Summary
In dieser Studie beschreiben wir Methoden der Dezellularisierung, der physikalischen Charakterisierung, der Bildgebung und der in vivo Implantation von pflanzlichen Biomaterialien sowie Methoden zur Zellaussaat und Differenzierung in den Scaffolds. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Evaluierung von pflanzlichen Biomaterialien für Anwendungen im Bone Tissue Engineering.
Abstract
Pflanzliche Zellulose-Biomaterialien werden in verschiedenen Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt. In-vivo-Studien haben die bemerkenswerte Biokompatibilität von Scaffolds aus Zellulose aus natürlichen Quellen gezeigt. Darüber hinaus besitzen diese Gerüste strukturelle Eigenschaften, die für mehrere Gewebe relevant sind, und sie fördern die Invasion und Proliferation von Säugetierzellen. Neuere Forschungen mit dezellularisiertem Apfelhypanthium-Gewebe haben die Ähnlichkeit seiner Porengröße mit der von trabekulärem Knochen sowie seine Fähigkeit, die osteogene Differenzierung effektiv zu unterstützen, gezeigt. In der vorliegenden Studie wurde das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für Anwendungen im Bereich Bone Tissue Engineering (HdO) untersucht und ihre mechanischen Eigenschaften in vitro und in vivo bewertet. MC3T3-E1-Präosteoblasten wurden in aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten ausgesät, die dann auf ihr osteogenes Potenzial und ihre mechanischen Eigenschaften untersucht wurden. Die alkalische Phosphatase und die Alizarinrot-S-Färbung bestätigten die osteogene Differenzierung in Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Die histologische Untersuchung zeigte eine weit verbreitete Zellinvasion und Mineralisierung über die Scaffolds hinweg. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte mineralische Aggregate auf der Oberfläche der Gerüste, und die energiedispersive Spektroskopie (EDS) bestätigte das Vorhandensein von Phosphat- und Kalziumelementen. Trotz eines signifikanten Anstiegs des Elastizitätsmoduls nach der Zelldifferenzierung blieb er jedoch niedriger als der von gesundem Knochengewebe. In-vivo-Studien zeigten die Zellinfiltration und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix innerhalb der dezellularisierten Apfelgerüste nach 8-wöchiger Implantation in die Schädelknochen der Ratte. Darüber hinaus war die Kraft, die erforderlich war, um die Gerüste aus dem Knochendefekt zu entfernen, vergleichbar mit der zuvor berichteten Frakturbelastung des nativen Schädelknochens. Insgesamt bestätigt diese Studie, dass aus Äpfeln gewonnene Zellulose ein vielversprechender Kandidat für HdO-Anwendungen ist. Die Unähnlichkeit zwischen seinen mechanischen Eigenschaften und denen von gesundem Knochengewebe kann seine Anwendung jedoch auf Szenarien mit geringer Belastung beschränken. Zusätzliche strukturelle Umgestaltungen und Optimierungen können erforderlich sein, um die mechanischen Eigenschaften von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für tragende Anwendungen zu verbessern.
Introduction
Große Knochendefekte, die durch eine Verletzung oder Krankheit verursacht werden, erfordern oft Biomaterialtransplantate für eine vollständige Regeneration1. Derzeitige Techniken zur Verbesserung der Regeneration von Knochengewebe verwenden regelmäßig autologe, allogene, xenogene oder synthetische Transplantate2. Bei der autologen Knochentransplantation, die als "Goldstandard" zur Reparatur großer Knochendefekte gilt, wird dem Patienten Knochen entnommen. Dieses Transplantationsverfahren hat jedoch mehrere Nachteile, darunter Größen- und Formbeschränkungen, Gewebeverfügbarkeit und Morbidität an der Probenahmestelle3. Darüber hinaus sind autologe Transplantationsverfahren anfällig für Infektionen an der Operationsstelle, nachfolgende Frakturen, Hämatombildung an der Probenentnahme oder rekonstruierten Stelle und postoperative Schmerzen4. Das Bone Tissue Engineering (HdO) bietet eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen Knochentransplantationsmethoden5. Es kombiniert strukturelle Biomaterialien und Zellen, um neues funktionelles Knochengewebe aufzubauen. Bei der Entwicklung von Biomaterialien für HdO ist es entscheidend, eine makroporöse Struktur, eine Oberflächenchemie, die die Zellanhaftung fördert, und mechanische Eigenschaften, die denen von nativem Knochen sehr ähnlich sind, zu kombinieren6. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die ideale Porengröße und der ideale Elastizitätsmodul für Biomaterialien, die in HdO verwendet werden, etwa 100-200 μm7 bzw. 0,1-20 GPa betragen, abhängig von der Transplantationsstelle8. Darüber hinaus sind die Porosität und die Poreninterkonnektivität der Gerüste entscheidende Faktoren, die die Zellmigration, die Nährstoffdiffusion und die Angiogenese beeinflussen8.
HdO hat vielversprechende Ergebnisse mit verschiedenen Biomaterialien gezeigt, die als Alternative zu Knochentransplantaten entwickelt und bewertet wurden. Einige dieser Biomaterialien sind osteoinduktive Materialien, Hybridmaterialien und fortschrittliche Hydrogele8. Osteoinduktive Materialien stimulieren die Entwicklung neu gebildeter Knochenstrukturen. Hybridmaterialien bestehen aus synthetischen und/oder natürlichen Polymeren8. Fortschrittliche Hydrogele ahmen die extrazelluläre Matrix (EZM) nach und sind in der Lage, die notwendigen bioaktiven Faktoren zur Förderung der Integration von Knochengewebe zu liefern8. Hydroxylapatit ist ein traditionelles Material und aufgrund seiner Zusammensetzung und Biokompatibilität eine gängige Wahl für HdO9. Bioaktives Glas ist eine weitere Art von Biomaterial für HdO, von dem gezeigt wurde, dass es spezifische Zellantworten stimuliert, um Gene zu aktivieren, die für die Osteogenese notwendig sind10,11. Biologisch abbaubare Polymere, einschließlich Polyglykolsäure und Polymilchsäure, werden ebenfalls in großem Umfang in HdO-Anwendungen eingesetzt12. Schließlich haben auch natürliche oder natürlich gewonnene Polymere wie Chitosan, Chitin und bakterielle Zellulose ermutigende Ergebnisse für HdO13 gezeigt. Während jedoch sowohl synthetische als auch natürliche Polymere Potenzial für HdO aufweisen, erfordert die Entwicklung eines funktionellen Gerüsts mit der gewünschten Makrostruktur in der Regel umfangreiche Protokolle.
