाल रक्त कोशिकाओं को इंगित करता है। कोलेजन की उपस्थिति दिखाई देती है (क्रमशः बाएं और दाएं इनसेट के लिए स्केल बार = 1 मिमी और 200 माइक्रोन)। यह आंकड़ा लेब्लांक लाटौर (2023)27 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना संख्या पीक बल (एन)
1 92.8
2 162.7
3 140.3
4 135.7
5 37.7
6 157.8
7 67.9
औसत 113.6
एसईएम 18.2

तालिका 1: पुश-आउट परीक्षणों से मापा गया शिखर बल।

अनुपूरक चित्रा 1: यंग के मापांक गणना के लिए विशिष्ट तनाव-तनाव वक्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इन विट्रो और विवो अध्ययनों में कई ने पौधे से व्युत्पन्न सेलूलोज़ की जैव-अनुकूलता और ऊतक इंजीनियरिंग 14,15,16,18,19,20 में इसके संभावित उपयोग का प्रदर्शन किया है, विशेष रूप से ओस्टोजेनिक भेदभाव 20,21 की मेजबानी के लिए. वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य बीटीई के लिए सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की क्षमता की जांच करना और इन विट्रो और विवो दोनों में इन मचानों के यांत्रिक गुणों का आकलन करना था।

इन विट्रो अध्ययनों के लिए, प्रीओस्टियोब्लास्ट कोशिकाओं (MC3T3-E1) को सेब के ऊतकों से देशी कोशिकाओं को खत्म करने के बाद मचानों में वरीयता दी गई थी। MC3T3-E1 कोशिकाओं का उपयोग आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स 28,29,30 के बायोमिनरलाइजेशन की जांच के लिए किया जाता है। मचानों को तब ओस्टोजेनिक भेदभाव या गैर-भेदभाव माध्यम में 4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया था। निष्कर्षों ने संकेत दिया कि कोशिकाओं ने मचानों के भीतर प्रसार किया और भेदभाव किया, खासकर जब भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत किया गया, इस प्रकार हड्डी के ऊतकों के विकास का समर्थन करने के लिए सेब से प्राप्त सेलूलोज़ मचानों की क्षमता को उजागर किया। सेल नाभिक मचान छिद्रों में बड़ी संख्या में देखे गए, पहले के अध्ययनों 14,15,16,17,20,21में रिपोर्ट किए गए टिप्पणियों की पुष्टि करते हुए। इसके अलावा, हमारे पिछले निष्कर्षों14 और एक अन्य समूह21 के समान, मचान छिद्रों का औसत व्यास ~ 154 माइक्रोन था, जिसमें 100 माइक्रोन और 200 माइक्रोन(चित्रा 1सी)के बीच व्यास वाले अधिकांश छिद्र थे। ये आयाम हड्डीके विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए ज्ञात आदर्श ताकना आकार सीमा (100-200 माइक्रोन) के साथ समझौते में हैं।

धुंधला विश्लेषण भेदभाव माध्यम में एक 4 सप्ताह संस्कृति अवधि के बाद उच्च एएलपी गतिविधि से पता चला. गैर-विभेदन माध्यम में सुसंस्कृत दोनों रिक्त मचानों और सेल-सीडेड मचानों की तुलना में भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल बीज वाले मचानों की सतह पर अधिक कैल्शियम जमा देखा गया। इसी तरह के परिणाम सेब व्युत्पन्न मचानों21 में विभेदित hiPSCs के साथ मनाया गया है. जबकि एएलपी की उपस्थिति गुणात्मक वर्तमान अध्ययन में मूल्यांकन किया गया था, अतिरिक्त assays एक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है. मचानों के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन ने आगे पुष्टि की कि घुसपैठ किए गए ओस्टियोब्लास्ट ने भेदभाव के बाद मचानों को खनिज बना दिया। विशेष रूप से, गैर-भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत निर्माणों की परिधि भी वीके के साथ दाग दी गई थी। मचानों में अवशिष्ट CaCl2 परिधि के बाद decellularization में मनाया इस गैर विशिष्ट धुंधला कारण हो सकता है. खनिजकरण का आकलन करने के लिए एसईएम चित्रों का गुणात्मक विश्लेषण किया गया था। भेदभाव माध्यम में संस्कृति के बाद, सेल बीज वाले मचानों ने ईसीएम खनिज के संकेत प्रदर्शित किए। खनिज समुच्चय मचान की सतह पर दिखाई दे रहे थे, विशेष रूप से छिद्रों के किनारों पर। ये अवलोकन ईसीएम30 और पौधे-व्युत्पन्न मचानों21 का उपयोग करके पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं। ये समुच्चय बीज वाली कोशिकाओं के बिना मचानों की सतह पर अनुपस्थित थे। समुच्चय के ईडीएस विश्लेषण से पी और सीए के उच्च स्तर की उपस्थिति का पता चला, जिससे एपेटाइट की उपस्थिति का सुझाव मिलता है। ध्यान दें कि वर्तमान अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल सेलुलर घुसपैठ और खनिज की उपस्थिति visualizing अनुमति देता है, जबकि यह समय के साथ उनकी प्रगति के आकलन की अनुमति नहीं है. इस प्रगति का पूरी तरह से मूल्यांकन करने के लिए कई समय बिंदुओं पर हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण आवश्यक होगा। इसके अलावा, सतह पर सेलुलर घुसपैठ और खनिजकरण के साथ-साथ पूरे मचान में मात्रा निर्धारित करने के लिए आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। अंत में, जबकि खनिज जमा की मौलिक संरचना ईडीएस द्वारा निर्धारित की गई थी, अन्य लक्षण वर्णन तकनीकों, जैसे एक्स-रे विवर्तन (एक्सआरडी), को मनाया जमा की क्रिस्टल संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करने की आवश्यकता हो सकती है।

