Summary
I denna studie beskriver vi metoder för decellularisering, fysikalisk karakterisering, avbildning och in vivo implantation av växtbaserade biomaterial, samt metoder för cellsådd och differentiering i ställningarna. De beskrivna metoderna gör det möjligt att utvärdera växtbaserade biomaterial för benvävnadstekniska tillämpningar.
Abstract
Biomaterial av växtbaserad cellulosa har använts i olika vävnadstekniska tillämpningar. In vivo-studier har visat den anmärkningsvärda biokompatibiliteten hos byggnadsställningar gjorda av cellulosa som härrör från naturliga källor. Dessutom har dessa strukturer strukturella egenskaper som är relevanta för flera vävnader, och de främjar invasion och proliferation av däggdjursceller. Ny forskning med hjälp av decellulariserad äppelhypanthiumvävnad har visat likheten i dess porstorlek med trabekulärt ben samt dess förmåga att effektivt stödja osteogen differentiering. I den aktuella studien undersöktes vidare potentialen hos cellulosaställningar från äpplen för tillämpningar inom benvävnadsteknik (BTE) och deras mekaniska egenskaper in vitro och in vivo . MC3T3-E1 preosteoblaster såddes i äppelbaserade cellulosaställningar som sedan bedömdes för sin osteogena potential och mekaniska egenskaper. Alkaliskt fosfatas och alizarinrött S-färgning bekräftade osteogen differentiering i byggnadsställningar odlade i differentieringsmedium. Histologisk undersökning visade på utbredd cellinvasion och mineralisering över ställningarna. Svepelektronmikroskopi (SEM) avslöjade mineralaggregat på ytan av byggnadsställningarna, och energidispersiv spektroskopi (EDS) bekräftade förekomsten av fosfat- och kalciumelement. Men trots en signifikant ökning av Youngs modul efter celldifferentiering, förblev den lägre än för frisk benvävnad. In vivo-studier visade cellinfiltration och deponering av extracellulär matris i de decellulariserade äppelbaserade stöden efter 8 veckors implantation i råtta calvaria. Dessutom var den kraft som krävdes för att ta bort ställningarna från bendefekten liknande den tidigare rapporterade frakturbelastningen av naturligt kalvarben. Sammantaget bekräftar denna studie att cellulosa från äpplen är en lovande kandidat för BTE-ansökningar. Olikheten mellan dess mekaniska egenskaper och de hos frisk benvävnad kan dock begränsa dess tillämpning till scenarier med låg belastning. Ytterligare strukturell omkonstruktion och optimering kan vara nödvändig för att förbättra de mekaniska egenskaperna hos cellulosaställningar från äpplen för bärande applikationer.
Introduction
Stora bendefekter orsakade av en skada eller sjukdom kräver ofta biomaterialtransplantat för fullständig regenerering1. Nuvarande tekniker som är utformade för att förbättra regenerering av benvävnad använder regelbundet autologa, allogena, xenogena eller syntetiska transplantat2. För autolog bentransplantation, som anses vara "guldstandarden" för transplantation för att reparera stora bendefekter, extraheras ben från patienten. Denna ympningsprocedur har dock flera nackdelar, inklusive storleks- och formbegränsningar, vävnadstillgänglighet och morbiditet på provtagningsstället3. Dessutom är autologa transplantationsprocedurer känsliga för infektioner i operationsområdet, efterföljande frakturer, hematombildning vid provtagnings- eller rekonstruktionsstället och postoperativ smärta4. Benvävnadsteknik (BTE) erbjuder ett potentiellt alternativ till konventionella bentransplantationsmetoder5. Den kombinerar strukturella biomaterial och celler för att bygga ny funktionell benvävnad. Vid design av biomaterial för BTE är det viktigt att kombinera en makroporös struktur, ytkemi som främjar cellbindning och mekaniska egenskaper som liknar dem hos naturligt ben6. Tidigare forskning har indikerat att den ideala porstorleken och elasticitetsmodulen för biomaterial som används i BTE är cirka 100-200 μm7 respektive 0,1-20 GPa, beroende på ympningsställe8. Dessutom är porositeten och porsammankopplingen av ställningarna kritiska faktorer som påverkar cellmigration, näringsdiffusion och angiogenes8.
BTE har visat lovande resultat med olika biomaterial som utvecklats och utvärderats som alternativ till bentransplantat. Några av dessa biomaterial är osteoinduktiva material, hybridmaterial och avancerade hydrogeler8. Osteoinduktiva material stimulerar utvecklingen av nybildade benstrukturer. Hybridmaterial består av syntetiska och/eller naturliga polymerer8. Avancerade hydrogeler efterliknar den extracellulära matrisen (ECM) och kan leverera de nödvändiga bioaktiva faktorerna för att främja benvävnadsintegration8. Hydroxiapatit är ett traditionellt material och ett vanligt val för BTE på grund av dess sammansättning och biokompatibilitet9. Bioaktivt glas är en annan typ av biomaterial för BTE, som har visat sig stimulera specifika cellsvar för att aktivera gener som är nödvändiga för osteogenes10,11. Biologiskt nedbrytbara polymerer, inklusive poly(glykolsyra) och poly(mjölksyra), har också använts i stor utsträckning i BTE-tillämpningar12. Slutligen har naturliga eller naturligt framställda polymerer som kitosan, kitin och bakteriell cellulosa också visat uppmuntrande resultat för BTE13. Men även om både syntetiska och naturliga polymerer visar potential för BTE, kräver utvecklingen av en funktionell ställning med den önskade makrostrukturen vanligtvis omfattande protokoll.