Umgekehrt können native makroskopische Zellulosestrukturen leicht aus verschiedenen Pflanzen abgeleitet werden, und unsere Forschungsgruppe hat bereits die Anwendbarkeit von zellulosebasierten Scaffolds aus Pflanzen auf verschiedene Geweberekonstruktionen gezeigt. In der Tat haben wir uns nach einer einfachen Tensidbehandlung die inhärente Struktur des Pflanzenmaterials zunutze gemacht und sein Potenzial als vielseitiges Biomaterial hervorgehoben14. Darüber hinaus können diese Scaffolds auf Zellulosebasis für In-vitro-Anwendungen in Säugetierzellkulturenverwendet werden 14, sind biokompatibel und unterstützen die spontane subkutane Vaskularisierung 14,15,16,17. Sowohl unsere Forschungsgruppe als auch andere haben gezeigt, dass diese Gerüste aus bestimmten Pflanzen gewonnen werden können, je nach beabsichtigter Anwendung 14,15,16,17,18,19,20. Zum Beispiel weist die in Pflanzenstängeln und -blättern beobachtete Gefäßstruktur eine auffallende Ähnlichkeit mit der Struktur auf, die in tierischen Geweben gefunden wurde19. Darüber hinaus können aus Pflanzen gewonnene Zellulosegerüste leicht geformt und biochemischen Oberflächenmodifikationen unterzogen werden, um die gewünschten Eigenschaften zu erreichen16. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir während des Dezellularisierungsprozesses einen Salzpuffer eingebaut, was zu einer verstärkten Zelladhäsion führte, die sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet wurde16. In der gleichen Studie haben wir die Anwendbarkeit von pflanzlichen Zellulosegerüsten in Verbundbiomaterialien nachgewiesen, indem wir Hydrogele auf die Oberfläche der Gerüste gegossen haben. In neueren Studien wurde gezeigt, dass die Funktionalisierung von pflanzlichen Scaffolds deren Wirksamkeit erhöht18. Eine Studie von Fontana et al. (2017) ergab beispielsweise, dass die Adhäsion menschlicher dermaler Fibroblasten durch RGD-beschichtete dezellularisierte Stängel unterstützt wurde, während unbeschichtete Stängel nicht die gleiche Fähigkeit aufwiesen18. Darüber hinaus zeigten die Autoren, dass modifizierte simulierte Körperflüssigkeit verwendet werden kann, um dezellularisierte Pflanzenstängel künstlich zu mineralisieren. In neueren Studien untersuchten wir das Konzept der mechanosensitiven Osteogenese in pflanzlichen Zellulosegerüsten und bewerteten ihr Potenzial für HdO 17,20. Darüber hinaus verwendeten Lee et al. (2019) pflanzliche Gerüste, um knochenähnliches Gewebe in einer In-vitro-Umgebung zu kultivieren21. Durch umfassende Auswertungen verschiedener pflanzlicher Quellen identifizierten die Autoren aus Äpfeln gewonnene Gerüste als die optimalsten für die Kultivierung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Darüber hinaus schlugen die Autoren vor, dass die strukturellen und mechanischen Eigenschaften der aus Äpfeln gewonnenen Gerüste eine entscheidende Rolle für ihre Eignung für den beabsichtigten Zweck spielen. Als erste pflanzliche Gerüste, die in Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt wurden, wurde ausführlich gezeigt, dass aus Äpfeln gewonnene Scaffolds eine auffallend ähnliche Architektur wie menschliche Knochen besitzen, insbesondere in Bezug auf ihre miteinander verbundenen Poren mit einem Durchmesser von 100 bis 200 μm14,21.
In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für HdO und führten eine Analyse ihrer mechanischen Eigenschaften sowohl in vitro als auch in vivo durch. Obwohl es Studien über das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Gerüsten für HdO 17,20,21 gibt, wurden ihre mechanischen Eigenschaften nur unzureichend untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Wildspread-Invasion und osteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Präosteoblasten, die in Gerüsten ausgesät wurden, die 4 Wochen lang in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Der Elastizitätsmodul dieser Scaffolds betrug 192,0 ± 16,6 kPa und war damit signifikant höher als der der Blank-Scaffolds (Scaffolds ohne ausgesäte Zellen) (31,6 ± 4,8 kPa) und der zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden (24,1 ± 8,8 kPa). Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Elastizitätsmodul von gesundem menschlichem Knochengewebe typischerweise im Bereich von 0,1-2 GPa für trabekulären Knochen und etwa 15-20 GPa für kortikalen Knochen8 liegt. Nichtsdestotrotz schienen nach einer 8-wöchigen Implantation in einen Schädelkrebsdefekt bei Nagetieren die zellbesiedelten Gerüste gut in den umgebenden Knochen integriert zu sein, wie eine durchschnittliche Spitzenkraft von 113,6 N ± 18,2 N in Push-out-Tests zeigte, was der zuvor berichteten Frakturlast des nativen Schädelknochens ähnelt22. Insgesamt sind die Ergebnisse dieser Studie vielversprechend, insbesondere für nicht-tragende Anwendungen. Aus Äpfeln gewonnene Zellulosegerüste verfügen jedoch derzeit nicht über die notwendigen mechanischen Eigenschaften, um das umgebende Knochengewebe an einer Implantatstelle genau anzupassen. Folglich ist eine weitere Entwicklung erforderlich, um das volle Potenzial dieser Gerüste auszuschöpfen.
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Protocol
Die Versuchsprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Ottawa geprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung des Gerüsts
- McIntosh-Äpfel (Canada Fancy) mit einem Mandolinenhobel in 8 mm dicke Scheiben schneiden. Das Hypanthiumgewebe der Apfelscheiben in 5 mm x 5 mm große Quadrate schneiden.
- Die quadratischen Proben werden 2 Tage lang in 0,1%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) gelegt.
- Waschen Sie die dezellularisierten Proben mit deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) in 100 mM CaCl2, um das restliche Tensid zu entfernen.
