Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Decellulariserede æbleafledte stilladser til knoglevævsteknik in vitro og in vivo

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65226
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4,5, 1,2,6,7
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi metoder til decellularisering, fysisk karakterisering, billeddannelse og in vivo-implantation af plantebaserede biomaterialer samt metoder til cellesåning og differentiering i stilladserne. De beskrevne metoder tillader evaluering af plantebaserede biomaterialer til knoglevævstekniske applikationer.

Abstract

Planteafledte cellulosebiomaterialer er blevet anvendt i forskellige vævstekniske applikationer. In vivo-undersøgelser har vist den bemærkelsesværdige biokompatibilitet af stilladser fremstillet af cellulose afledt af naturlige kilder. Derudover har disse stilladser strukturelle egenskaber, der er relevante for flere væv, og de fremmer invasion og spredning af pattedyrceller. Nyere forskning ved hjælp af decellulariseret æblehypanthiumvæv har vist ligheden mellem dens porestørrelse og trabekulær knogle samt dens evne til effektivt at understøtte osteogen differentiering. Denne undersøgelse undersøgte yderligere potentialet for æbleafledte cellulosestilladser til knoglevævsteknik (BTE) applikationer og evaluerede deres in vitro og in vivo mekaniske egenskaber. MC3T3-E1 preosteoblaster blev podet i æbleafledte cellulosestilladser, der derefter blev vurderet for deres osteogene potentiale og mekaniske egenskaber. Alkalisk fosfatase og alizarinrød S-farvning bekræftede osteogen differentiering i stilladser dyrket i differentieringsmedium. Histologisk undersøgelse viste udbredt celleinvasion og mineralisering på tværs af stilladserne. Scanningelektronmikroskopi (SEM) afslørede mineralaggregater på overfladen af stilladserne, og energidispersiv spektroskopi (EDS) bekræftede tilstedeværelsen af fosfat- og calciumelementer. På trods af en signifikant stigning i Youngs modul efter celledifferentiering forblev det imidlertid lavere end for sundt knoglevæv. In vivo-undersøgelser viste celleinfiltration og aflejring af ekstracellulær matrix i de decellulariserede æbleafledte stilladser efter 8 ugers implantation i rottecalvaria. Desuden svarede den kraft, der kræves for at fjerne stilladserne fra knogledefekten, til den tidligere rapporterede brudbelastning af naturlig calvarial knogle. Samlet set bekræfter denne undersøgelse, at æbleafledt cellulose er en lovende kandidat til BTE-applikationer. Imidlertid kan forskellen mellem dets mekaniske egenskaber og sunde knoglevævs egenskaber begrænse dets anvendelse til scenarier med lav belastning. Yderligere strukturel rekonstruktion og optimering kan være nødvendig for at forbedre de mekaniske egenskaber af æbleafledte cellulosestilladser til bærende applikationer.

Introduction

Store knogledefekter forårsaget af en skade eller sygdom kræver ofte biomaterialetransplantater til fuldstændig regenerering1. Nuværende teknikker designet til at forbedre knoglevævsregenerering bruger regelmæssigt autologe, allogene, xenogene eller syntetiske transplantater2. Til autolog knogletransplantation, der betragtes som "guldstandard" podningspraksis for at reparere store knogledefekter, ekstraheres knogle fra patienten. Denne podningsprocedure har imidlertid flere ulemper, herunder størrelses- og formbegrænsninger, vævstilgængelighed og prøvetagningsstedsmorbiditet3. Desuden er autologe podningsprocedurer modtagelige for infektioner på operationsstedet, efterfølgende brud, hæmatomdannelse på prøveudtagningsstedet eller rekonstrueret sted og postoperativ smerte4. Knoglevævsteknik (BTE) tilbyder et potentielt alternativ til konventionelle knogletransplantationsmetoder5. Det kombinerer strukturelle biomaterialer og celler til at opbygge nyt funktionelt knoglevæv. Når man designer biomaterialer til BTE, er det afgørende at kombinere en makroporøs struktur, overfladekemi, der fremmer cellebinding, og mekaniske egenskaber, der ligner dem af native bone6. Tidligere forskning har vist, at den ideelle porestørrelse og elastiske modul for biomaterialer, der anvendes i BTE, er henholdsvis ca. 100-200 μm7 og 0,1-20 GPa afhængigt af podningsstedet8. Desuden er stilladsets porøsitet og poresammenkobling kritiske faktorer, der påvirker cellemigration, næringsstofdiffusion og angiogenese8.

BTE har vist lovende resultater med forskellige biomaterialer udviklet og evalueret som alternative muligheder for knogletransplantater. Nogle af disse biomaterialer er osteoinduktive materialer, hybridmaterialer og avancerede hydrogeler8. Osteoinduktive materialer stimulerer udviklingen af nydannede knoglestrukturer. Hybride materialer består af syntetiske og/eller naturlige polymerer8. Avancerede hydrogeler efterligner den ekstracellulære matrix (ECM) og er i stand til at levere de nødvendige bioaktive faktorer for at fremme knoglevævsintegration8. Hydroxyapatit er et traditionelt materiale og et almindeligt valg til BTE på grund af dets sammensætning og biokompatibilitet9. Bioaktivt glas er en anden type biomateriale til BTE, som har vist sig at stimulere specifikke celleresponser for at aktivere gener, der er nødvendige for osteogenese10,11. Bionedbrydelige polymerer, herunder poly(glycolsyre) og poly(mælkesyre), er også blevet anvendt i vid udstrækning i BTE-applikationer12. Endelig har naturlige eller naturligt afledte polymerer som chitosan, chitin og bakteriel cellulose også vist opmuntrende resultater for BTE13. Mens både syntetiske og naturlige polymerer viser potentiale for BTE, kræver udviklingen af et funktionelt stillads med den ønskede makrostruktur typisk omfattende protokoller.