Omvänt kan inhemska makroskopiska cellulosastrukturer lätt härledas från olika växter och vår forskargrupp har tidigare visat att cellulosabaserade strukturer som härrör från växter kan användas för olika vävnadsrekonstruktioner. Efter en enkel ytaktiv behandling utnyttjade vi växtmaterialets inneboende struktur och lyfte fram dess potential som ett mångsidigt biomaterial14. Dessutom kan dessa cellulosabaserade strukturer användas för in vitro-cellodling av däggdjur14, är biokompatibla och stöder spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vår forskargrupp och andra har visat att dessa ställningar kan erhållas från specifika växter baserat på den avsedda applikationen 14,15,16,17,18,19,20. Till exempel uppvisar den kärlstruktur som observerats i växtstammar och blad en slående likhet med den struktur som finns i djurvävnader19. Dessutom kan cellulosaställningar som härrör från växter lätt formas och utsättas för ytbiokemiska modifieringar för att uppnå de önskade egenskaperna16. I en nyligen genomförd studie införlivade vi en saltbuffert under decellulariseringsprocessen, vilket ledde till ökad cellbindning som observerades både i in vitro- och in vivo-miljöer 16. I samma studie demonstrerade vi tillämpbarheten av växtbaserade cellulosaställningar i kompositbiomaterial genom att gjuta hydrogeler på ytan av ställningarna. I nyligen genomförda studier har funktionaliseringen av växtbaserade ställningar visat sig förbättra deras effektivitet18. Till exempel visade en studie utförd av Fontana et al. (2017) att vidhäftningen av humana dermala fibroblaster stöddes av RGD-belagda decellulariserade stjälkar, medan icke-belagda stjälkar inte uppvisade samma förmåga18. Dessutom visade författarna också att modifierad simulerad kroppsvätska kunde användas för att artificiellt mineralisera decellulariserade växtstammar. I nyare studier har vi undersökt begreppet mekanokänslig osteogenes i växtbaserade cellulosastrukturer och bedömt deras potential för BTE17,20. Dessutom använde Lee et al. (2019) växtbaserade byggnadsställningar för att odla benliknande vävnader i en in vitro-miljö 21. Genom omfattande utvärderingar av olika växtkällor identifierade författarna äppelbaserade strukturer som de mest optimala för odling och differentiering av humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC). Vidare föreslog författarna att de strukturella och mekaniska egenskaperna hos de äppelbaserade ställningarna spelar en avgörande roll för deras lämplighet för det avsedda ändamålet. Som de första växtbaserade stödstrukturer som implementerades i vävnadstekniska tillämpningar, har det i stor utsträckning visat sig att de har en slående lik arkitektur som mänskligt ben, särskilt när det gäller deras sammankopplade porer som sträcker sig från 100 till 200 μm i diameter14,21.
I den aktuella studien undersökte vi vidare potentialen hos äppelbaserade cellulosaställningar för BTE och genomförde en analys av deras mekaniska egenskaper både in vitro och in vivo. Även om det har gjorts studier om potentialen hos ställningar som härrör från äpplen för BTE 17,20,21, har deras mekaniska egenskaper undersökts för lite. Resultaten visade vildspridd invasion och osteogen differentiering av MC3T3-E1 preosteoblaster sådda i scaffolds som odlades i differentieringsmedium i 4 veckor. Youngs modul för dessa ställningar var 192,0 ± 16,6 kPa, vilket var signifikant högre än för de tomma ställningarna (ställningar utan fröceller) (31,6 ± 4,8 kPa) och de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det bör dock noteras att Youngs modul av frisk mänsklig benvävnad vanligtvis faller inom intervallet 0,1-2 GPa för trabekulärt ben och cirka 15-20 GPa för kortikalt ben8. Icke desto mindre, efter en 8-veckors implantation i en gnagare, verkade de cellsådda ställningarna vara väl integrerade i det omgivande benet, vilket demonstrerades av en genomsnittlig toppkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tester, vilket liknar den tidigare rapporterade frakturbelastningen av naturligt kalvarben22. Sammantaget visar resultaten från denna studie betydande löften, särskilt för icke-bärande applikationer. Cellulosaställningar från äpplen har dock för närvarande inte de mekaniska egenskaper som krävs för att exakt matcha den omgivande benvävnaden på ett implantatställe. Följaktligen krävs ytterligare utveckling för att frigöra den fulla potentialen hos dessa ställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella protokollen granskades och godkändes av University of Ottawa Animal Care Committee.
1. Förberedelse av ställning
- Använd en mandolinskärare för att skära McIntosh-äpplen (Canada Fancy) i 8 mm tjocka skivor. Skär hypanthiumvävnaden i äppelskivorna i rutor på 5 mm x 5 mm.
- Placera de fyrkantiga proverna i 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 2 dagar.
- Tvätta de decellulariserade proverna med avjoniserat vatten och inkubera dem över natten vid rumstemperatur (RT) i 100 mM CaCl2 för att avlägsna det återstående ytaktiva ämnet.
- Sterilisera proverna (dvs. byggnadsställningar) i 70 % etanol i 30 minuter, tvätta dem med avjoniserat vatten och placera dem i en odlingsplatta med 24 brunnar före cellsådd.