- Sterilisieren Sie die Proben (d. h. Gerüste) 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol, waschen Sie sie mit deionisiertem Wasser und legen Sie sie vor der Zellaussaat in eine 24-Well-Kulturplatte.
2. Zellkultur und Gerüstaussaat
- Halten Sie MC3T3-E1 Subclone 4 Zellen in mit Zellkulturen behandelten Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm unter Zellkulturbedingungen (37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2) auf.
- Bereiten Sie ein Zellkulturmedium aus dem minimalen essentiellen Medium von Eagle vor - Alpha-Modifikation (α-MEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin.
- Lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung (0,05 % Trypsin-EDTA) von den Kulturschalen, sobald sie 80 % Konfluenz erreicht haben.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei ca. 200 x g für 3 min. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in α-MEM bei 2,5 x 107 Zellen pro ml.
- Pipettieren Sie ein 40-μl-Aliquot der Zellsuspension auf die Oberfläche der Gerüste und lassen Sie die Zellen 1 h lang unter Zellkulturbedingungen haften. Anschließend werden 2 ml Nährmedium in jede Vertiefung der Kulturplatte gegeben.
- Füllen Sie das Nährmedium 14 Tage lang alle 2-3 Tage auf.
- Bereiten Sie ein Differenzierungsmedium vor, indem Sie 50 μg/ml Ascorbinsäure und 4 mM Natriumphosphat zu dem zuvor beschriebenen Zellkulturmedium hinzufügen.
- Induzieren Sie die Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen, indem Sie die Gerüste 4 Wochen lang in Differenzierungsmedium inkubieren. Füllen Sie das Medium alle 3-4 Tage auf. Parallel dazu werden Gerüste in Nicht-Differenzierungskulturmedium (d. h. Medium ohne die Zusätze zur Induktion der Differenzierung) für die gleiche Dauer mit dem gleichen Mediumwechselplan inkubiert, um als Negativkontrolle zu dienen.
3. Porengrößenmessung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
- Waschen Sie die dezellularisierten Gerüste aus Äpfeln mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Inkubieren Sie die Scaffolds in 1 ml 10%iger (v/v) Calcofluor-Weißfärbung für 25 Minuten im Dunkeln bei RT.
- Waschen Sie die Gerüste (n = 3) mit PBS und bilden Sie drei zufällig ausgewählte Bereiche pro Gerüst mit einem resonanten konfokalen Hochgeschwindigkeits-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) mit 10-facher Vergrößerung unter Verwendung eines DAPI-Kanals wie folgt ab:
- Konfiguration des Laseremissionsfilters: 405 nm (Laser); 425-475 nm (Emission)
- Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten. Erfassen Sie einen Z-Stack mit 20 Bildern mit einer Schrittweite von 5 μm.
- Verarbeiten und analysieren Sie die konfokalen Bilder mit der ImageJ-Software wie folgt:
- Verwenden Sie die Funktion "Z-Projektion auf maximale Intensität ", um ein Bild zu erstellen, und wenden Sie die Funktion "Kanten suchen " an, um den Rand der Poren hervorzuheben.
- Zeichnen Sie die Poren manuell mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug nach.
- Passen Sie jede Pore als Ellipse an, messen Sie die Länge der Hauptachse, stellen Sie alle Messungen zusammen (insgesamt 54 in der vorliegenden Studie - 6 in 3 zufällig ausgewählten Bereichen für jedes Gerüst) und berechnen Sie die durchschnittliche Länge.
4. Zellverteilungsanalyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
- Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 4% Paraformaldehyd für 10 min.
- Waschen Sie jedes Gerüst gründlich mit deionisiertem Wasser, permeabilisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einer Triton-X 100-Lösung und waschen Sie sie erneut mit PBS.
- Die Scaffolds werden 40 Minuten lang in 1 ml 1%iger Periodsäure inkubiert und mit deionisiertem Wasser14,16 gespült.
- Die Gerüste werden in 1 ml einer Lösung mit 100 mM Natriummetabisulfit und 0,15 M Salzsäure, ergänzt mit 100 μg/ml Propidiumiodid, inkubiert. Tauchen Sie die Gerüste vollständig in die Lösung ein.
- Waschen Sie die Scaffolds mit PBS und färben Sie die Zellkerne, indem Sie die Scaffolds 10 Minuten lang im Dunkeln in einer 5 mg/ml DAPI-Lösung inkubieren. Waschen Sie die Gerüste vor der Bildgebung noch einmal gründlich und lagern Sie sie in PBS.
- Bilden Sie drei zufällig ausgewählte Oberflächen von drei verschiedenen zellbesiedelten Gerüsten mit einem resonanten Hochgeschwindigkeits-CLSM bei 10-facher Vergrößerung unter Verwendung von DAPI- und TRITC-Kanälen wie folgt ab:
- Konfiguration des Laseremissionsfilters:
DAPI: Laser: 405 nm; Emission: 425-475 nm
TRITC: Laser: 561 nm; Emission: 570-620 nm - Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten. Erfassen Sie einen Z-Stack mit 20 Bildern mit einer Schrittweite von 5 μm.
- Konfiguration des Laseremissionsfilters:
- Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die konfokalen Bilder zu verarbeiten und eine maximale Projektion in der Z-Achse für die Bildanalyse mit der Funktion Z-Projekt auf maximale Intensität zu erstellen.
5. Analyse der alkalischen Phosphatase
- Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 10% neutralem gepuffertem Formalin für 30 min. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
- Bereiten Sie eine Färbelösung für 5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat und Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT) vor, indem Sie eine BCIP/NBT-Tablette in 10 ml entionisiertem Wasser auflösen.
- Waschen Sie die festen Gerüste mit einer 0,05%igen Tween-Lösung und färben Sie sie 20 Minuten lang bei RT mit der BCIP/NBT-Lösung. Waschen Sie die gefärbten Gerüste mit einer 0,05%igen Tween-Lösung und lagern Sie sie vor der Bildgebung in PBS.
- Stellen Sie sich die fleckigen Gerüste mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera vor.
6. Analyse der Kalziumablagerungen
- Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 10% neutralem gepuffertem Formalin für 30 min. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
- Bereiten Sie eine 2%ige (w/v) Alizarinrot S (ARS)-Färbelösung vor.