Omvendt kan indfødte makroskopiske cellulosestrukturer let udvindes fra forskellige planter, og vores forskergruppe har tidligere demonstreret anvendeligheden af cellulosebaserede stilladser afledt af planter til forskellige vævsrekonstruktioner. Efter en simpel overfladeaktiv behandling udnyttede vi plantematerialets iboende struktur og fremhævede dets potentiale som et alsidigt biomateriale14. Desuden kan disse cellulosebaserede stilladser anvendes til in vitro pattedyrcellekulturapplikationer14, er biokompatible og understøtter spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vores forskningsgruppe og andre har vist, at disse stilladser kan fås fra specifikke anlæg baseret på den tilsigtede anvendelse 14,15,16,17,18,19,20. For eksempel udviser den vaskulære struktur, der observeres i plantestængler og blade, en slående lighed med strukturen, der findes i dyrevæv19. Derudover kan cellulosestilladser afledt af planter let formes og udsættes for overfladebiokemiske ændringer for at opnå de ønskede egenskaber16. I en nylig undersøgelse inkorporerede vi en saltbuffer under decellulariseringsprocessen, hvilket førte til forbedret cellebinding observeret både in vitro og in vivo indstillinger16. I samme undersøgelse demonstrerede vi anvendeligheden af planteafledte cellulosestilladser i kompositbiomaterialer ved at støbe hydrogeler på overfladen af stilladserne. I nyere undersøgelser har funktionalisering af planteafledte stilladser vist sig at forbedre deres effektivitet18. For eksempel afslørede en undersøgelse foretaget af Fontana et al. (2017), at vedhæftningen af humane dermale fibroblaster blev understøttet af RGD-belagte decellulariserede stængler, mens ikke-coatede stængler ikke udviste samme evne18. Desuden demonstrerede forfatterne også, at modificeret simuleret kropsvæske kunne udnyttes til kunstigt at mineralisere decellulariserede plantestængler. I nyere undersøgelser undersøgte vi begrebet mekanosensitiv osteogenese i planteafledte cellulosestilladser og vurderede deres potentiale for BTE17,20. Desuden brugte Lee et al. (2019) planteafledte stilladser til at dyrke knoglelignende væv i en in vitro-indstilling 21. Gennem omfattende evalueringer af forskellige plantekilder identificerede forfatterne æbleafledte stilladser som de mest optimale til dyrkning og differentiering af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er). Desuden foreslog forfatterne, at de strukturelle og mekaniske egenskaber ved de æbleafledte stilladser spiller en afgørende rolle for deres egnethed til det tilsigtede formål. Som de første planteafledte stilladser, der blev implementeret i vævstekniske applikationer, har æbleafledte stilladser i vid udstrækning vist sig at have en slående lignende arkitektur som den menneskelige knogle, især med hensyn til deres indbyrdes forbundne porer, der spænder fra 100 til 200 μm i diameter14,21.

I denne undersøgelse undersøgte vi yderligere potentialet i æbleafledte cellulosestilladser til BTE og gennemførte en analyse af deres mekaniske egenskaber både in vitro og in vivo. Selv om der har været undersøgelser af potentialet i æbleafledte stilladser til BTE 17,20,21, er deres mekaniske egenskaber blevet underundersøgt. Resultaterne viste vild spredning invasion og osteogen differentiering af MC3T3-E1 preosteoblaster podet i stilladser, der blev dyrket i differentieringsmedium i 4 uger. Youngs modul for disse stilladser var 192,0 ± 16,6 kPa, hvilket var signifikant højere end de blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) (31,6 ± 4,8 kPa) og de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det skal dog bemærkes, at Youngs modul for sundt humant knoglevæv typisk ligger inden for intervallet 0,1-2 GPa for trabekulær knogle og ca. 15-20 GPa for kortikal knogle8. Ikke desto mindre, efter en 8-ugers implantation i en gnaverkalvarialdefekt, syntes de cellefrøede stilladser at være godt integreret i den omgivende knogle, som demonstreret af en gennemsnitlig topkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tests, hvilket svarer til den tidligere rapporterede brudbelastning af native calvarial knogle22. Samlet set viser resultaterne fra denne undersøgelse betydelige løfter, især for ikke-bærende applikationer. Imidlertid har æbleafledte cellulosestilladser i øjeblikket ikke de nødvendige mekaniske egenskaber til nøjagtigt at matche det omgivende knoglevæv på et implantatsted. Derfor er der behov for yderligere udvikling for at frigøre det fulde potentiale af disse stilladser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokoller blev gennemgået og godkendt af University of Ottawa Animal Care Committee.

1. Forberedelse af stilladser

  1. Brug en mandolinskærer til at skære McIntosh-æbler (Canada Fancy) i 8 mm tykke skiver. Skær æbleskivernes hypanthiumvæv i firkanter på 5 mm x 5 mm.
  2. Anbring de firkantede prøver i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 2 dage.
  3. De decellulariserede prøver vaskes med deioniseret vand og inkuberes natten over ved stuetemperatur (RT) i 100 mMCaCl2 for at fjerne det resterende overfladeaktive stof.
  4. Steriliser prøverne (dvs. stilladser) i 70% ethanol i 30 minutter, vask dem med deioniseret vand og læg dem i en 24-brønds kulturplade inden cellesåning.