2. Cellodling och sådd av ställningar
- Underhåll MC3T3-E1 Subklona 4 celler i cellkulturbehandlade skålar med en diameter på 10 cm under cellodlingsförhållanden (37 °C i en fuktad atmosfär med 95 % luft och 5 % CO2).
- Förbered cellodlingsmedium tillverkat av Eagles minsta essentiella medium - alfamodifiering (α-MEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin/streptomycin.
- Lossa cellerna från odlingsskålarna genom trypsinisering (0,05 % trypsin-EDTA) när de når 80 % sammanflöde.
- Centrifugera cellsuspensionen vid ca 200 x g i 3 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i α-MEM vid 2,5 x 107 celler per ml.
- Pipettera en 40 μl alikvot av cellsuspensionen på ytan av stödställningarna och låt cellerna fästa i 1 timme under cellodlingsförhållanden. Tillsätt därefter 2 ml odlingsmedium till varje odlingsbrunn på odlingsplattan.
- Fyll på odlingsmediet var 2-3:e dag i 14 dagar.
- Bered ett differentieringsmedium genom att tillsätta 50 μg/ml askorbinsyra och 4 mM natriumfosfat till det tidigare beskrivna cellodlingsmediet.
- Inducera differentiering av MC3T3-E1-celler genom att inkubera strukturerna i differentieringsmedium i 4 veckor. Fyll på medium var 3-4:e dag. Parallellt, inkubera strukturer i icke-differentieringsodlingsmedium (dvs. medium utan tillskott för att inducera differentiering) under samma tid, med samma mediebytesschema för att fungera som en negativ kontroll.
3. Mätning av porstorlek med konfokal laserskanningsmikroskopi
- Tvätta de decellulariserade äppelbaserade ställningarna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Inkubera ställningarna i 1 ml 10 % (v/v) kalcofluor vitbets i 25 minuter i mörker vid RT.
- Tvätta ställningarna (n = 3) med PBS och avbilda tre slumpmässigt utvalda områden per ställning med ett höghastighetsresonant konfokallaserskanningsmikroskop (CLSM) vid 10x förstoring, med hjälp av en DAPI-kanal, enligt följande:
- Konfiguration av laseremissionsfilter: 405 nm (laser); 425-475 nm (emission)
- Justera lasereffekten och detektorn manuellt för att säkerställa optimal bildtagning. Skaffa en z-stack med 20 bilder med en stegstorlek på 5 μm.
- Använd programvaran ImageJ för att bearbeta och analysera de konfokala bilderna enligt följande:
- Använd funktionen Z-projekt till maximal intensitet för att skapa en bild och använd funktionen Hitta kanter för att markera porernas kanter.
- Spåra porerna manuellt med frihandsmarkeringsverktyget .
- Montera varje por som en ellips, mät längden på huvudaxeln, sammanställ alla mätningar (totalt 54 i den aktuella studien - 6 i 3 slumpmässigt utvalda områden för varje ställning) och beräkna den genomsnittliga längden.
4. Cellfördelningsanalys med konfokal laserskanningsmikroskopi
- Tvätta de cellsådda ställningarna som odlats i icke-differentierings- eller differentieringsmediet tre gånger med PBS. Fäst ställningarna med 4 % paraformaldehyd i 10 min.
- Tvätta varje ställning noggrant med avjoniserat vatten, permeabilisera cellerna med en Triton-X 100-lösning i 5 minuter och tvätta igen med PBS.
- Inkubera ställningarna i 1 ml 1% periodisk syra i 40 minuter och skölj med avjoniserat vatten14,16.
- Inkubera ställningarna i 1 ml lösning innehållande 100 mM natriummetabisulfit och 0,15 M saltsyra, tillsatt med 100 μg/ml propidiumjodid. Sänk ner ställningarna helt i lösningen.
- Tvätta ställningarna med PBS och färga cellkärnorna genom att inkubera ställningarna i en 5 mg/ml DAPI-lösning i 10 minuter i mörker. Tvätta noggrant igen och förvara ställningarna i PBS före avbildning.
- Föreställ dig tre slumpmässigt utvalda ytor av tre olika cellsådda ställningar med en höghastighetsresonant CLSM vid 10x förstoring, med hjälp av DAPI- och TRITC-kanaler, enligt följande:
- Konfiguration av laseremissionsfilter:
DAPI: Laser: 405 nm; Utsläpp: 425-475 nm
TRITC: Laser: 561 nm; Utsläpp: 570-620 nm - Justera lasereffekten och detektorn manuellt för att säkerställa optimal bildtagning. Skaffa en z-stack med 20 bilder med en stegstorlek på 5 μm.
- Konfiguration av laseremissionsfilter:
- Använd programvaran ImageJ för att bearbeta de konfokala bilderna och skapa en maximal projektion i z-axeln för bildanalys med hjälp av funktionen Z-Project to Maximum Intense .
5. Analys av alkaliskt fosfatas
- Tvätta de cellsådda ställningarna som odlats i icke-differentierings- eller differentieringsmediet tre gånger med PBS. Fixera ställningarna med 10 % neutralt buffrat formalin i 30 minuter. Fixa tomma ställningar (ställningar utan sådda celler) för att fungera som en negativ kontroll.
- Bered en 5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat och nitro-blå tetrazolium (BCIP/NBT) färgningslösning genom att lösa upp en BCIP/NBT-tablett i 10 ml avjoniserat vatten.
- Tvätta de fasta ställningarna med en 0,05 % interpoleringslösning och färga med BCIP/NBT-lösningen i 20 minuter vid RT. Tvätta de färgade ställningarna med en 0,05 % Tween-lösning och förvara dem i PBS före avbildning.