- Waschen Sie die festen Gerüste mit deionisiertem Wasser und färben Sie sie mit der ARS-Lösung für 1 h bei RT. Waschen Sie die gefärbten Gerüste mit deionisiertem Wasser und lagern Sie sie vor der Bildgebung in PBS.
- Stellen Sie sich die fleckigen Gerüste mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera vor.
7. Analyse der Mineralisierung
- Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 4% Paraformaldehyd für 48 h. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
- Die Proben werden in Lösungen dehydriert, die Ethanolkonzentrationen enthalten, die von 50 % auf 100 % ansteigen, wie zuvor beschrieben23.
- Führen Sie Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersive Spektroskopie (EDS) durch, um Mineralaggregate wie folgt zu analysieren:
- Trocknen Sie die Proben mit einem kritischen Punkttrockner gemäß dem Protokoll des Herstellers24.
- Tragen Sie eine 5-nm-Goldschicht mit einem Goldsputter-Coater gemäß dem Protokoll des Herstellers25 auf die Gerüste auf.
- Bilden Sie die Oberfläche der Gerüste mit einem Rasterelektronenmikroskop ab, das auf 3 kV eingestellt ist, mit 85-facher Vergrößerung.
- Führen Sie EDS durch, indem Sie das Rasterelektronenmikroskop auf 15 kV einstellen. Erfassen Sie auf drei zufällig ausgewählten Bereichen pro Gerüst EDS-Spektren für die Analyse der Zusammensetzung von Mineralaggregaten.
8. Messungen des Elastizitätsmoduls
- Entfernen Sie die zellbesiedelten Gerüste aus ihrem jeweiligen Inkubationsmedium und testen Sie die Proben sofort.
- Mit einer speziell angefertigten einachsigen Druckvorrichtung, die mit einer 1,5-N-Wägezelle ausgestattet ist, werden die Gerüste (n = 3 pro Bedingung) mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3 mm·min-1 auf eine maximale Druckdehnung von 10 % der Gerüsthöhe zusammengedrückt.
- Bestimmen Sie den Elastizitätsmodul aus der Steigung des linearen Teils der Spannungs-Dehnungs-Kurven. In der vorliegenden Studie wurde der Modul zwischen 9% und 10% Dehnung bestimmt.
9. Analyse der Zellinfiltration und Mineralisierung durch Histologie: In-vitro-Scaffolds
- Die zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen.
- Fixieren Sie die zellbesiedelten Gerüste 48 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd, bevor sie zur Lagerung in 70 % Ethanol resuspendiert werden.
- Histologie:
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die gesamte histologische Präparation (Einbettung, Schnitt und Färbung), die in den nächsten Schritten beschrieben wird, von der Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa) durchgeführt.- Nach der Dehydratisierung und dem Einbetten in Paraffin schneiden Sie die Proben in 5 μm dicke Serienschnitte, beginnend 1 mm innerhalb der Gerüste, und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern.
- Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) oder von-Kossa- (VK) Färben.
- Abbildung der Schnitte mit einem Objektträger-Scanner-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung (n = 1 Gerüst im Nicht-Differenzierungsmedium und n = 2 Gerüste im Differenzierungsmedium in der vorliegenden Studie).
- Mit der ImageJ-Software können Sie die Zellinfiltration (H&E-Färbung) und die Mineralisierung (VK-Färbung) visuell auswerten.
10. Modell des Schädeldachdefekts der Ratte
- Lassen Sie die Versuchsprotokolle vom örtlichen Tierschutzausschuss überprüfen und genehmigen.
- Bereiten Sie kreisförmige (5 mm Durchmesser und 1 mm Dicke) dezellularisierte Gerüste gemäß Abschnitt 1 oben beschrieben und verwenden Sie eine 5-mm-Biopsiestanze.
- Führen Sie eine bilaterale Kraniotomie nach einem festgelegten Protokoll26 wie folgt durch:
- Betäuben Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit Isofluran, zuerst bei 3 % bis zur Bewusstlosigkeit und dann bei 2-3 % während des gesamten Eingriffs.
- Legen Sie die Knochenhaut und den Schädel frei, indem Sie die darüber liegende Haut mit einer Skalpellklinge abschneiden. Entferne die Knochenhaut.
- Erzeugen Sie bilaterale Defekte in beiden Scheitelknochen auf jeder Seite der sagittalen Naht mit einem Dentalbohrer, der mit einem Trepan mit einem Durchmesser von 5 mm unter konstanter Spülung von 0,9 % NaCl ausgestattet ist.
- Reinigen Sie den umgebenden Knochen mit 0,9 % NaCl, um alle Knochenfragmente zu entfernen.
- Platzieren Sie die kreisförmigen, dezellularisierten Gerüste in den Defekten.
- Die darüber liegende Haut mit 4-0 Nähten verschließen.
- Geben Sie den Ratten unbegrenzten Zugang zu Futter und Wasser und überwachen Sie sie täglich.
- Nach 8 Wochen nach der Implantation werden die Ratten durch CO2 - Inhalation und Thoraxperforation als sekundäre Euthanasiemaßnahme euthanasiert.
- Um den Schädel freizulegen und die Implantate zu entnehmen, entfernen Sie die Haut, die den Schädel bedeckt, mit einer Skalpellklinge.
- Schneiden Sie den Schädel am Stirn- und Hinterhauptbein sowie an der Seite beider Scheitelknochen mit einem Zahnbohrer ab, um den oberen Teil des Schädels vollständig zu entfernen.
11. Push-Out-Test
- Schließen Sie ein einachsiges Kompressionsgerät (mit einer 445-N-Wägezelle) an das USB-Datenerfassungsmodul an.
- Schließen Sie das Datenerfassungsmodul an einen Computer an, der mit einer Datenerfassungssoftware ausgestattet ist.
- Unmittelbar nach der Schädelextraktion wird jede Probe (n = 7 Implantate von 4 Tieren in der vorliegenden Studie) so auf den Probenhalter der uniaxialen Kompressionsvorrichtung gelegt, dass die dorsale Seite des Knochens nach oben zeigt.
- Senken Sie den Kolben mit 0,5 mm/min ab, bis er das extrahierte Implantat leicht berührt.
- Starten Sie den Test, indem Sie den Kolben durch das Implantat absenken, bis er vollständig herausgedrückt ist, während Sie die Kompression mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 mm/min mit der Datenerfassungssoftware anwenden.