2. Cellekultur og stilladssåning

  1. Oprethold MC3T3-E1 Subclone 4-celler i cellekulturbehandlede skåle med en diameter på 10 cm under cellekulturforhold (37 °C i en befugtet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2).
  2. Forbered cellekulturmedium lavet af Eagle's minimum essential medium - alpha modifikation (α-MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
  3. Fjern cellerne fra kulturskålene ved trypsinisering (0,05% trypsin-EDTA), når de når 80% sammenløb.
  4. Centrifuger cellesuspensionen ved ca. 200 x g i 3 min. Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i α-MEM ved 2,5 x 107 celler pr. ml.
  5. Der pipetteres en 40 μL prøve af celleopslæmningen på stilladsets overflade, og cellerne klæber i 1 time under cellekulturbetingelser. Derefter tilsættes 2 ml kulturmedium til hver kulturbrønd på kulturpladen.
  6. Genopfyld kulturmediet hver 2-3 dage i 14 dage.
  7. Der fremstilles et differentieringsmedium ved tilsætning af 50 μg/ml ascorbinsyre og 4 mM natriumphosphat til det tidligere beskrevne cellekulturmedium.
  8. Inducer differentiering af MC3T3-E1-celler ved at inkubere stilladserne i differentieringsmedium i 4 uger. Genopfyld mediet hver 3-4 dage. Parallelt inkuberes stilladser i ikke-differentieringskulturmedium (dvs. medium uden kosttilskud til at fremkalde differentiering) i samme varighed med samme mediumændringsplan for at tjene som en negativ kontrol.

3. Målinger af porestørrelse ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi

  1. Vask de decellulariserede æbleafledte stilladser med fosfatbufret saltvand (PBS).
  2. Inkuber stilladserne i 1 ml 10% (v / v) calcofluor hvid plet i 25 minutter i mørke ved RT.
  3. Stilladserne (n = 3) vaskes med PBS, og tre tilfældigt udvalgte områder pr. stillads afbildes med et højhastighedsresonanskonfokal laserscanningsmikroskop (CLSM) ved 10x forstørrelse ved hjælp af en DAPI-kanal som følger:
    1. Konfiguration af laseremissionsfilter: 405 nm (laser); 425-475 nm (emission)
    2. Juster lasereffekten og detektoren manuelt for at sikre optimal billedoptagelse. Få en z-stak med 20 billeder med en trinstørrelse på 5 μm.
  4. Brug ImageJ-software til at behandle og analysere de konfokale billeder som følger:
    1. Brug funktionen Z-Project to Maximum Intensity til at oprette et billede, og anvend funktionen Find kanter til at fremhæve kanten af porerne.
    2. Spor porerne manuelt ved hjælp af værktøjet Frihåndsmarkering .
    3. Tilpas hver pore som en ellipse, mål længden af hovedaksen, kompiler alle målinger (i alt 54 i denne undersøgelse - 6 ud af 3 tilfældigt udvalgte områder for hvert stillads) og beregn gennemsnitslængden.

4. Cellefordelingsanalyse ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi

  1. Vask de cellefrøede stilladser, der dyrkes i ikke-differentierings- eller differentieringsmediet, tre gange med PBS. Fastgør stilladserne med 4% paraformaldehyd i 10 min.
  2. Hvert stillads vaskes grundigt med deioniseret vand, cellerne gennembores med en Triton-X 100-opløsning i 5 min, og vaskes igen med PBS.
  3. Stilladserne inkuberes i 1 ml 1% periodisk syre i 40 min og skylles med deioniseret vand14,16.
  4. Scaffolderne inkuberes i 1 ml af en opløsning indeholdende 100 mM natriummetabisulfit og 0,15 M saltsyre, suppleret med 100 μg/ml propidiumiodid. Nedsænk stilladserne helt i opløsningen.
  5. Vask stilladserne med PBS og pletter cellekernerne ved at inkubere stilladserne i en 5 mg/ml DAPI-opløsning i 10 minutter i mørke. Vask grundigt igen og opbevar stilladserne i PBS inden billeddannelse.
  6. Forestil dig tre tilfældigt udvalgte overflader af tre forskellige celleseedede stilladser med en højhastighedsresonans CLSM ved 10x forstørrelse ved hjælp af DAPI- og TRITC-kanaler som følger:
    1. Konfiguration af laseremissionsfilter:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissions: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Udledning: 570-620 nm
    2. Juster lasereffekten og detektoren manuelt for at sikre optimal billedoptagelse. Få en z-stak med 20 billeder med en trinstørrelse på 5 μm.
  7. Brug ImageJ-software til at behandle de konfokale billeder og oprette en maksimal projektion i z-aksen til billedanalyse ved hjælp af funktionen Z-Project to Maximum Strength .

5. Alkalisk fosfataseanalyse

  1. Vask de cellefrøede stilladser, der dyrkes i ikke-differentierings- eller differentieringsmediet, tre gange med PBS. Fastgør stilladserne med 10% neutral bufret formalin i 30 min. Fastgør blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) for at tjene som en negativ kontrol.
  2. Der fremstilles en 5-brom-4-chlor-3'-indolyphosphat- og nitroblå tetrazoliumfarvningsopløsning (BCIP/NBT) ved at opløse en BCIP/NBT-tablet i 10 ml deioniseret vand.
  3. Vask de faste stilladser med en 0,05% Tween-opløsning og pletter med BCIP/NBT-opløsningen i 20 minutter ved RT. Vask de farvede stilladser med en 0,05% Tween-opløsning og opbevar dem i PBS inden billeddannelse.
  4. Forestil dig de farvede stilladser med et 12-megapixel digitalkamera.

6. Analyse af calciumaflejring

  1. Vask de cellefrøede stilladser, der dyrkes i ikke-differentierings- eller differentieringsmediet, tre gange med PBS. Fastgør stilladserne med 10% neutral bufret formalin i 30 min. Fastgør blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) for at tjene som en negativ kontrol.
  2. Forbered en 2% (w / v) alizarin rød S (ARS) farvningsopløsning.
  3. Vask de faste stilladser med deioniseret vand og pletter dem med ARS-opløsningen i 1 time ved RT. Vask de farvede stilladser med deioniseret vand og opbevar dem i PBS inden billeddannelse.
  4. Forestil dig de farvede stilladser med et 12-megapixel digitalkamera.