- Föreställ dig de fläckiga byggnadsställningarna med en 12-megapixel digitalkamera.
6. Analys av kalciumdeposition
- Tvätta de cellsådda ställningarna som odlats i icke-differentierings- eller differentieringsmediet tre gånger med PBS. Fixera ställningarna med 10 % neutralt buffrat formalin i 30 minuter. Fixa tomma ställningar (ställningar utan sådda celler) för att fungera som en negativ kontroll.
- Bered en 2% (w/v) alizarin red S (ARS) färgningslösning.
- Tvätta de fasta ställningarna med avjoniserat vatten och färga dem med ARS-lösningen i 1 timme vid RT. Tvätta de färgade ställningarna med avjoniserat vatten och förvara dem i PBS före avbildning.
- Föreställ dig de fläckiga byggnadsställningarna med en 12-megapixel digitalkamera.
7. Analys av mineraliseringar
- Tvätta de cellsådda ställningarna som odlats i icke-differentierings- eller differentieringsmediet tre gånger med PBS. Fäst ställningarna med 4% paraformaldehyd i 48 timmar. Fixa tomma ställningar (ställningar utan sådda celler) för att fungera som en negativ kontroll.
- Torka proverna i lösningar som innehåller koncentrationer av etanol som ökar från 50 % till 100 %, som tidigare beskrivits23.
- Utför svepelektronmikroskopi (SEM) och energidispersiv spektroskopi (EDS) för att analysera mineralaggregat enligt följande:
- Torka proverna med en torktumlare med kritisk punkt enligt tillverkarens protokoll24.
- Applicera en 5-nm guldbeläggning på ställningarna med en guldsputterbeläggning, enligt tillverkarens protokoll25.
- Föreställ dig ytan på ställningarna med ett svepelektronmikroskop inställt på 3 kV, vid 85x förstoring.
- Utför EDS genom att ställa in svepelektronmikroskopet på 15 kV. På tre slumpmässigt utvalda områden per ställning, samla in EDS-spektra för analys av mineralaggregatsammansättning.
8. Youngs modulmätningar
- Ta bort de cellsådda ställningarna från respektive inkubationsmedium och testa omedelbart proverna.
- Använd en specialbyggd enaxlig kompressionsapparat utrustad med en lastcell på 1,5 N och komprimera ställningarna (n = 3 per tillstånd) med en konstant hastighet av 3 mm·min-1 till en maximal tryckbelastning på 10 % av ställningens höjd.
- Bestäm Youngs modul från lutningen på den linjära delen av spännings-töjningskurvorna. I den aktuella studien bestämdes modulen mellan 9 % och 10 % töjning.
9. Cellinfiltration och mineraliseringsanalys genom histologi: In vitro-ställningar
- Tvätta de cellsådda ställningarna som odlats i icke-differentierings- eller differentieringsmedium tre gånger med PBS.
- Fixera de cellsådda ställningarna med 4 % paraformaldehyd i 48 timmar innan de återupplöses i 70 % etanol för lagring.
- Histologi:
OBS: I den aktuella studien utfördes hela den histologiska förberedelsen (inbäddning, snittning och färgning) som beskrivs i nästa steg av Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).- Efter uttorkning och inbäddning i paraffin, skär proverna i 5 μm tjocka seriesektioner, med början 1 mm inuti ställningarna, och montera sektionerna på objektglas.
- Färga sektionerna med hematoxylin och eosin (H&E) eller von Kossa (VK) fläckar.
- Avbilda sektionerna med ett objektskannermikroskop vid 40x förstoring (n = 1 ställning i icke-differentieringsmedium och n = 2 ställningar i differentieringsmedium i denna studie).
- Med hjälp av programvaran ImageJ kan du visuellt utvärdera cellinfiltration (H&E-färgning) och mineralisering (VK-färgning).
10. Modell för kalvvarial defekt hos råtta
- Få försöksprotokoll granskade och godkända av den lokala djurvårdskommittén.
- Förbered cirkulära (5 mm diameter och 1 mm tjocklek) decellulariserade ställningar enligt avsnitt 1 som beskrivs ovan och använd en 5 mm biopsistans.
- Utför bilateral kraniotomi enligt ett fastställt protokoll26, enligt följande:
- Bedöva hanråttor av Sprague-Dawley med isofluran, först med 3 % tills de är medvetslösa, och sedan med 2-3 % under hela proceduren.
- Exponera benhinnan och kraniet genom att skära av den överliggande huden med ett skalpellblad. Ta bort benhinnan.
- Skapa bilaterala defekter i båda parietalbenen på vardera sidan av sagittalsuturen med hjälp av en tandborr utrustad med en 5 mm diameter trefin under konstant bevattning av 0,9 % NaCl.
- Rengör det omgivande benet med 0.9 % NaCl för att ta bort eventuella benfragment.
- Placera de cirkulära, decellulariserade ställningarna i defekterna.
- Stäng den överliggande huden med 4-0 suturer.
- Ge råttorna obegränsad tillgång till mat och vatten och övervaka dem dagligen.
- Efter 8 veckor efter implantation, avliva råttorna genom CO2 -inhalation och bröstkorgsperforation som en sekundär avlivningsåtgärd.
- För att exponera kraniet och hämta implantaten, ta bort huden som täcker skallen med hjälp av ett skalpellblad.
- Skär skallen vid frontal- och nackbenen och på sidan av båda parietalbenen med hjälp av en tandborr för att ta bort den övre delen av skallen helt.