- Zeichnen Sie die Spitzenkraft auf der Kraft-Weg-Kurve mit der Datenerfassungssoftware auf.
12. Analyse der Zellinfiltration und Mineralisierung durch Histologie: In-vivo-Gerüste
- Fixieren Sie die extrahierte Schädeldecke und die Implantate 72 Stunden lang in 10% neutralem gepuffertem Formalin, bevor sie zur Lagerung in 70% Ethanol resuspendiert werden.
- Histologie:
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die gesamte histologische Vorbereitung (Einbettung, Schnitt und Färbung), die in den nächsten Schritten beschrieben wird, von Accel Labs (Montreal, QC, Kanada) durchgeführt.- Schneiden Sie die Proben (eingebettet in Methylmethacrylat) in 6 μm dicke Abschnitte auf drei verschiedenen Ebenen (oben, unten und zur Mitte hin) und montieren Sie sie auf Objektträger.
- Färben Sie die Abschnitte entweder mit H&E oder Masson-Goldner-Trichrom (MGT) ein.
- Die Schnitte wurden mit einem Objektträger-Scanner-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung abgebildet (4 Explanate von 2 Tieren in der vorliegenden Studie).
- Mit der ImageJ-Software können Sie die Zellinfiltration (H&E-Färbung) und die Kollagenablagerung (MGT-Färbung) visuell bewerten.
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Representative Results
Porengrößenmessung, Zellverteilung und In-vitro-Mineralisierung (Abbildung 1 und Abbildung 2)
Die vollständige Entfernung der nativen zellulären Bestandteile der Apfelgewebegerüste wurde nach der Behandlung der Gerüste mit SDS und CaCl2 erreicht (Abbildung 1A). Die Scaffolds wiesen eine hochporöse Struktur auf, die mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt wurde. Die Quantifizierung der Bilder ergab eine durchschnittliche Porengröße von 154 μm ± 40 μm. Die Porengrößenverteilung lag zwischen 73 μm und 288 μm. Der Großteil der Poren lag jedoch zwischen 100 μm und 200 μm (Abbildung 1C).
Nach einer 4-wöchigen Kulturphase im Differenzierungsmedium wiesen die zellbesiedelten Scaffolds weit verbreitete weiße Mineralablagerungen auf (Abbildung 1A). Die Gerüste, die Zellen enthielten, wiesen eine undurchsichtige weiße Färbung auf, was auf eine Mineralisierung hindeutet, die in den leeren Gerüsten (Gerüste ohne besiedelte Zellen) nicht beobachtet wurde. Darüber hinaus ergab die Analyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie eine homogene Zellverteilung innerhalb der Scaffolds (Abbildung 1B).
Gerüste, die mit oder ohne Zellen besiedelt waren, wurden mit BCIP/NBT und ARS gefärbt, um die ALP-Aktivität bzw. die Mineralisierung zu analysieren (Abbildung 1D). Die BCIP/NBT-Färbung ergab einen deutlichen Anstieg der ALP-Aktivität (dargestellt durch eine starke violette Farbe) innerhalb der zellbesiedelten Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, im Gegensatz zu den leeren Scaffolds oder den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Ebenso zeigten die zellbesiedelten Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, eine intensivere rote Farbe bei der Färbung mit ARS, was auf eine größere Mineralisierung im Vergleich zu den Blank-Scaffolds oder den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden, hindeutet. In den leeren Gerüsten wurde eine Hintergrundfärbung beobachtet, die möglicherweise auf das Vorhandensein von CaCl2 im Dezellularisierungsprotokoll zurückzuführen ist.
Die Färbung (H&E und VK) wurde auf den Gerüsten durchgeführt, um die Zellinfiltration und Mineralisierung zu analysieren, und REM und EDS wurden verwendet, um die Mineralisierung weiter zu bewerten (Abbildung 2). Die H&E-Färbung (Abbildung 2A) zeigte eine gute Zellinfiltration in den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Mehrere Kerne waren in der Peripherie und in den Scaffolds sichtbar. Das Vorhandensein von Kollagen wurde auch in den Gerüsten in blassrosa beobachtet. Darüber hinaus zeigte die VK-Färbung, die auf den Scaffolds nach 4-wöchiger Kultur in Differenzierungsmedium durchgeführt wurde, dass die Porenwände gefärbt waren, während Kalziumablagerungen nur entlang der Außenkanten der Porenwände in den in Nicht-Differenzierungsmedium kultivierten Scaffolds nachgewiesen wurden und möglicherweise von der Kalziumabsorption während der Dezellularisierungsbehandlung herrührten. Mittels REM-Analyse wurde eine lokalisierte Mineralisierung auf der Oberfläche der zellbesiedelten Gerüste beobachtet, die 4 Wochen lang im Differenzierungsmedium kultiviert wurden (Abbildung 2B). Genauer gesagt wurden an der Peripherie der Poren mineralische Ablagerungen beobachtet, die sphäroiden Aggregaten ähneln. Im Gegensatz dazu wurden keine mineralischen Aggregate auf den leeren Scaffolds oder den zellbesiedelten Scaffolds beobachtet, die 4 Wochen lang in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden. In den EDS-Spektren der ausgewählten interessierenden Regionen wurden deutliche charakteristische Peaks beobachtet, die Phosphor (P) und Kalzium (Ca) entsprechen, insbesondere auf den Mineralablagerungen, die auf den zellbesiedelten Gerüsten beobachtet wurden, die 4 Wochen lang im Differenzierungsmedium kultiviert wurden (Abbildung 2B).
Biomechanische In-vitro-Analyse (Abbildung 3)
Der Elastizitätsmodul der zellbesiedelten Scaffolds wurde nach 4 Wochen Kultur entweder in Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium gemessen (n = 3 für jede Versuchsbedingung). Er wurde mit dem Elastizitätsmodul der leeren Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen) verglichen (Abbildung 3). Es wurde kein signifikanter Unterschied im Modul zwischen den Blindgerüsten (31,6 kPa ± 4,8 kPa) und den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Im Gegensatz dazu wurde ein signifikanter Unterschied zwischen dem Modul der Blindgerüste (31,6 kPa ± 4,8 kPa) und dem der in Differenzierungsmedium kultivierten zellbesiedelten Scaffolds (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Zusätzlich wurde ein signifikanter Unterschied (p < 0,001) zwischen den Elastizitätsmodulen der zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungs- und Differenzierungsmedien kultiviert wurden, beobachtet. Ergänzende Abbildung 1 zeigt eine typische Spannungs-Dehnungs-Kurve für die Berechnung des Elastizitätsmoduls.