7. Mineraliseringsanalyse

  1. Vask de cellefrøede stilladser, der dyrkes i ikke-differentierings- eller differentieringsmediet, tre gange med PBS. Fastgør stilladserne med 4% paraformaldehyd i 48 timer. Fastgør blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) for at tjene som en negativ kontrol.
  2. Prøverne dehydreres i opløsninger, der indeholder koncentrationer af ethanol, der stiger fra 50 % til 100 %, som tidligere beskrevet23.
  3. Udfør scanningelektronmikroskopi (SEM) og energidispersiv spektroskopi (EDS) for at analysere mineralaggregater som følger:
    1. Prøverne tørres med en kritisk punkttørrer i overensstemmelse med fabrikantens protokol24.
    2. Påfør en 5-nm guldfrakke på stilladserne ved hjælp af en guldsputtercoater efter producentens protokol25.
    3. Billede af stilladsets overflade med et scanningelektronmikroskop indstillet til 3 kV ved 85x forstørrelse.
    4. Udfør EDS ved at indstille scanningelektronmikroskopet til 15 kV. På tre tilfældigt udvalgte områder pr. stillads erhverves EDS-spektre til analyse af mineralaggregatsammensætning.

8. Youngs modulmålinger

  1. Fjern de celleseedede stilladser fra deres respektive inkubationsmedium, og test straks prøverne.
  2. Ved hjælp af et specialbygget uniaxialt kompressionsapparat udstyret med en 1,5 N vejecelle komprimeres stilladserne (n = 3 pr. tilstand) med en konstant hastighed på 3 mm·min-1 til en maksimal trykbelastning på 10% af stilladshøjden.
  3. Bestem Youngs modul ud fra hældningen af den lineære del af spændingsbelastningskurverne. I denne undersøgelse blev modulet bestemt mellem 9% og 10% stamme.

9. Celleinfiltration og mineraliseringsanalyse ved histologi: In vitro stilladser

  1. Vask de celleseedede stilladser, der dyrkes i ikke-differentierings- eller differentieringsmedium tre gange med PBS.
  2. Fastgør de cellefrøede stilladser med 4% paraformaldehyd i 48 timer før resuspension i 70% ethanol til opbevaring.
  3. Histologi:
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev hele det histologiske præparat (indlejring, sektionering og farvning) beskrevet i de næste trin udført af Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
    1. Efter dehydrering og indlejring i paraffin, skær prøverne i 5 μm tykke serielle sektioner, startende 1 mm inde i stilladserne, og monter sektionerne på mikroskopglas.
    2. Plet sektionerne med hæmatoxylin og eosin (H&E) eller von Kossa (VK) pletter.
    3. Billede sektionerne med et diasscannermikroskop ved 40x forstørrelse (n = 1 stillads i ikke-differentieringsmedium og n = 2 stilladser i differentieringsmedium i denne undersøgelse).
    4. Brug ImageJ-software til visuelt at evaluere celleinfiltration (H&E-farvning) og mineralisering (VK-farvning).

10. Rotte calvarial defekt model

  1. Få forsøgsprotokoller gennemgået og godkendt af den lokale dyreplejekomité.
  2. Forbered cirkulære (5 mm diameter og 1 mm tykkelse) decellulariserede stilladser efter afsnit 1 beskrevet ovenfor og ved hjælp af en 5 mm biopsistans.
  3. Udfør bilateral kraniotomi efter en etableret protokol26 som følger:
    1. Bedøv hanrotter med isofluran, først ved 3%, indtil de er bevidstløse, og derefter ved 2-3% under hele proceduren.
    2. Udsæt periosteum og kranium ved at skære den overliggende hud ved hjælp af et skalpelblad. Fjern periosteum.
    3. Opret bilaterale defekter i begge parietale knogler på hver side af sagittalsuturen ved hjælp af en tandbor udstyret med en trephin med en diameter på 5 mm under konstant vanding af 0,9% NaCl.
    4. Rens den omgivende knogle med 0,9% NaCl for at fjerne eventuelle knoglefragmenter.
    5. Placer de cirkulære, decellulariserede stilladser i defekterne.
    6. Luk den overliggende hud med 4-0 suturer.
  4. Giv rotterne ubegrænset adgang til mad og vand og overvåg dem dagligt.
  5. Efter 8 uger efter implantation aflives rotterne ved CO2 -indånding og thoraxperforering som en sekundær eutanasiforanstaltning.
  6. For at udsætte kraniet og hente implantaterne skal du fjerne huden, der dækker kraniet ved hjælp af et skalpelblad.
  7. Skær kraniet ved frontale og occipitale knogler og på siden af begge parietale knogler ved hjælp af en tandbor for at fjerne den øverste del af kraniet helt.

11. Push-out test

  1. Tilslut en uniaxial kompressionsenhed (med en 445 N-vejecelle) til USB-dataindsamlingsmodulet.
  2. Tilslut dataindsamlingsmodulet til en computer, der er udstyret med et softwareprogram til dataindsamling.
  3. Umiddelbart efter kranieekstraktion anbringes hver prøve (n = 7 implantater fra 4 dyr i nærværende undersøgelse) på prøveholderen af den uniaxiale kompressionsanordning, således at den dorsale side af knoglen vender opad.
  4. Sænk stemplet med 0,5 mm/min., indtil det udtrukne implantat berøres let.
  5. Start testen ved at sænke stemplet gennem implantatet indtil fuldstændig push-out, mens kompression påføres med en konstant hastighed på 0,5 mm/min ved hjælp af dataindsamlingssoftwaren.
  6. Registrer spidskraften på kraften vs. forskydningskurven ved hjælp af dataindsamlingssoftwaren.