11. Utskjutningsprov
- Anslut en enaxlig kompressionsenhet (med en 445 N lastcell) till USB-datainsamlingsmodulen.
- Anslut datainsamlingsmodulen till en dator utrustad med ett datainsamlingsprogram.
- Omedelbart efter kraniell extraktion, placera varje prov (n = 7 implantat från 4 djur i denna studie) på provhållaren på den enaxliga kompressionsanordningen så att den dorsala sidan av benet är vänd uppåt.
- Sänk kolven med 0,5 mm/min tills den lätt vidrör det extraherade implantatet.
- Starta testet genom att sänka kolven genom implantatet tills den är helt utskjutande samtidigt som du applicerar kompression med en konstant hastighet på 0.5 mm/min med hjälp av datainsamlingsprogrammet.
- Registrera toppkraften på kraft- kontra förskjutningskurvan med hjälp av datainsamlingsprogramvaran.
12. Cellinfiltration och mineraliseringsanalys genom histologi: In vivo-ställningar
- Fixera den extraherade calvaria och implantaten i 10 % neutralt buffrat formalin i 72 timmar innan de blandas om i 70 % etanol för förvaring.
- Histologi:
OBS: I den aktuella studien utfördes all histologisk förberedelse (inbäddning, snittning och färgning) som beskrivs i nästa steg av Accel Labs (Montreal, QC, Kanada).- Skär proverna (inbäddade i metylmetakrylat) i 6 μm tjocka sektioner på tre olika nivåer (topp, botten och mot mitten) och montera dem på objektglas.
- Betsa sektionerna med antingen H&E eller Masson-Goldners trikrom (MGT).
- Avbilda sektionerna med ett objektskannermikroskop vid 40x förstoring (4 explantat från 2 djur i denna studie).
- Med hjälp av programvaran ImageJ kan du visuellt utvärdera cellinfiltration (H&E-färgning) och kollagenavsättning (MGT-färgning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mätning av porstorlek, cellfördelning och in vitro-mineralisering (Figur 1 och Figur 2)
Fullständigt avlägsnande av de naturliga cellulära komponenterna i äppelvävnadsställningarna uppnåddes efter behandling av stödstrukturerna med SDS och CaCl2 (figur 1A). Ställningarna uppvisade en mycket porös struktur, vilket bekräftades med hjälp av konfokalmikroskopi. Kvantifieringen av bilderna visade en genomsnittlig porstorlek på 154 μm ± 40 μm. Porstorleksfördelningen varierade mellan 73 μm och 288 μm. Majoriteten av porerna varierade dock mellan 100 μm och 200 μm (Figur 1C).
Efter en 4-veckors odlingsperiod i differentieringsmedium uppvisade de cellsådda ställningarna utbredda vita mineralavlagringar (Figur 1A). Ställningarna som innehöll celler uppvisade en ogenomskinlig vit färg, vilket tyder på mineralisering, vilket inte observerades i de tomma ställningarna (ställningar utan fröade celler). Vidare visade analys med konfokal laserskanningsmikroskopi en homogen cellfördelning inom stödstrukturerna (Figur 1B).
Ställningar med eller utan besådd med celler färgades med BCIP/NBT och ARS för att analysera ALP-aktivitet respektive mineralisering (Figur 1D). BCIP/NBT-färgningen avslöjade en betydande ökning av ALP-aktiviteten (avbildad med en stark lila färg) i de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium, i motsats till de tomma ställningarna eller de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium. På samma sätt uppvisade de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium en mer intensiv röd färg vid färgning med ARS, vilket indikerar större mineralisering jämfört med de tomma ställningarna eller de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium. Bakgrundsfärgning observerades i de tomma ställningarna, möjligen på grund av närvaron av CaCl2 i decellulariseringsprotokollet.
Färgning (H&E och VK) utfördes på ställningarna för att analysera cellinfiltration och mineralisering, och SEM och EDS användes för att ytterligare utvärdera mineraliseringen (Figur 2). H&E-färgning (Figur 2A) visade god cellinfiltration i de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentierings- eller differentieringsmedium. Flera kärnor var synliga i periferin och i hela ställningarna. Förekomsten av kollagen observerades också i byggnadsställningarna i ljusrosa. Dessutom visade VK-färgning utförd på ställningarna efter 4 veckors odling i differentieringsmedium att porväggarna var färgade medan kalciumavlagringar endast detekterades längs ytterkanterna av porväggarna i ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium och kan ha orsakats av kalciumabsorption under decellulariseringsbehandlingen. Lokaliserad mineralisering på ytan av de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium under 4 veckor observerades genom SEM-analys (Figur 2B). Mer specifikt observerades mineralavlagringar som liknade sfäroidaggregat i periferin av porerna. Däremot observerades inga mineralaggregat på de tomma ställningarna eller de cellsådda ställningarna odlade under 4 veckor i icke-differentieringsmedium. Distinkta karakteristiska toppar motsvarande fosfor (P) och kalcium (Ca) observerades i EDS-spektra för de utvalda regionerna av intresse, särskilt på de mineralfyndigheter som observerades på de cellsådda ställningarna som odlades i 4 veckor i differentieringsmedium (Figur 2B).