भेदभाव माध्यम (लगभग 8 गुना) में संस्कृति के बाद मचानों का यंग मापांक काफी अधिक था। इसके विपरीत, गैर-भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत मचानों के मापांक खाली मचानों (बीज कोशिकाओं के बिना मचान) के समान थे, सेब-व्युत्पन्न मचानों20 के साथ पिछले अध्ययन में रिपोर्ट किए गए निष्कर्षों के समान। भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत मचानों के उच्च यंग मापांक के बावजूद, यह प्राकृतिक हड्डी की तुलना में बहुत कम रहा (त्रिकोणीय हड्डी के लिए 0.1 से 2 GPa और cortical हड्डी के लिए 15 से 20 GPa)8, रद्द एलोग्राफ्ट (3.78 GPa)31, पॉली-ईथर-ईथर-कीटोन (3.84 GPa)31, टाइटेनियम (50.20 GPa)31, और कोबाल्ट-क्रोमियम मिश्र धातु (53.15 GPa)31 से बने एलोप्लास्टिक ग्राफ्ट प्रत्यारोपण। इसलिए, उनके वर्तमान फॉर्मूलेशन में मचान लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। ध्यान दें कि यंग का मापांक किसी सामग्री की कठोरता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, उपज शक्ति को पाड़ यांत्रिक गुणों की व्यापक समझ प्रदान करने के लिए भी माना जा सकता है।

Decellularized सेब मचानों तो चूहों (एन = 6 जानवरों) में 5 मिमी द्विपक्षीय महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष में प्रत्यारोपित किया गया. पुश-आउट परीक्षण (7 एक्सप्लांट्स पर), मेजबान कैल्वेरिया के भीतर मचानों के एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए किया गया, ने संकेत दिया कि औसत शिखर बल 113.6 एन ± 18.2 एन था, जो पहले कैल्वरियल हड्डी (127.1 ± 9.6 एन)22के लिए रिपोर्ट किए गए फ्रैक्चर लोड के समान है, यह सुझाव देते हुए कि मचान आसपास के हड्डी के ऊतकों में अच्छी तरह से एकीकृत हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पुश-आउट परीक्षण केवल मचान और आसपास के ऊतक के बीच इंटरफेस के बारे में जानकारी प्रदान करता है। पिछले अध्ययनों ने इंडेंटेशन परीक्षणों के साथ पुश-आउट परीक्षणों को जोड़ा है ताकि हड्डी-प्रत्यारोपण इंटरफ़ेस और मचानके यांत्रिक गुणों की व्यापक समझ प्रदान की जा सके। इसके अतिरिक्त, द्विपक्षीय दोष सवार32 के साथ गलत संरेखण के लिए अधिक प्रवण हैं। कपाल प्रत्यारोपण, एकल दोष मॉडल, या सार्वभौमिक परीक्षण उपकरण पर अतिरिक्त क्लैंपिंग सिस्टम का उचित स्थान संभावित रूप से मिसलिग्न्मेंट32 से बच सकता है।