12. Celleinfiltration og mineraliseringsanalyse ved histologi: In vivo-stilladser

  1. Fastgør den ekstraherede calvaria og implantater i 10% neutral bufret formalin i 72 timer før resuspension i 70% ethanol til opbevaring.
  2. Histologi:
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev al histologisk forberedelse (indlejring, sektionering og farvning) beskrevet i de næste trin udført af Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
    1. Skær prøverne (indlejret i methylmethacrylat) i 6 μm tykke sektioner på tre forskellige niveauer (øverst, nederst og mod midten) og monter dem på mikroskopglas.
    2. Plet sektionerne med enten H&E eller Masson-Goldners trichrome (MGT).
  3. Billede sektionerne med et diasscannermikroskop ved 40x forstørrelse (4 eksplanter fra 2 dyr i denne undersøgelse).
  4. Ved hjælp af ImageJ-software skal du visuelt evaluere celleinfiltration (H&E-farvning) og kollagenaflejring (MGT-farvning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling af porestørrelse, cellefordeling og in vitro-mineralisering (figur 1 og figur 2)
Fuldstændig fjernelse af indfødte cellulære komponenter i æblevævsstilladserne blev opnået efter behandling af stilladserne med SDS og CaCl2 (figur 1A). Stilladserne udviste en meget porøs struktur, som blev bekræftet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Kvantificeringen af billederne viste en gennemsnitlig porestørrelse på 154 μm ± 40 μm. Porestørrelsesfordelingen varierede mellem 73 μm og 288 μm. Imidlertid varierede størstedelen af porerne mellem 100 μm og 200 μm (figur 1C).

Efter en 4-ugers dyrkningsperiode i differentieringsmedium udviste de cellefrøede stilladser udbredte hvide mineralforekomster (figur 1A). Stilladserne indeholdende celler viste en uigennemsigtig hvid farve, hvilket tyder på mineralisering, hvilket ikke blev observeret i de tomme stilladser (stilladser uden frøede celler). Desuden afslørede analyse ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi en homogen cellefordeling inden for stilladserne (figur 1B).

Stilladser podet eller ej med celler blev farvet med BCIP / NBT og ARS for at analysere henholdsvis ALP-aktivitet og mineralisering (figur 1D). BCIP/NBT-farvningen afslørede en betydelig stigning i ALP-aktivitet (afbildet af en stærk lilla farve) inden for de cellefrøede stilladser, der dyrkes i differentieringsmedium, i modsætning til de tomme stilladser eller de cellefrøede stilladser, der dyrkes i ikke-differentieringsmedium. Ligeledes udviste de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i differentieringsmedium, en mere intens rød farve ved farvning med ARS, hvilket indikerer større mineralisering sammenlignet med de tomme stilladser eller de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium. Baggrundsfarvning blev observeret i de tomme stilladser, muligvis på grund af tilstedeværelsen af CaCl2 i decellulariseringsprotokollen.

Farvning (H&E og VK) blev udført på stilladserne for at analysere celleinfiltration og mineralisering, og SEM og EDS blev brugt til yderligere at evaluere mineralisering (figur 2). H&E-farvning (figur 2A) viste god celleinfiltration i de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i ikke-differentierings- eller differentieringsmedium. Flere kerner var synlige i periferien og i hele stilladserne. Tilstedeværelsen af kollagen blev også observeret i stilladserne i lyserød. Derudover afslørede VK-farvning udført på stilladserne efter 4 ugers kultur i differentieringsmedium, at porevæggene var farvede, mens calciumaflejringer udelukkende blev detekteret langs de ydre kanter af porevæggene i stilladserne dyrket i ikke-differentieringsmedium og kan have været resultatet af calciumabsorption under decellulariseringsbehandlingen. Lokaliseret mineralisering på overfladen af de cellefrøede stilladser dyrket i differentieringsmedium i 4 uger blev observeret ved SEM-analyse (figur 2B). Mere specifikt blev mineralforekomster, der lignede sfæroidaggregater, observeret på porernes periferi. I modsætning hertil blev der ikke observeret mineralaggregater på de blanke stilladser eller de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i 4 uger i ikke-differentieringsmedium. Forskellige karakteristiske toppe svarende til fosfor (P) og calcium (Ca) blev observeret i EDS-spektrene i de udvalgte interesseområder, specifikt på mineralforekomsterne observeret på de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i 4 uger i differentieringsmedium (figur 2B).

In vitro biomekanisk analyse (figur 3)
Youngs modul af de celleseedede stilladser blev målt efter 4 ugers kultur i enten ikke-differentierings- eller differentieringsmedium (n = 3 for hver eksperimentel tilstand). Det blev sammenlignet med Youngs modul af de blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) (figur 3). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i modulet mellem de tomme stilladser (31,6 kPa ± 4,8 kPa) og de celleseedede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). I modsætning hertil blev der konstateret en signifikant forskel mellem modulet for de tomme stilladser (31,6 kPa ± 4,8 kPa) og modulet for de celleseedede stilladser dyrket i differentieringsmedium (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Derudover blev der observeret en signifikant forskel (p < 0,001) mellem Youngs moduli af de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i ikke-differentierings- og differentieringsmedier. Supplerende figur 1 viser en typisk spændingsbelastningskurve for Youngs modulberegning.

In vivo biomekanisk ydeevne og knogleregenerering (figur 4 og figur 5)
Kirurgiske kraniotomier blev udført på i alt 6 Sprague-Dawley rotter. Bilaterale defekter med en diameter på 5 mm blev skabt i begge parietale knogler i kraniet ved hjælp af en trephinbur, og æbleafledte cellulosestilladser uden frøede celler blev implanteret i de calvariale defekter (figur 4A). Efter 8 ugers implantation blev dyrene aflivet, og den øverste del af deres kranier blev indsamlet og behandlet til enten mekanisk test eller histologisk analyse.

Baseret på visuel vurdering syntes stilladserne godt integreret i kraniet omkring væv. Mekaniske push-out tests blev udført for kvantitativt at vurdere integrationen af stilladserne (n = 7) i værtscalvariaen. Målingerne blev udført ved hjælp af en uniaxial kompressionsanordning (figur 4B) umiddelbart efter eutanasi af dyrene. Resultaterne viste, at spidskraften var 113,6 N ± 18,2 N (tabel 1).