Biomekanisk analys in vitro (figur 3)
Youngs modul för de cellsådda strukturerna mättes efter 4 veckors odling i antingen icke-differentierings- eller differentieringsmedium (n = 3 för varje experimentellt tillstånd). Den jämfördes med Youngs modul för de tomma ställningarna (ställningar utan fröceller) (figur 3). Ingen signifikant skillnad observerades i modulen mellan blankställningarna (31,6 kPa ± 4,8 kPa) och de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Däremot noterades en signifikant skillnad mellan modulen för de tomma ställningarna (31,6 kPa ± 4,8 kPa) och modulen för de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Dessutom observerades en signifikant skillnad (p < 0,001) mellan Youngs moduler hos de cellsådda strukturerna odlade i icke-differentierings- och differentieringsmedier. Tilläggsfigur 1 visar en typisk spännings-töjningskurva för Youngs modulberäkning.
Biomekanisk prestanda in vivo och benregenerering (figur 4 och figur 5)
Kirurgiska kraniotomier utfördes på totalt 6 Sprague-Dawley-råttor. Bilaterala defekter med en diameter på 5 mm skapades i båda hjässbenen i skallen med hjälp av en trefinborr, och cellulosastrukturer från äpplen utan fröceller implanterades i de kalvvariala defekterna (Figur 4A). Efter 8 veckors implantation avlivades djuren och den övre delen av deras skallar samlades in och bearbetades för antingen mekanisk testning eller histologisk analys.
Baserat på visuell bedömning verkade ställningarna väl integrerade i skallen som omger vävnader. Mekaniska utskjutningstester utfördes för att kvantitativt bedöma integrationen av ställningarna (n = 7) i värdkalvvarian. Mätningarna utfördes med hjälp av en enaxlad kompressionsanordning (figur 4B) omedelbart efter avlivningen av djuren. Resultaten visade att toppkraften var 113,6 N ± 18,2 N (Tabell 1).
Histologisk analys utfördes för att bedöma cellinfiltration och deponering av extracellulär matris i de implanterade stödstrukturerna (Figur 5). H&E-färgning avslöjade cellulär infiltration i ställningens porer och tecken på vaskularisering, vilket visas av närvaron av blodkärl i ställningarna. Dessutom visade MGT-färgning närvaron av kollagen i ställningarna.
Figur 1: Ställningsbilder, porstorleksfördelning och in vitro-mineralisering . (A) Representativa fotografier av en cellulosaställning från äpple efter avlägsnande av de ursprungliga cellerna och det ytaktiva ämnet (vänster) och en ställning sådd med MC3T3-E1-celler efter 4 veckors odling i osteogent differentieringsmedium (höger). Skalstapeln representerar 2 mm. (B) Representativa bilder av konfokallaserskanningsmikroskop som visar sådda celler i cellulosastrukturer från äpplen efter 4 veckors odling i icke-differentieringsmedium ("ND") eller osteogent differentieringsmedium ("D"). Skalstapeln representerar 50 μm. Färgning utfördes på ställningarna för cellulosa (röd) med propidiumjodid och för cellkärnor (blå) med DAPI. (C) Porstorleksfördelning av decellulariserade cellulosastrukturer från äpplen, innan de besåddes med MC3T3-E1-celler, från maximala projektioner i z-axeln av konfokala bilder. Analysen utfördes på totalt 54 porer i 3 olika ställningar (6 porer i 3 slumpmässigt utvalda regioner av intresse per ställning). (D) Representativa bilder av byggnadsställningar färgade med 5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat och nitroblått tetrazolium (BCIP/NBT) för att bedöma alkalisk fosfatasaktivitet (ALP) och med alizarinrött S (ARS) för att visualisera kalciumdeposition, vilket indikerar mineralisering (skalstreck = 2 mm - gäller alla). Ställningarna märkta som "blanka" (ställningar utan fröceller) visade ingen färgning med BCIP/NBT, vilket indikerar frånvaron av ALP-aktivitet. Å andra sidan uppvisade de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium ("D") högre ALP-aktivitet, vilket indikeras av en mer intensiv blå färg, jämfört med de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium ("ND"). För ARS-färgning uppvisade både de tomma ställningarna och ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium ("ND") en ljusare nyans av rött jämfört med ställningarna odlade i differentieringsmedium ("D"). Förekomsten av kalciumdeposition i de byggnadsställningar som odlats i differentieringsmedium ("D") illustrerades av en intensiv djupröd färg. Varje analys utfördes på tre olika ställningar (n = 3). Denna figur har anpassats med tillstånd från Leblanc Latour (2023)27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av histologi, svepelektronmikroskopi (SEM) och energidispersiv spektroskopi (EDS) av in vitro-strukturer . (A) Representativa bilder av de viktigaste histologiska tvärsnitten av ställningarna. Paraffininbäddade byggnadsställningar skars i 5 μm tjocka sektioner som färgades med hematoxylin och eosin (H&E) för att visualisera cellinfiltration, eller med von Kossa (VK) för att visualisera mineralisering i ställningarna. Byggnadsställningarna infiltrerades med MC3T3-E1-celler, vilket framgår av blå (kärnor) och rosa (cytoplasma) färgningar som är synliga i periferin och i hela ställningarna. Kollagen (ljusrosa) syntes också (inzoomad infällning av "H&E - D"). Mineralisering observerades endast i periferin av porväggarna i de byggnadsställningar som odlats i icke-differentieringsmedium ("ND"). Porväggarna i ställningarna som odlats i differentieringsmedium ("D") var helt svartbetsade. Analysen utfördes på en ställning odlad i icke-differentieringsmedium ("ND") och på två ställningar odlad i differentieringsmedium ("D") (skalstapel för de lägre förstoringsbilderna = 1 mm, skalstapel för de högre förstoringsbilderna = 50 μm). B) Representativa mikrofotografier erhållna med SEM- och EDS-spektra. Ställningarna genomgick sputterbeläggning med guld och avbildades med ett fältemissionssvepelektronmikroskop med en spänning på 3,0 kV (skalstapel = 100 μm - gäller alla). EDS-spektra samlades in på varje