सारांश में, इस अध्ययन ने पुष्टि की कि सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचान प्रीओस्टियोब्लास्ट आसंजन और प्रसार को बढ़ावा दे सकते हैं। इसके अलावा, भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत सेल-सीडेड मचानों के भीतर खनिजकरण हुआ, जिससे मचान यंग के मापांक में वृद्धि हुई। हालांकि, मापांक प्राकृतिक हड्डी की तुलना में काफी कम रहा। दिलचस्प बात यह है कि प्रत्यारोपित सेब-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों को विस्थापित करने के लिए आवश्यक बल पहले बीटीई22 के लिए उपयोग किए जाने वाले कैल्वरियल हड्डी और अन्य प्रकार के मचानों के फ्रैक्चर लोड के बराबर था। अंत में, पिछली रिपोर्टों में सचित्र परिणामों के समान, कोशिकाओं ने प्रत्यारोपित मचानों में घुसपैठ की और कोलेजन जमा किया। कुल मिलाकर, यह अध्ययन बीटीई अनुप्रयोगों के लिए पौधों से प्राप्त सेलूलोज़ मचानों की क्षमता को प्रदर्शित करता है। ये निष्कर्ष एक अलग शोध समूह द्वारा किए गए पिछले अध्ययन के साथ समझौते में हैं, आगे बीटीई प्रयोजनों के लिए पौधे व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों की उपयुक्तता की पुष्टि21. फिर भी, ट्रैब्युलर या कॉर्टिकल हड्डी की तुलना में मचानों की कठोरता में असमानता समग्र बायोमैटिरियल्स विकसित करने के महत्व पर प्रकाश डालती है जो प्राकृतिक हड्डी के यांत्रिक गुणों से अधिक निकटता से मेल खा सकती है। इसलिए, बीटीई उद्देश्यों के लिए पौधे-व्युत्पन्न मचानों का उपयोग करने में बढ़ती रुचि के बावजूद, उनका उपयोग गैर-लोड-असर अनुप्रयोगों तक सीमित रह सकता है। जैसा कि हमने पहले16 का प्रदर्शन किया था, रासायनिक संशोधन के माध्यम से संयंत्र-व्युत्पन्न सेलूलोज़ मचानों को फिर से इंजीनियरिंग करना या लोड-असर अनुप्रयोगों के लिए अन्य जैविक / सिंथेटिक पॉलिमर के साथ कंपोजिट विकसित करना आवश्यक हो सकता है।

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Disclosures

हितों का टकराव बयान: एमएलएल, एमटी, आरजेएच, सीएमसी, आईसी और एपी बीटीई अनुप्रयोगों के लिए पौधे-व्युत्पन्न सेलूलोज़ के उपयोग के विषय में ओटावा विश्वविद्यालय और स्पाइडरवॉर्ट इंक द्वारा दायर पेटेंट आवेदनों पर आविष्कारक हैं। M.L.L., R.J.H., C.M.C., और AP के स्पाइडरवॉर्ट इंक में वित्तीय हित हैं।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए वित्त पोषण कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (डिस्कवरी ग्रांट) और ली का शिंग फाउंडेशन द्वारा प्रदान किया गया था। एमएलएल को ओंटारियो सेंटर ऑफ एक्सीलेंस टैलेंटएज प्रोग्राम से समर्थन मिला, और आरजेएच को एनएसईआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति और ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप (ओजीएस) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole ThermoFisher D1306 DAPI
Alizarin red S Sigma-Aldrich A5533 ARS
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 Cell Culture
Calcium Chloride ThermoFisher AA12316 CaCl2
Calcofluor White Sigma-Aldrich 18909
Dental drill Surgical tool
Ethanol ThermoFisher 615095000
Fetal bovine serum Hyclone Laboratories SH30396 FBS
Formalin Sigma-Aldrich HT501128 10% Formalin
Goldner's trichrome stain Sigma-Aldrich 1.00485 GTC
Hematoxylin and eosin stain Fisher Scientific NC1470670 H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope Nikon Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
ImageJ software National Institutes of Health
Irrigation saline Baxter JF7123 0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells ATCC CRL-2593 Pre-osteoblast cells
McIntosh apples Canada Fancy grade
Methyl methacrylate Sigma-Aldrich M55909 Histological embedding
Minimum Essential Medium ThermoFisher M0894 α-MEM
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 4%; PFA
Penicillin/Streptomycin Hyclone Laboratories SV30010 Cell Culture
Periodic acid Sigma-Aldrich 375810
Phosphate buffered saline Hyclone Laboratories 2810305 PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide Invitrogen p3566
Scanning electron microscope JEOL JSM-7500F FESEM SEM and EDS
Slide scanner microscope Zeiss AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166 SDS
Sodium metabisulphite Sigma-Aldrich 31448
Sodium phosphate ThermoFisher BP329
Sprague-Dawley rats Charles-River Laboratories 400 Male
Sutures Ethicon J494G 4-0
Trephine ACE Surgical Supply Co 583-0182 5-mm diameter
Triton-X 100 ThermoFisher 807423
Trypsin Hyclone Laboratories SH30236.02 Cell Culture
Tween Fisher Scientific BP337
Universal compression Device CellScale UniVert
Von Kossa stain Sigma-Aldrich 1.00362 Histology

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References

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अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग <em>इन विट्रो</em> और <em>विवो में</em> के लिए decellularized सेब व्युत्पन्न मचान
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Leblanc Latour, M., Tarar, M., Hickey, R. J., Cuerrier, C. M., Catelas, I., Pelling, A. E. Decellularized Apple-Derived Scaffolds for Bone Tissue Engineering In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (204), e65226, doi:10.3791/65226 (2024).

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