Histologisk analyse blev udført for at vurdere celleinfiltration og aflejring af ekstracellulær matrix i de implanterede stilladser (figur 5). H &E farvning afslørede cellulær infiltration i stilladsporerne og tegn på vaskularisering, som det fremgår af tilstedeværelsen af blodkar i stilladserne. Derudover viste MGT-farvning tilstedeværelsen af kollagen i stilladserne.

Figure 1
Figur 1: Stilladsbilleder, porestørrelsesfordeling og in vitro-mineralisering . (A) Repræsentative fotografier af et æbleafledt cellulosestillads efter fjernelse af de naturlige celler og overfladeaktive stoffer (venstre) og et stillads podet med MC3T3-E1-celler efter 4 ugers dyrkning i osteogent differentieringsmedium (højre). Skalabjælken repræsenterer 2 mm. (B) Repræsentative konfokale laserscanningsmikroskopbilleder, der viser frøede celler i æbleafledte cellulosestilladser efter 4 ugers dyrkning i ikke-differentieringsmedium ("ND") eller osteogent differentieringsmedium ("D"). Skalabjælken repræsenterer 50 μm. Farvning blev udført på stilladserne for cellulose (rød) ved hjælp af propidiumiodid og for cellekerner (blå) ved hjælp af DAPI. (C) Porestørrelsesfordeling af decellulariserede æbleafledte cellulosestilladser, før de podes med MC3T3-E1-celler, fra maksimale projektioner i z-aksen af konfokale billeder. Analysen blev udført på i alt 54 porer i 3 forskellige stilladser (6 porer i 3 tilfældigt udvalgte interesseområder pr. stillads). (D) Repræsentative billeder af stilladser farvet med 5-brom-4-chlor-3'-indolyphosphat og nitroblåt tetrazolium (BCIP/NBT) til vurdering af alkalisk fosfataseaktivitet (ALP) og med alizarinrødt S (ARS) til visualisering af calciumaflejring, hvilket indikerer mineralisering (skalabjælke = 2 mm - gælder for alle). Stilladserne mærket som "blanke" (stilladser uden frøede celler) viste ingen farvning med BCIP / NBT, hvilket indikerer fraværet af ALP-aktivitet. På den anden side viste de cellefrøede stilladser dyrket i differentieringsmedium ("D") højere ALP-aktivitet, angivet med en mere intens blå farve sammenlignet med de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium ("ND"). Til ARS-farvning udviste både de tomme stilladser og stilladserne dyrket i ikke-differentieringsmedium ("ND") en lysere rød nuance sammenlignet med stilladserne dyrket i differentieringsmedium ("D"). Tilstedeværelsen af calciumaflejring i stilladserne dyrket i differentieringsmedium ("D") blev illustreret af en intens dyb rød farve. Hver analyse blev udført på tre forskellige stilladser (n = 3). Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Leblanc Latour (2023)27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Histologi, scanning elektronmikroskopi (SEM) og energidispersiv spektroskopi (EDS) analyse af in vitro stilladser. (A) Repræsentative billeder af de øverste histologiske tværsnit af stilladserne. Paraffinindlejrede stilladser blev skåret i 5 μm tykke sektioner, der blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H & E) for at visualisere celleinfiltration eller med von Kossa (VK) for at visualisere mineralisering i stilladserne. Stilladser blev infiltreret med MC3T3-E1-celler, som vist ved blå (kerner) og lyserød (cytoplasma) farvning synlig i periferien og i hele stilladserne. Kollagen (lyserød) var også synlig (zoomet ind indsat af "H &E - D"). Mineralisering blev kun observeret i periferien af porevæggene i stilladserne dyrket i ikke-differentieringsmedium ("ND"). Porevæggene i stilladserne dyrket i differentieringsmedium ("D") var helt farvet i sort. Analysen blev udført på et stillads dyrket i ikke-differentieringsmedium ("ND") og på to stilladser dyrket i differentieringsmedium ("D") (skalabjælke for de nederste forstørrelsesbilleder = 1 mm, skalabjælke for de højere forstørrelsesbilleder = 50 μm). (B) Repræsentative mikrografier opnået af SEM såvel som EDS-spektre. Stilladserne gennemgik sputterbelægning med guld og blev afbildet ved hjælp af et feltemissionsscanningelektronmikroskop ved en spænding på 3,0 kV (skalastang = 100 μm - gælder for alle). EDS-spektre blev erhvervet på hvert stillads. Fosfor (2,013 keV) og calcium (3,69 keV) toppe betegnes på hvert EDS-spektrum. Både SEM og EDS blev udført på tre forskellige stilladser. Blank: stilladser uden frøede celler. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Leblanc Latour (2023)27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Youngs moduli af in vitro stilladser efter 4 ugers dyrkning i enten ikke-differentieringsmedium ("ND") eller differentieringsmedium ("D"). Data præsenteres som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet (SEM) af tre replikate prøver for hver tilstand. Statistisk signifikans (* angiver p<0,05) blev bestemt ved hjælp af en envejsanalyse af varians (ANOVA) og Tukey post-hoc test. Blank: stilladser uden frøede celler. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Leblanc Latour (2023)27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Stilladsfotografi før implantation og push-out test efter 8 ugers implantation: (A) Repræsentativt fotografi af et stillads før implantation; B) Uniaxial kompressionsanordning, der anvendes til push-out-prøvningerne, med vejecellen angivet med en asterisk (*) og prøven angivet med en pil. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Leblanc Latour (2023)27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Histologisk analyse af in vitro stilladser. Repræsentative billeder af histologiske tværsnit fra ikke-frøede stilladser efter 8 ugers implantation. Sektionerne blev farvet med enten hæmatoxylin og eosin (H & E) for at visualisere celler eller Masson-Goldners trikrom (MGT) for at visualisere kollagen. Pilen angiver røde blodlegemer. Tilstedeværelsen af kollagen er synlig (skalastang = 1 mm og 200 μm for henholdsvis venstre og højre indsats). Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Leblanc Latour (2023)27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøve nummer Spidskraft (N)
1 92.8
2 162.7
3 140.3
4 135.7
5 37.7
6 157.8
7 67.9
Betyde 113.6
SEM 18.2

Tabel 1: Målt spidskraft fra push-out-test.