ställning. Fosfor- (2,013 keV) och kalciumtoppar (3,69 keV) betecknas på varje EDS-spektrum. Både SEM och EDS utfördes på tre olika ställningar. Tom: ställningar utan sådda celler. Denna figur har anpassats med tillstånd från Leblanc Latour (2023)27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Youngs moduler av in vitro-strukturer efter 4 veckors odling i antingen icke-differentieringsmedium ("ND") eller differentieringsmedium ("D"). Data presenteras som medelvärde ± medelfel av medelvärdet (SEM) för tre replikatprov för varje tillstånd. Statistisk signifikans (* indikerar p<0,05) bestämdes med hjälp av en envägsanalys av varians (ANOVA) och Tukey post-hoc-testet. Tom: ställningar utan sådda celler. Denna figur har anpassats med tillstånd från Leblanc Latour (2023)27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ställningsfotografi före implantation och utskjutningstest efter 8 veckors implantation: (A) Representativt fotografi av en ställning före implantation; B) Enaxlig kompressionsanordning som används för utskjutningsprovningarna, med belastningsmätaren markerad med en asterisk (*) och provexemplaret markerad med en pil. Denna figur har anpassats med tillstånd från Leblanc Latour (2023)27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Histologisk analys av in vitro-stöd . Representativa bilder av histologiska tvärsnitt från icke-sådda ställningar efter 8 veckors implantation. Sektionerna färgades med antingen hematoxylin och eosin (H&E) för att visualisera celler eller Masson-Goldners trikrom (MGT) för att visualisera kollagen. Pilen indikerar röda blodkroppar. Närvaron av kollagen är synlig (skalstreck = 1 mm och 200 μm för vänster respektive höger infällningar). Denna figur har anpassats med tillstånd från Leblanc Latour (2023)27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Urval nummer | Maximal kraft (N) |
| 1 | 92.8 |
| 2 | 162.7 |
| 3 | 140.3 |
| 4 | 135.7 |
| 5 | 37.7 |
| 6 | 157.8 |
| 7 | 67.9 |
| Betyda | 113.6 |
| SEM | 18.2 |
Tabell 1: Uppmätt toppkraft från utskjutningstester.
Tilläggsfigur 1: Typisk spännings-töjningskurva för Youngs modulberäkning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera in vitro- och in vivo-studier har visat biokompatibiliteten hos växtbaserad cellulosa och dess potentiella användning inom vävnadsteknik 14,15,16,18,19,20, mer specifikt för att hysa osteogen differentiering 20,21. Syftet med denna studie var att ytterligare undersöka potentialen hos cellulosaställningar från äpplen för BTE och att bedöma de mekaniska egenskaperna hos dessa ställningar både in vitro och in vivo.
För in vitro-studier såddes preosteoblastceller (MC3T3-E1) i ställningarna efter att ha eliminerat de ursprungliga cellerna från äppelvävnaden. MC3T3-E1-celler används ofta för att undersöka biomineraliseringen av extracellulär matrix 28,29,30. Ställningarna odlades sedan i 4 veckor i osteogent differentierings- eller icke-differentieringsmedium. Resultaten indikerade att cellerna förökade sig och genomgick differentiering inom stödstrukturerna, särskilt när de odlades i differentieringsmedium, vilket belyser potentialen hos cellulosaställningar som härrör från äpplen för att stödja utvecklingen av benvävnad. Cellkärnor observerades i stort antal i ställningens porer, vilket bekräftar observationer som rapporterats i tidigare studier 14,15,16,17,20,21. Dessutom, i likhet med våra tidigare fynd14 och de från en annan grupp21, var den genomsnittliga diametern på ställningens porer ~154 μm, med de flesta porerna med diametrar mellan 100 μm och 200 μm (Figur 1C). Dessa dimensioner överensstämmer med det ideala porstorleksintervallet (100–200 μm) som är känt för att underlätta bentillväxt7.
Färgningsanalysen visade högre ALP-aktivitet efter en 4-veckors odlingsperiod i differentieringsmedium. Mer kalciumavlagringar observerades på ytan av de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium jämfört med både de tomma ställningarna och de cellsådda ställningarna odlade i icke-differentieringsmedium. Liknande resultat har observerats med differentierade hiPSCs i äppelhärledda stödstrukturer21. Medan förekomsten av ALP bedömdes kvalitativt i den aktuella studien, kunde ytterligare analyser utföras för en kvantitativ analys. Den histologiska utvärderingen av ställningarna bekräftade vidare att de infiltrerade osteoblasterna mineraliserade ställningarna efter differentiering. Noterbart är att periferin av de konstruktioner som odlats i icke-differentieringsmedium också färgades med VK. Kvarvarande CaCl2 i byggnadsställningarna kan ha orsakat denna ospecifika färgning som observerats i periferin efter decellularisering. En kvalitativ analys av SEM-bilder utfördes för att ytterligare bedöma mineraliseringen. Efter odling i differentieringsmedium uppvisade cellsådda ställningar tecken på ECM-mineralisering. Mineralaggregat var synliga på ställningens yta, särskilt vid porernas kanter. Dessa observationer överensstämmer med tidigare studier med ECM30 och växtbaserade ställningar21. Dessa aggregat saknades på ytan av ställningarna utan sådda celler. EDS-analys av aggregaten avslöjade förekomsten av höga nivåer av P och Ca, vilket tyder på förekomst av apatit. Värt att notera är att även om protokollet som beskrivs i den aktuella studien tillåter visualisering av cellulär infiltration och närvaron av mineralisering, tillåter det inte bedömning av deras progression över tid. Histologisk analys vid flera tidpunkter skulle vara nödvändig för att fullt ut utvärdera denna progression. Dessutom skulle ytterligare analyser krävas för att kvantifiera cellulär infiltration och mineralisering på ytan såväl som i hela ställningen. Slutligen, medan mineralfyndigheternas elementära sammansättning bestämdes med EDS, kan andra karakteriseringstekniker, såsom röntgendiffraktion (XRD), krävas för att ge information om kristallstrukturen hos de observerade fyndigheterna.