Biomechanische Leistung und Knochenregeneration in vivo (Abbildung 4 und Abbildung 5)
Chirurgische Kraniotomien wurden an insgesamt 6 Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Beidseitige Defekte mit einem Durchmesser von 5 mm wurden in beiden Scheitelknochen des Schädels mit einem Trepanbohrer erzeugt, und aus Äpfeln gewonnene Zellulosegerüste ohne Samenzellen wurden in die Schädelknochendefekte implantiert (Abbildung 4A). Nach 8 Wochen der Implantation wurden die Tiere euthanasiert und der obere Teil ihres Schädels wurde entnommen und entweder für mechanische Tests oder histologische Analysen aufbereitet.
Basierend auf der visuellen Beurteilung schienen die Scaffolds gut in das Schädel-umgebende Gewebe integriert zu sein. Mechanische Push-Out-Tests wurden durchgeführt, um die Integration der Scaffolds (n = 7) in die Wirtskalvaria quantitativ zu beurteilen. Die Messungen wurden mit einem einachsigen Kompressionsgerät (Abbildung 4B) unmittelbar nach der Euthanasie der Tiere durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Spitzenkraft 113,6 N ± 18,2 N betrug (Tabelle 1).
Histologische Analysen wurden durchgeführt, um die Zellinfiltration und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix innerhalb der implantierten Scaffolds zu beurteilen (Abbildung 5). Die H&E-Färbung ergab eine zelluläre Infiltration innerhalb der Gerüstporen und Hinweise auf Vaskularisierung, wie das Vorhandensein von Blutgefäßen in den Scaffolds zeigt. Darüber hinaus zeigte die MGT-Färbung das Vorhandensein von Kollagen in den Gerüsten.
Abbildung 1: Gerüstbilder, Porengrößenverteilung und In-vitro-Mineralisierung . (A) Repräsentative Fotografien eines aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsts nach Entfernung der nativen Zellen und des Tensids (links) und eines mit MC3T3-E1-Zellen besiedelten Gerüsts nach 4-wöchiger Kultur in osteogenem Differenzierungsmedium (rechts). Der Maßstabsbalken stellt 2 mm dar. (B) Repräsentative konfokale Laser-Scanning-Mikroskopbilder, die ausgesäte Zellen in aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten nach 4-wöchiger Kultur in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") oder osteogenem Differenzierungsmedium ("D") zeigen. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Die Färbung erfolgte auf den Scaffolds für Cellulose (rot) mit Propidiumiodid und für Zellkerne (blau) mit DAPI. (C) Porengrößenverteilung von dezellularisierten, aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten vor der Aussaat mit MC3T3-E1-Zellen aus maximalen Projektionen in der z-Achse von konfokalen Bildern. Die Analyse wurde an insgesamt 54 Poren in 3 verschiedenen Scaffolds durchgeführt (6 Poren in 3 zufällig ausgewählten Regions of Interest pro Scaffold). (D) Repräsentative Bilder von Scaffolds, die mit 5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat und Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT) gefärbt wurden, um die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) zu beurteilen, und mit Alizarinrot S (ARS) zur Visualisierung der Kalziumablagerung, was auf die Mineralisierung hinweist (Skalenbalken = 2 mm - gilt für alle). Die als "blank" gekennzeichneten Scaffolds (Scaffolds ohne ausgekeimte Zellen) zeigten keine Färbung mit BCIP/NBT, was auf das Fehlen einer ALP-Aktivität hindeutet. Auf der anderen Seite zeigten die zellbesiedelten Scaffolds, die in Differenzierungsmedium ("D") kultiviert wurden, eine höhere ALP-Aktivität, die durch eine intensivere blaue Farbe angezeigt wird, im Vergleich zu den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") kultiviert wurden. Für die ARS-Färbung zeigten sowohl die Blank-Scaffolds als auch die Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") kultiviert wurden, einen helleren Rotton im Vergleich zu den Scaffolds, die in Differenzierungsmedium ("D") kultiviert wurden. Das Vorhandensein von Kalziumablagerungen in den Scaffolds, die in Differenzierungsmedium ("D") kultiviert wurden, wurde durch eine intensive tiefrote Farbe veranschaulicht. Jede Analyse wurde auf drei verschiedenen Gerüsten (n = 3) durchgeführt. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Leblanc Latour (2023)27 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histologie, Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersive Spektroskopie (EDS) Analyse von In-vitro-Scaffolds . (A) Repräsentative Bilder der oberen histologischen Querschnitte der Scaffolds. In Paraffin eingebettete Gerüste wurden in 5 μm dicke Abschnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt wurden, um die Zellinfiltration sichtbar zu machen, oder mit von Kossa (VK), um die Mineralisierung innerhalb der Gerüste sichtbar zu machen. Die Scaffolds wurden mit MC3T3-E1-Zellen infiltriert, wie die blaue (Kerne) und rosa (Zytoplasma) Färbung an der Peripherie und im gesamten Gerüst zeigt. Kollagen (blassrosa) war ebenfalls sichtbar (vergrößerter Einsatz von "H&E - D"). Die Mineralisierung wurde nur an der Peripherie der Porenwände in den Gerüsten beobachtet, die in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") kultiviert wurden. Die Porenwände in den in Differenzierungsmedium ("D") kultivierten Scaffolds waren vollständig schwarz gefärbt. Die Analyse wurde an einem Gerüst durchgeführt, das in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") kultiviert wurde, und an zwei Gerüsten, die in Differenzierungsmedium ("D") kultiviert wurden (Maßstabsbalken für die Bilder mit niedrigerer Vergrößerung = 1 mm, Maßstabsbalken für die Bilder mit höherer Vergrößerung = 50 μm). (B) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen, die sowohl durch REM- als auch durch EDS-Spektren aufgenommen wurden. Die Gerüste wurden mit Gold bespritzt und mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop bei einer Spannung von 3,0 kV (Maßstab = 100 μm - gilt für alle) abgebildet. EDS-Spektren wurden auf jedem Gerüst aufgenommen. Phosphor- (2,013 keV) und Kalzium-Peaks (3,69 keV) sind in jedem EDS-Spektrum angegeben. Sowohl REM als auch EDS wurden auf drei verschiedenen Gerüsten durchgeführt. Rohling: Scaffolds ohne ausgesäte Zellen. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Leblanc Latour (2023)27 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Elastizitätsmodul von In-vitro-Scaffolds nach 4-wöchiger Kultur in Nicht-Differenzierungsmedium ("ND") oder Differenzierungsmedium ("D"). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von drei Replikationsstichproben für jede Bedingung dargestellt. Die statistische Signifikanz (* steht für p<0,05) wurde mit einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Tukey-Post-hoc-Test bestimmt. Rohling: Scaffolds ohne ausgesäte Zellen. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Leblanc Latour (2023)27 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gerüstfoto vor der Implantation und Push-Out-Test nach 8 Wochen nach Implantation: (A) Repräsentatives Foto eines Gerüsts vor der Implantation; (B) Einachsige Druckvorrichtung für die Push-out-Prüfungen, wobei die Wägezelle mit einem Sternchen (*) und die Probe mit einem Pfeil gekennzeichnet ist. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Leblanc Latour (2023)27 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Histologische Analyse von In-vitro-Scaffolds . Repräsentative Bilder histologischer Querschnitte von nicht besiedelten Scaffolds nach 8 Wochen Implantation. Die Schnitte wurden entweder mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um Zellen sichtbar zu machen, oder mit Masson-Goldner-Trichrom (MGT), um Kollagen sichtbar zu machen. Der Pfeil zeigt rote Blutkörperchen an. Das Vorhandensein von Kollagen ist sichtbar (Maßstabsbalken = 1 mm bzw. 200 μm für die linken bzw. rechten Einsätze). Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Leblanc Latour (2023)27 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Probennummer | Spitzenkraft (N) |
| 1 | 92.8 |
| 2 | 162.7 |
| 3 | 140.3 |
| 4 | 135.7 |
| 5 | 37.7 |
| 6 | 157.8 |
| 7 | 67.9 |
| Bedeuten | 113.6 |
| SEM | 18.2 |
Tabelle 1: Gemessene Spitzenkraft aus Push-Out-Tests.
Ergänzende Abbildung 1: Typische Spannungs-Dehnungs-Kurve für die Berechnung des Elastizitätsmoduls. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Mehrere In-vitro- und In-vivo-Studien haben die Biokompatibilität von pflanzlicher Cellulose und ihre potenzielle Verwendung im Tissue Engineeringnachgewiesen 14,15,16,18,19,20, insbesondere für die osteogene Differenzierung20,21. Ziel der vorliegenden Studie war es, das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für HdO weiter zu untersuchen und die mechanischen Eigenschaften dieser Gerüste sowohl in vitro als auch in vivo zu bewerten.
Für In-vitro-Studien wurden Präosteoblastenzellen (MC3T3-E1) in die Scaffolds gesät, nachdem die nativen Zellen aus dem Apfelgewebe eliminiert wurden. MC3T3-E1-Zellen werden häufig verwendet, um die Biomineralisation der extrazellulären Matrix zu untersuchen 28,29,30. Die Scaffolds wurden dann 4 Wochen lang in osteogenem Differenzierungs- oder Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass sich die Zellen innerhalb der Gerüste vermehrten und differenzierten, insbesondere wenn sie in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, was das Potenzial von Zellulosegerüsten aus Äpfeln zur Unterstützung der Entwicklung von Knochengewebe unterstreicht. Zellkerne wurden in großer Zahl in den Gerüstporen beobachtet, was Beobachtungen aus früheren Studien bestätigt 14,15,16,17,20,21. Darüber hinaus betrug der durchschnittliche Durchmesser der Gerüstporen, ähnlich wie bei unseren vorherigen Ergebnissen14 und denen einer anderen Gruppe21, ~154 μm, wobei die meisten Poren einen Durchmesser zwischen 100 μm und 200 μm aufwiesen (Abbildung 1C). Diese Abmessungen stimmen mit dem idealen Porengrößenbereich (100–200 μm) überein, von dem bekannt ist, dass er das Knochenwachstum erleichtert7.
Die Färbeanalyse zeigte eine höhere ALP-Aktivität nach einer 4-wöchigen Kulturperiode im Differenzierungsmedium. Es wurden mehr Kalziumablagerungen auf der Oberfläche der zellbesiedelten Scaffolds beobachtet, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, verglichen mit den Blindgerüsten und den zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit differenzierten hiPSCs in aus Äpfeln gewonnenen Scaffolds beobachtet21. Während das Vorhandensein von ALP in der vorliegenden Studie qualitativ untersucht wurde, konnten zusätzliche Assays für eine quantitative Analyse durchgeführt werden. Die histologische Auswertung der Scaffolds bestätigte zudem, dass die infiltrierten Osteoblasten die Scaffolds nach der Differenzierung mineralisierten. Bemerkenswert ist, dass die Peripherie der Konstrukte, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden, ebenfalls mit VK gefärbt wurde. Restliches CaCl2 in den Scaffolds könnte diese unspezifische Färbung verursacht haben, die in der Peripherie nach der Dezellularisierung beobachtet wurde. Eine qualitative Analyse der REM-Bilder wurde durchgeführt, um die Mineralisierung weiter zu bewerten. Nach der Kultivierung im Differenzierungsmedium zeigten die zellbesiedelten Scaffolds Anzeichen einer ECM-Mineralisierung. Mineralische Aggregate waren auf der Gerüstoberfläche sichtbar, insbesondere an den Rändern der Poren. Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Studien überein, in denen ECM30 und pflanzliche Gerüste verwendet wurden21. Diese Aggregate fehlten auf der Oberfläche der Gerüste ohne ausgesäte Zellen. Die EDS-Analyse der Aggregate ergab das Vorhandensein hoher P- und Ca-Konzentrationen, was auf das Vorhandensein von Apatit hindeutet. Bemerkenswert ist, dass das in der vorliegenden Studie beschriebene Protokoll zwar die Visualisierung der zellulären Infiltration und des Vorhandenseins von Mineralisierungen ermöglicht, jedoch nicht die Bewertung ihres Fortschreitens im Laufe der Zeit. Eine histologische Analyse zu mehreren Zeitpunkten wäre notwendig, um diese Progression vollständig beurteilen zu können. Darüber hinaus wären weitere Analysen erforderlich, um die zelluläre Infiltration und Mineralisierung an der Oberfläche sowie im gesamten Gerüst zu quantifizieren. Während die elementare Zusammensetzung der Minerallagerstätten durch EDS bestimmt wurde, können andere Charakterisierungstechniken, wie z. B. Röntgenbeugung (XRD), erforderlich sein, um Informationen über die Kristallstruktur der beobachteten Lagerstätten zu liefern.
Der Elastizitätsmodul der Scaffolds war nach der Kultivierung im Differenzierungsmedium signifikant höher (um etwa das 8-fache). Im Gegensatz dazu ähnelte der Modul der in Nicht-Differenzierungsmedium kultivierten Scaffolds dem der Blank-Scaffolds (Scaffolds ohne Samenzellen), ähnlich den Ergebnissen, die in einer früheren Studie mit aus Äpfeln gewonnenen Scaffolds berichtet wurden20. Trotz des höheren Elastizitätsmoduls der in Differenzierungsmedium kultivierten Gerüste blieb er viel niedriger als der von natürlichem Knochen (0,1 bis 2 GPa für trabekulären Knochen und 15 bis 20 GPa für kortikalen Knochen)8, spongiöse Allotransplantate (3,78 GPa)31, alloplastische Transplantate aus Polyetheretherketon (3,84 GPa)31, Titan (50,20 GPa)31 und Kobalt-Chrom-Legierung (53,15 GPa)31 implantate. Daher sind die Gerüste in ihrer derzeitigen Formulierung möglicherweise nicht für tragende Anwendungen geeignet. Bemerkenswert ist, dass der Elastizitätsmodul Aufschluss über die Steifigkeit eines Materials gibt. Die Streckgrenze könnte jedoch auch in Betracht gezogen werden, um ein breiteres Verständnis der mechanischen Eigenschaften des Gerüsts zu ermöglichen.
Dezellularisierte Apfelgerüste wurden dann bei Ratten (n = 6 Tiere) in 5 mm große bilaterale Schädelkrebsdefekte kritischer Größe implantiert. Push-out-Tests (an 7 Explantaten), die durchgeführt wurden, um die Integration der Gerüste in die Wirtskalvaria zu bewerten, zeigten, dass die durchschnittliche Spitzenkraft 113,6 N ± 18,2 N betrug, was der Frakturlast ähnelt, die zuvor für Schädelknochen berichtet wurde (127,1 ± 9,6 N)22, was darauf hindeutet, dass sich die Gerüste gut in das umgebende Knochengewebe integrieren. Zu beachten ist allerdings, dass der Push-Out-Test nur Aufschluss über die Grenzfläche zwischen dem Gerüst und dem umgebenden Gewebe gibt. Frühere Studien haben Push-Out-Tests mit Eindringtests kombiniert, um ein breiteres Verständnis der mechanischen Eigenschaften der Knochen-Implantat-Schnittstelle und des Gerüsts selbst zu erlangen22. Darüber hinaus sind bilaterale Defekte anfälliger für eine Fehlausrichtung mit dem Kolben32. Die richtige Platzierung des kranialen Explantats, des Einzeldefektmodells oder des zusätzlichen Klemmsystems auf der universellen Testvorrichtung könnte möglicherweise eine Fehlausrichtung32 vermeiden.
Zusammenfassend bestätigte diese Studie, dass aus Äpfeln gewonnene Zellulosegerüste die Adhäsion und Proliferation von Präosteoblasten fördern können. Darüber hinaus kam es zu einer Mineralisierung innerhalb der zellbesiedelten Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, was zu einer Erhöhung des Elastizitätsmoduls des Gerüsts führte. Der Modul blieb jedoch deutlich niedriger als der des natürlichen Knochens. Interessanterweise war die Kraft, die erforderlich war, um die implantierten Zellulosegerüste aus Äpfeln zu verschieben, vergleichbar mit der Frakturbelastung des Schädelknochens und anderer Arten von Gerüsten, die zuvor für HdO22 verwendet wurden. Schließlich, ähnlich wie in früheren Berichten dargestellt, infiltrierten Zellen die implantierten Gerüste und lagerten Kollagen ab. Insgesamt zeigt diese Studie das Potenzial von pflanzlichen Zellulosegerüsten für HdO-Anwendungen. Diese Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie überein, die von einer anderen Forschungsgruppe durchgeführt wurde und die Eignung von pflanzlichen Zellulosegerüsten für HdO-Zwecke weiter untermauert21. Nichtsdestotrotz unterstreicht die Ungleichheit in der Steifigkeit der Gerüste im Vergleich zu trabekulärem oder kortikalem Knochen, wie wichtig es ist, zusammengesetzte Biomaterialien zu entwickeln, die den mechanischen Eigenschaften des natürlichen Knochens besser entsprechen können. Trotz des zunehmenden Interesses an der Verwendung von pflanzlichen Gerüsten für HdO-Zwecke kann ihre Verwendung daher auf nicht-tragende Anwendungen beschränkt bleiben. Wie wir bereits gezeigthaben 16, kann die Umgestaltung von pflanzlichen Zellulosegerüsten durch chemische Modifikation oder die Entwicklung von Verbundwerkstoffen mit anderen biologischen/synthetischen Polymeren für tragende Anwendungen unerlässlich sein.
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Disclosures
Erklärung zu Interessenkonflikten: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. und A.P. sind Erfinder von Patentanmeldungen, die von der University of Ottawa und Spiderwort Inc. eingereicht wurden und die Verwendung von pflanzlicher Zellulose für HdO-Anwendungen betreffen. M.L.L., R.J.H., C.M.C. und A.P. haben finanzielle Beteiligungen an Spiderwort Inc.
Acknowledgments
Finanziert wurde das Projekt vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) und von der Li Ka Shing Foundation. M.L.L. wurde vom TalentEdge-Programm der Ontario Centers of Excellence unterstützt, und R.J.H. wurde durch ein NSERC-Postgraduiertenstipendium und ein Ontario Graduate Scholarship (OGS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
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