Supplerende figur 1: Typisk spændingsbelastningskurve til Youngs modulberegning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere in vitro- og in vivo-undersøgelser har vist biokompatibiliteten af planteafledt cellulose og dens potentielle anvendelse i vævsteknik 14,15,16,18,19,20, mere specifikt til hosting af osteogen differentiering 20,21. Formålet med denne undersøgelse var yderligere at undersøge potentialet for æbleafledte cellulosestilladser til BTE og at vurdere disse stilladsers mekaniske egenskaber både in vitro og in vivo.

Til in vitro-undersøgelser blev preosteoblastceller (MC3T3-E1) podet i stilladserne efter eliminering af de indfødte celler fra æblevævet. MC3T3-E1-celler bruges almindeligvis til at undersøge biomineraliseringen af ekstracellulær matrix 28,29,30. Stilladser blev derefter dyrket i 4 uger i osteogen differentiering eller ikke-differentieringsmedium. Resultaterne viste, at cellerne spredte sig og gennemgik differentiering inden for stilladserne, især når de blev dyrket i differentieringsmedium, hvilket fremhævede potentialet i cellulosestilladser afledt af æbler til at understøtte udviklingen af knoglevæv. Cellekerner blev observeret i stort antal i stilladsporerne, hvilket bekræftede observationer rapporteret i tidligere undersøgelser 14,15,16,17,20,21. I lighed med vores tidligere fund14 og dem fra en anden gruppe21 var den gennemsnitlige diameter af stilladsporerne ~ 154 μm, med de fleste porer med diametre mellem 100 μm og 200 μm (figur 1C). Disse dimensioner er i overensstemmelse med det ideelle porestørrelsesområde (100-200 μm), der vides at lette knoglevækst7.

Farvningsanalysen viste højere ALP-aktivitet efter en 4-ugers dyrkningsperiode i differentieringsmedium. Flere calciumaflejringer blev observeret på overfladen af de cellefrøede stilladser dyrket i differentieringsmedium sammenlignet med både de tomme stilladser og de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium. Lignende resultater er blevet observeret med differentierede hiPSC'er i æbleafledte stilladser21. Mens tilstedeværelsen af ALP blev kvalitativt vurderet i denne undersøgelse, kunne der udføres yderligere assays til en kvantitativ analyse. Den histologiske evaluering af stilladserne bekræftede yderligere, at de infiltrerede osteoblaster mineraliserede stilladserne efter differentiering. Især periferien af konstruktionerne dyrket i ikke-differentieringsmedium blev også farvet med VK. Resterende CaCl2 i stilladserne kan have forårsaget denne ikke-specifikke farvning observeret i periferien efter decellularisering. En kvalitativ analyse af SEM-billeder blev udført for yderligere at vurdere mineralisering. Efter dyrkning i differentieringsmedium udviste cellefrøede stilladser tegn på ECM-mineralisering. Mineralaggregater var synlige på stilladsoverfladen, specifikt ved kanterne af porerne. Disse observationer er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser med ECM30 og planteafledte stilladser21. Disse aggregater var fraværende på overfladen af stilladserne uden frøede celler. EDS-analyse af aggregaterne afslørede tilstedeværelsen af høje niveauer af P og Ca, hvilket tyder på tilstedeværelsen af apatit. Det skal bemærkes, at mens protokollen beskrevet i denne undersøgelse tillader visualisering af cellulær infiltration og tilstedeværelsen af mineralisering, tillader den ikke vurdering af deres progression over tid. Histologisk analyse på flere tidspunkter ville være nødvendig for fuldt ud at evaluere denne progression. Derudover ville yderligere analyse være nødvendig for at kvantificere cellulær infiltration og mineralisering på overfladen såvel som gennem hele stilladset. Endelig, mens den elementære sammensætning af mineralforekomsterne blev bestemt af EDS, kan andre karakteriseringsteknikker, såsom røntgendiffraktion (XRD), være nødvendige for at give information om krystalstrukturen af de observerede aflejringer.

Youngs modul af stilladserne var signifikant højere efter kultur i differentieringsmedium (med ca. 8 gange). I modsætning hertil lignede modulet på stilladserne dyrket i ikke-differentieringsmedium det for de tomme stilladser (stilladser uden frøede celler), svarende til resultater rapporteret i en tidligere undersøgelse med æbleafledte stilladser20. På trods af det højere Youngs modul af stilladserne dyrket i differentieringsmedium forblev det meget lavere end for naturlig knogle (0,1 til 2 GPa for trabekulær knogle og 15 til 20 GPa for kortikal knogle)8, annulleret allograft (3,78 GPa)31, alloplastiske transplantater lavet af polyether-ether-keton (3,84 GPa)31, titanium (50,20 GPa)31 og kobolt-kromlegering (53,15 GPa)31 Implantater. Derfor er stilladserne i deres nuværende formulering muligvis ikke egnede til bærende applikationer. Det skal bemærkes, at Youngs modul giver information om stivheden af et materiale. Flydespændingen kan dog også anses for at give en bredere forståelse af stilladsets mekaniske egenskaber.