Youngs modul för ställningarna var signifikant högre efter odling i differentieringsmedium (med cirka 8 gånger). Däremot liknade modulen för de ställningar som odlades i icke-differentieringsmedium den för de tomma ställningarna (ställningar utan fröceller), liknande fynd som rapporterats i en tidigare studie med ställningar från äpplen20. Trots Youngs högre modul för de strukturer som odlats i differentieringsmedium, förblev den mycket lägre än för naturligt ben (0,1 till 2 GPa för trabekulärt ben och 15 till 20 GPa för kortikalt ben)8, spongiöst allograft (3,78 GPa)31, alloplastiska transplantat gjorda av polyeter-eter-keton (3,84 GPa)31, titan (50,20 GPa)31 och kobolt-kromlegering (53,15 GPa)31 Implantat. Därför kan ställningarna i sin nuvarande formulering vara olämpliga för bärande applikationer. Värt att notera är att Youngs modul ger information om styvheten hos ett material. Sträckgränsen kan dock också anses ge en bredare förståelse för ställningens mekaniska egenskaper.
Decellulariserade äppelställningar implanterades sedan i 5 mm bilaterala kritiska kalkvariala defekter hos råttor (n = 6 djur). Push-out-tester (på 7 explantat), utförda för att utvärdera integrationen av ställningarna i värdkalvvarian, indikerade att den genomsnittliga toppkraften var 113,6 N ± 18,2 N, vilket liknar den frakturbelastning som tidigare rapporterats för kalvarben (127,1 ± 9,6 N)22, vilket tyder på att ställningarna integrerades väl i den omgivande benvävnaden. Det bör dock noteras att push-out-testet endast ger information om gränssnittet mellan ställningen och den omgivande vävnaden. Tidigare studier har kombinerat push-out-tester med indenteringstester för att ge en bredare förståelse för de mekaniska egenskaperna hos gränssnittet mellan ben och implantat och själva ställningen22. Dessutom är bilaterala defekter mer benägna att felinrikta sig med kolven32. Korrekt placering av kraniets explantat, modellen med en defekt eller ytterligare klämsystem på den universella testanordningen kan potentiellt undvika felinriktning32.
Sammanfattningsvis bekräftade denna studie att cellulosaställningar från äpplen kan främja vidhäftning och proliferation av preosteoblaster. Dessutom förekom mineralisering i de cellsådda ställningarna odlade i differentieringsmedium, vilket ledde till en ökning av ställningen Youngs modul. Modulen förblev dock betydligt lägre än för naturligt ben. Intressant nog var den kraft som behövdes för att förskjuta de implanterade cellulosaställningarna från äpplet jämförbar med frakturbelastningen på kalvarben och andra typer av ställningar som tidigare använts för BTE22. Slutligen, i likhet med resultaten som illustrerats i tidigare rapporter, infiltrerade celler de implanterade ställningarna och deponerade kollagen. Sammantaget visar denna studie potentialen hos cellulosaställningar som härrör från växter för BTE-applikationer. Dessa resultat överensstämmer med en tidigare studie utförd av en annan forskargrupp, som ytterligare styrker lämpligheten av växtbaserade cellulosaställningar för BTE-ändamål21. Skillnaden i styvhet hos byggnadsställningarna jämfört med trabekulärt eller kortikalt ben belyser dock vikten av att utveckla sammansatta biomaterial som bättre kan matcha de mekaniska egenskaperna hos naturligt ben. Därför, trots det ökande intresset för att använda växtbaserade ställningar för BTE-ändamål, kan deras användning förbli begränsad till icke-bärande applikationer. Som vi tidigare visat16 kan det vara viktigt att omkonstruera växtbaserade cellulosaställningar via kemisk modifiering eller utveckla kompositer med andra biologiska/syntetiska polymerer för lastbärande tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jävsförklaring: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. och A.P. är uppfinnare på patentansökningar som lämnats in av University of Ottawa och Spiderwort Inc. angående användning av växtbaserad cellulosa för BTE-ansökningar. M.L.L., R.J.H., C.M.C. och A.P. har ekonomiska intressen i Spiderwort Inc.
Acknowledgments
Projektet finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) och Li Ka Shing Foundation. M.L.L. fick stöd från Ontario Centers of Excellence TalentEdge-programmet, och R.J.H. fick stöd av ett NSERC-stipendium och ett Ontario Graduate Scholarship (OGS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
References
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
- Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
- Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