Decellulariserede æblestilladser blev derefter implanteret i 5 mm bilaterale kritiske størrelse calvariale defekter hos rotter (n = 6 dyr). Push-out tests (på 7 eksplanter), udført for at evaluere integrationen af stilladserne i værtscalvaria, viste, at den gennemsnitlige maksimale kraft var 113,6 N ± 18,2 N, hvilket svarer til den frakturbelastning, der tidligere blev rapporteret for calvarial knogle (127,1 ± 9,6 N)22, hvilket tyder på, at stilladserne integrerede sig godt i det omgivende knoglevæv. Det skal dog bemærkes, at push-out-testen kun giver information om grænsefladen mellem stilladset og det omgivende væv. Tidligere undersøgelser har kombineret push-out-test med indrykningstest for at give en bredere forståelse af de mekaniske egenskaber ved knogleimplantatgrænsefladen og selve stilladset22. Derudover er bilaterale defekter mere tilbøjelige til at fejljustere med stemplet32. Korrekt placering af kranieeksplantatet, enkeltdefektmodellen eller yderligere fastspændingssystem på universalprøvningsanordningen kan potentielt forhindre fejljustering32.

Sammenfattende bekræftede denne undersøgelse, at æbleafledte cellulosestilladser kunne fremme præosteoblastadhæsion og spredning. Derudover forekom mineralisering inden for de cellefrøede stilladser, der blev dyrket i differentieringsmedium, hvilket førte til en stigning i stilladset Youngs modul. Imidlertid forblev modulet signifikant lavere end for naturlig knogle. Interessant nok var den kraft, der var nødvendig for at fortrænge de implanterede æbleafledte cellulosestilladser, sammenlignelig med brudbelastningen af calvarial knogle og andre typer stilladser, der tidligere blev brugt til BTE22. Endelig, i lighed med resultater illustreret i tidligere rapporter, infiltrerede celler de implanterede stilladser og deponerede kollagen. Samlet set viser denne undersøgelse potentialet i cellulosestilladser afledt af planter til BTE-applikationer. Disse resultater er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse foretaget af en anden forskergruppe, der yderligere underbygger egnetheden af planteafledte cellulosestilladser til BTE-formål21. Ikke desto mindre fremhæver forskellen i stilladsernes stivhed sammenlignet med trabekulær eller kortikal knogle vigtigheden af at udvikle sammensatte biomaterialer, der bedre kan matche de mekaniske egenskaber ved naturlig knogle. På trods af den stigende interesse for at bruge planteafledte stilladser til BTE-formål kan deres anvendelse derfor forblive begrænset til ikke-bærende applikationer. Som vi tidligere har demonstreret16, kan re-engineering af planteafledte cellulosestilladser via kemisk modifikation eller udvikling af kompositter med andre biologiske/syntetiske polymerer være afgørende for bærende applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Erklæring om interessekonflikt: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. og A.P. er opfindere af patentansøgninger indgivet af University of Ottawa og Spiderwort Inc. vedrørende brugen af planteafledt cellulose til BTE-applikationer. M.L.L., R.J.H., C.M.C. og A.P. har økonomiske interesser i Spiderwort Inc.

Acknowledgments

Finansiering til dette projekt blev ydet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) og af Li Ka Shing Foundation. M.L.L. modtog støtte fra Ontario Centers of Excellence TalentEdge-programmet, og RIH blev støttet af et NSERC postgraduate stipendium og et Ontario Graduate Scholarship (OGS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole ThermoFisher D1306 DAPI
Alizarin red S Sigma-Aldrich A5533 ARS
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 Cell Culture
Calcium Chloride ThermoFisher AA12316 CaCl2
Calcofluor White Sigma-Aldrich 18909
Dental drill Surgical tool
Ethanol ThermoFisher 615095000
Fetal bovine serum Hyclone Laboratories SH30396 FBS
Formalin Sigma-Aldrich HT501128 10% Formalin
Goldner's trichrome stain Sigma-Aldrich 1.00485 GTC
Hematoxylin and eosin stain Fisher Scientific NC1470670 H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope Nikon Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
ImageJ software National Institutes of Health
Irrigation saline Baxter JF7123 0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells ATCC CRL-2593 Pre-osteoblast cells
McIntosh apples Canada Fancy grade
Methyl methacrylate Sigma-Aldrich M55909 Histological embedding
Minimum Essential Medium ThermoFisher M0894 α-MEM
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 4%; PFA
Penicillin/Streptomycin Hyclone Laboratories SV30010 Cell Culture
Periodic acid Sigma-Aldrich 375810
Phosphate buffered saline Hyclone Laboratories 2810305 PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide Invitrogen p3566
Scanning electron microscope JEOL JSM-7500F FESEM SEM and EDS
Slide scanner microscope Zeiss AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166 SDS
Sodium metabisulphite Sigma-Aldrich 31448
Sodium phosphate ThermoFisher BP329
Sprague-Dawley rats Charles-River Laboratories 400 Male
Sutures Ethicon J494G 4-0
Trephine ACE Surgical Supply Co 583-0182 5-mm diameter
Triton-X 100 ThermoFisher 807423
Trypsin Hyclone Laboratories SH30236.02 Cell Culture
Tween Fisher Scientific BP337
Universal compression Device CellScale UniVert
Von Kossa stain Sigma-Aldrich 1.00362 Histology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
  3. Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
  4. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  5. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
  7. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  8. Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
  9. Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
  10. Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
  11. Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
  12. Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
  13. Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
  14. Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
  15. Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  16. Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
  17. Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
  18. Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
  19. Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  20. Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
  21. Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
  22. Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
  23. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
  24. tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
  25. Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
  26. Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
  27. Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
  28. Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
  29. Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
  30. Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
  31. Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
  32. Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 204
Decellulariserede æbleafledte stilladser til knoglevævsteknik <em>in vitro</em> og <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leblanc Latour, M., Tarar, M.,… More

Leblanc Latour, M., Tarar, M., Hickey, R. J., Cuerrier, C. M., Catelas, I., Pelling, A. E. Decellularized Apple-Derived Scaffolds for Bone Tissue Engineering In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (204), e65226, doi:10.3791/65226 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter