Chimeric Antigen Receptor T-cellefremstilling på en automatiseret celleprocessor

Summary

Denne artikel beskriver fremstillingsprocessen for kimære antigenreceptor T-celler til klinisk brug, specifikt ved hjælp af en automatiseret celleprocessor, der er i stand til at udføre viral transduktion og dyrkning af T-celler. Vi giver anbefalinger og beskriver faldgruber, der bør overvejes under procesudvikling og implementering af et tidligt fase klinisk forsøg.

Abstract

Chimeric antigen receptor (CAR)-T-celler repræsenterer en lovende immunterapeutisk tilgang til behandling af forskellige maligne og ikke-maligne sygdomme. CAR-T-celler er genetisk modificerede T-celler, der udtrykker et kimært protein, der genkender og binder til et celleoverflademål, hvilket resulterer i drab på målcellen. Traditionelle CAR-T-cellefremstillingsmetoder er arbejdskrævende, dyre og kan medføre risiko for kontaminering. CliniMACS Prodigy, en automatiseret celleprocessor, giver mulighed for at fremstille celleterapiprodukter i klinisk skala i et lukket system, hvilket minimerer risikoen for kontaminering. Behandling sker halvautomatisk under kontrol af en computer og minimerer dermed menneskelig involvering i processen, hvilket sparer tid og reducerer variabilitet og fejl.

Dette manuskript og video beskriver T-celletransduktionsprocessen (TCT) til fremstilling af CAR-T-celler ved hjælp af denne processor. TCT-processen involverer CD4 + / CD8 + T-celleberigelse, aktivering, transduktion med en viral vektor, ekspansion og høst. Ved hjælp af aktivitetsmatrixen, en funktionalitet, der tillader bestilling og timing af disse trin, kan TCT-processen tilpasses i vid udstrækning. Vi leverer en gennemgang af CAR-T-cellefremstilling i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP) og diskuterer påkrævet frigivelsestest og prækliniske eksperimenter, der understøtter en Investigational New Drug (IND) applikation. Vi demonstrerer gennemførligheden og diskuterer fordele og ulemper ved at bruge en halvautomatisk proces til klinisk CAR-T-cellefremstilling. Endelig beskriver vi et igangværende investigator-initieret klinisk forsøg, der er målrettet pædiatriske B-cellemaligniteter [NCT05480449] som et eksempel på, hvordan denne fremstillingsproces kan anvendes i en klinisk indstilling.

Introduction

Adoptiv overførsel af T-celler konstrueret til at udtrykke en kimær antigenreceptor (CAR) har vist bemærkelsesværdig effekt til behandling af patienter med ildfaste B-cellemaligniteter 1,2,3,4,5. De traditionelle fremstillingsmetoder til CAR-T-celler er imidlertid arbejdskrævende, tidskrævende og kræver højtuddannede teknikere til at udføre højt specialiserede trin. For eksempel involverer den traditionelle fremstillingsproces af et autologt CAR-T-celleprodukt densitetsgradientcentrifugering, elutriering eller magnetisk adskillelse for at berige T-celler, aktivering og transduktion med en viral vektor i en steril kolbe og ekspansion i en bioreaktor inden høst og formulering. Forskellige systemer er dukket op for nylig, der sigter mod delvist at automatisere denne proces. For eksempel er Miltenyi CliniMACS Prodigy (i det følgende benævnt "processoren") en automatiseret cellebehandlingsenhed, der kan udføre mange af disse trin på en automatiseret måde 6,7,8,9. En indgående diskussion af traditionelle og automatiserede CAR-T-fremstillingsmetoder præsenteres i en nylig revisionsartikel¹⁰.

Processoren bygger på funktionaliteten af CliniMACS Plus, en amerikansk Food and Drug Administration (FDA) -godkendt medicinsk enhed til behandling af hæmatopoietiske stamceller. Processoren inkluderer en celledyrkningsenhed, der muliggør automatiseret vask, fraktionering og dyrkning af celler (figur 1). T-celletransduktionsprocessen (TCT) er et forudindstillet program i processorenheden, der stort set replikerer manuel CAR-T-cellefremstilling. TCT giver mulighed for tilpasselig cellebehandling ved hjælp af en grafisk brugergrænseflade ("Activity Matrix", figur 2). Da processoren automatiserer mange trin og konsoliderer funktionaliteten af flere enheder i én maskine, kræver den mindre træning og specialiserede fejlfindingsfærdigheder fra teknologer. Da alle trin udføres i et lukket engangsslangesæt, kan processoren anvendes i faciliteter med mindre streng luftbehandlingsinfrastruktur, end det ville blive anset for acceptabelt for en åben fremstillingsproces. For eksempel driver vi processoren i et anlæg, der er certificeret som ISO-klasse 8 (sammenlignelig med EU-klasse C).

Figur 1: CAR-T-cellefremstilling ved hjælp af T-celletransduktionssystemet. Vist er processoren med slangesættet installeret. Slangesættet giver mulighed for at forbinde andre komponenter såsom poser, der indeholder behandlingsbuffer, dyrkningsmedium og lentiviral vektor via steril svejsning. Når leukafereseproduktet er føjet til applikationsposen, kan det mærkes med T-cellevalgsperler, føres gennem separationskolonnen og derefter overføres til genapplikationsposen. Udvalgte celler dirigeres derefter til dyrkningsenheden i kulturinstrumentet og aktiveres med aktiveringsreagenset (se materialetabel). Det endelige produkt samles i målcelleposen. Under hele processen er det muligt at fjerne prøver til kvalitetskontrol aseptisk. Grå tal inde i cirkler repræsenterer de nummererede ventiler på processoren, der leder væskevejen gennem slangesættet. Gengivet med tilladelse fra ¹¹. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Aktivitetsmatrix. Efter valg og aktivering af T-celler kan resten af CAR-T-cellefremstillingsprocessen tilpasses fuldt ud. Aktiviteter kan tilføjes eller slettes og planlægges til den relevante dag og det relevante tidspunkt, og kulturvolumen efter aktiviteten kan angives (Volumen). Transduktionsaktiviteten blev f.eks. konfigureret til at begynde kl. 10:00 på dag 1, og kulturvolumenet ved aktivitetens afslutning blev indstillet til 100 ml. Aktivitetsmatrixen kan redigeres i hele dyrkningsperioden. Status for processen kan overvåges på behandlingsenhedens integrerede skærm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Formålet med dette manuskript er at give en detaljeret gennemgang af fremstillingen af CAR-T-celler ved hjælp af processoren og desuden give vejledning om den test under processen og produktfrigivelse, der sandsynligvis vil blive krævet af tilsynsmyndigheder for at godkende en forsøgsansøgning om nyt lægemiddel (IND). Den præsenterede protokol holder sig tæt på leverandørens anbefalede tilgang og er den underliggende protokol for IND 28617, som i øjeblikket evalueres i et enkeltcenter-investigator-initieret fase I/II klinisk forsøg. Dette forsøg har til formål at bestemme sikkerheden og effektiviteten ved at bruge denne processor til fremstilling af humaniserede CD19-rettede autologe CAR-T-celler til patienter med B-celle akut lymfoblastær leukæmi (B-ALL) eller B-afstamning lymfoblastisk lymfom (B-Lly) [NCT05480449]. Forsøget startede i september 2022 og er planlagt til at rekruttere op til 89 patienter i alderen 0-29 år med B-ALL eller B-Lly. Vi rapporterer nogle fremstillingsresultater fra forsøget i manuskriptet.

Vi vil gerne påpege, at selvom manuskriptet præsenteres som en protokol med trin, der skal følges, bør det betragtes som et udgangspunkt for andre at begynde at optimere deres egen CAR-T-cellefremstillingsproces. En ikke-udtømmende liste over mulige variationer af den præsenterede protokol omfatter: anvendelse af friske i stedet for kryopræserverede T-celler som udgangsmateriale; ved hjælp af en anden metode til T-celleberigelse eller udeladelse af det helt; ved hjælp af forskellige medier og cytokincocktails såsom IL7 / IL15 i stedet for IL2; ændre koncentrationen af humant AB-serum eller helt udelade den tidspunkt for transduktion ved hjælp af "multi-hit" transduktioner; varierende agitation, dyrkningsmængder og fodringsplan; anvendelse af forskellige metoder til genetisk overførsel, herunder elektroporation af nukleinsyrer eller ikke-lentivirale vektorer anvendelse af en anden buffer og/eller kryoprotektormiddel til slutformulering og infundere CAR-T-celler friske i stedet for kryokonservering til infusion på et senere tidspunkt. Disse variationer kan have en betydelig indvirkning på det terapeutiske produkts cellulære sammensætning og styrke.

Samlet procestrin	Proces dag	Tekniske detaljer
Berigelse af celler	Dag 0	Markering af CD4+/CD8+ T-celler
Celle aktivering		T-cellekultur såning og aktivering
Celletransduktion	Dag 1	Lentiviral transduktion (100 ml kulturvolumen)
Celleudvidelse (efterfulgt af celleformulering)	Dag 2	--
	Dag 3	Kulturvask (1 cyklus); Shaker aktiveret; Kulturvolumen stiger til 200 ml
	Dag 4	--
	Dag 5	foder (50 ml); Kulturvolumen når slutvolumen på 250 ml
	Dag 6	Prøve under fremstilling; Medieudveksling (-125 ml / +125 ml)
	Dag 7	Medieudveksling (-150 ml / +150 ml) eller høst
	Dag 8	Prøve under fremstilling; Medieudveksling (-150 ml / +150 ml) eller høst
	Dag 9	Medieudveksling (-180 ml / +180 ml) eller høst
	Dag 10	Prøve under fremstilling; Medieudveksling (-180 ml / +180 ml) eller høst
	Dag 11	Medieudveksling (-180 ml / +180 ml) eller høst
	Dag 12	Medieudveksling (-180 ml / +180 ml) eller høst
	Dag 13	Høst

Tabel 1: Procestidslinje og oversigt. Denne tabel opsummerer TCT-procestrinnene, der anvendes i et aktuelt klinisk forsøg [NCT05480449]. Processen starter med T-celleberigelse ved CD4+/CD8+ udvælgelse, kultursåning og aktivering på dag 0 efterfulgt af transduktion på dag 1. Celler hviler i 48 timer efterfulgt af en kulturvask, en stigning i kulturvolumenet til 200 ml og omrøring ved hjælp af en rystemekanisme. På dag 6 udtages den første procesprøve. Celler høstes, når der er tilstrækkelige celler til rådighed til mindst tre fulde doser CAR-T-celler (5 × 10 6 CAR-T-celler / kg, hvis patienten er <50 kg, ellers 2,5 × 10⁸ CAR-T-celler) og kvalitetskontroltest (~ 2 × 10⁶ CAR-T-celler); eller når kulturen når i alt 4-5 x 10⁹ celler. Forkortelser: TCT = T-celletransduktion; CAR-T = kimære antigenreceptor T-celler; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering.

Protocol

Al forskning blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer med godkendelse fra hospitalets Institutional Review Board (IRB), og alle forsøgspersoner har givet informeret samtykke til offentliggørelse af de data, der er indsamlet i forbindelse med forsøget.
BEMÆRK: Første afsnit i protokollen giver et overordnet overblik over CAR-T-fremstillingsprocessen. De resterende afsnit indeholder trinvise instruktioner. Protokollen beskriver arbejdsgangen ved hjælp af TCT-softwareversion 1.4, som er den aktuelle version i skrivende stund. Brugergrænsefladen i andre versioner af TCT-softwaren kan variere.

1. Procestidslinje og overblik (tabel 1)

1. Forbered dig på proceduren på en mandag (dag -1) med forhåndskontrol. Sørg for, at processoren og andet udstyr kører som forventet, og at alle reagenser og forbrugsstoffer er tilgængelige og opdaterede under hele produktionskørslen.
2. På dag 0 skal du installere slangesættet på maskinen. Optø tidligere kryopræserverede T-celler i et tørt bad, og forbind dem ved steril svejsning til slangesættet, der er installeret på instrumentet.
   BEMÆRK: Denne protokol antager, at autologe T-celler blev indsamlet via aferese, kryopræserveret og opbevaret indtil produktionsstart. Selvom det er muligt at bruge frisk indsamlede T-celler, øger dette den logistiske byrde, da det kræver koordinering af afereseindsamling med CAR-T-cellefremstilling. Vi anbefaler kraftigt at bruge en tør-optøningsproces i stedet for et vandbad for at minimere risikoen for bakteriel kontaminering.
3. Mærk T-celler med CD4- og CD8-reagenser (se materialetabel) og berig ved magnetisk udvælgelse.
   BEMÆRK: Det er muligt at udelade T-celleberigelse eller udføre det, før celler indlæses på processoren. Se afsnit 5 i protokollen.
4. Efter berigelse af CD4+/CD8+ celler skal du tage en prøve til celletælling. Frø kulturen med 1-2 × 10⁸ celler i et indledende volumen på 70 ml medium (se materialetabel) suppleret med 5% humant AB-serum og rekombinant humant IL2 (25 ng / ml).
5. Tilsæt et hætteglas med aktiveringsreagens (en kolloid polymer nanomatrix konjugeret med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer; se materialetabel) for at aktivere T-celler og inkubere kulturen uden omrøring i 24 timer ved 37 ºC i en 5% CO₂ atmosfære. Kryopræserver eventuelle resterende CD4+/CD8+ celler som backup, hvis det ønskes.
   BEMÆRK: I tilfælde af produktionsfejl kan resterende CD4+/CD8+ valgte celler anvendes som udgangsmateriale. Hvis fejlen er rent teknisk, såsom forurening eller operatørfejl, og der er tilstrækkelige celler tilbage, kan det overvejes at bruge resterende celler til at udføre en yderligere produktionskørsel. Hvis udgangsmaterialets kvalitet giver anledning til bekymring, kan en ny afereseprocedure være berettiget; Dette er dog i sidste ende en klinisk beslutning. I begge tilfælde er en produktionsfejl en væsentlig hændelse, der bør undersøges, og sponsor og eventuelle tilsynsmyndigheder bør informeres.
6. Efter 24 timers aktivering transduceres T-celler med lentiviral vektor ved en passende infektionsmultiplicitet (MOI).
   BEMÆRK: Det er afgørende at bestemme den lentivirale vektortiter og etablere en passende MOI, inden man begynder at fremstille kliniske produkter. Vektortiteren skal bestemmes ved at udføre et mindre eksperiment, hvor humane primære T-celler transduceres ved forskellige koncentrationer af vektoren. Overvejelser for den relevante MOI inkluderer omkostningerne ved vektoren, den ønskede transduktionseffektivitet og et acceptabelt vektorkopinummer. Denne protokol bruger en MOI på 30-50% for at minimere omkostningerne ved vektoren og holde det gennemsnitlige vektorkopinummer under 8 kopier pr. Transduceret celle.
7. På dag 3 skal du udløse Culture Wash-aktiviteten og starte uro på lavt niveau. Forøg kulturvolumenet til 200 ml.
8. På dag 5 tilsættes 50 ml medium til kulturen, hvilket øger kulturvolumenet til 250 ml.
9. På dag 6 af dyrkning skal du tage en prøve fra kulturen og tælle CAR-T-celler ved flowcytometri. Brug denne måling til at estimere den hastighed, hvormed kulturen vokser, og identificere det optimale høsttidspunkt.
   BEMÆRK: Hver prøvetagning under processen giver 3 ml til test og fjerner 7 ml samlet dyrkningsvolumen.
10. Fra dag 7 til 13, hvis kulturen ikke er afsluttet, skal du tage op til to yderligere prøver i processen på alternative dage og udføre daglige medieudvekslinger for at fodre den voksende kultur. Produktet høstes, når det samlede antal kerneceller (TNC) når 5 × 10⁹ , og/eller når der er tilstrækkelige celler til rådighed til det krævede antal doser og frigivelsestest.
11. På høstdagen skal du tage en prøve i processen fra den aktivt voksende kultur. Brug denne prøve til mycoplasma, endotoksin, replikationskompetent lentivirus (RCL) testning, vektorkopinummer (VCN) testning, celletal, cellestørrelsesanalyse, flowcytometri og gramplet.
12. Start det endelige høstprogram, som udløser fjernelse af dyrkningsmediet og en cellevask med den endelige formuleringsbuffer (en steril isotonisk krystalloid opløsning suppleret med 4% humant serumalbumin; se materialetabel). Når høsten er afsluttet, vil målcelleposen indeholde 100 ml celleprodukt i den endelige formuleringsbuffer. Dimethylsulfoxid (DMSO) tilsættes til en koncentration på 10% (v/v), produktet alikvotes i individuelle doser, og kryopræserveres ved hjælp af en fryser med kontrolleret hastighed.

2. Dag -1: Forberedelse og forhåndskontrol

1. Kontroller, at CO₂ -gasniveauer og trykluft er tilstrækkelige til at producere et indgangstryk på mindst 20 psi på hver ledning.
2. Tænd processoren og bekræft, at der ikke er nogen fejl ved opstart. Indstil om nødvendigt uret til det korrekte tidspunkt. Luk processoren.
3. Sørg for, at celleantal, volumen og total CD4+ og total CD8+ antal af T-celleudgangsmaterialet er kendt.
4. Sørg for, at der er tilstrækkelige mængder af den virale vektor, reagenser og forbrugsstoffer til hele fremstillingsforløbet.
5. Anbring en flaske humant AB-serum i køleskabet for at tø op natten over.

3. Dag 0: Installation af slangesæt

1. Der fremstilles 3 liter forarbejdningsbuffer (0,5 % (w/v) humant serumalbumin (HSA) i fosfatbufret saltvand/ethylendiamintetraeddikesyrebuffer (PBS/EDTA)).
2. Der fremstilles 2 liter dyrkningsmedium (2 liter substrat suppleret med 100 ml humant AB-serum til en slutkoncentration på 5 % og to hætteglas rekombinant human IL2 ved 25 μg/hætteglas; se materialefortegnelsen for yderligere oplysninger om disse reagenser). Overfør 10 ml dyrkningsmedium til en 20 ml reagenspose og opbevar ved 4 ºC natten over.
3. Tænd for instrumentet, og vælg T-celletransduktionsprocessen (TCT) fra berøringsskærmgrænsefladen. Klik på Kør for at starte TCT-processen; Lad instrumentet guide brugeren gennem proceduren ved hjælp af instruktioner og anvisninger på skærmen.
4. På skærmbilledet Parameterinput skal du indtaste operatørens initialer, partinummeret på slangesættet og dets udløbsdato, når du bliver bedt om det.
5. Skærmbilledet Procesopsætning viser fire forskellige processer. Vælg Fuld proces (1).
   BEMÆRK: Andre tilgængelige processer omfatter start fra CD4+/CD8+ udvalgte T-celler (se afsnit 5 nedenfor) og genstart af en tidligere afbrudt produktionskørsel.
6. Når du bliver bedt om det, skal du vælge to hætteglas med selektionsreagens for at afspejle udvælgelsesmetoden CD4+/CD8+.
7. Installer slangesættet i henhold til instruktionerne på skærmen. Sørg for, at alle Luer-tilslutninger er tætte, og at der ikke er fejl i slangesættet.
8. Følg vejledningen på skærmen for at starte de automatiske øvre og nedre integritetstest.
   BEMÆRK: En integritetstest kan mislykkes på grund af et defekt slangesæt, et forkert installeret slangesæt eller en defekt i maskinens peristaltiske pumpe. Vi anbefaler på det kraftigste, at du har mindst én ekstra slange klar til produktionskørsler. Vi anbefaler også, at en anden teknolog kontrollerer den korrekte installation af slangesættet.
9. Følg instruktionerne på skærmen for fastgørelse af mediet og behandling af bufferposer.
10. Start den automatiske priming af slangesættet.
    BEMÆRK: TCT-processen skal fortsætte inden for 3 timer efter grundning. Sørg for, at T-celleudgangsmaterialet er klar.

4. Berigelse af T-celler

1. Når skærmbilledet Overfør celleprodukt vises, skal du begynde at optø det kryopræserverede T-celleprodukt .
   BEMÆRK: Det acceptable volumen af T-celler, der kan føjes til slangesættet, varierer fra 50 til 280 ml. Det maksimale antal målceller (summen af CD4+ og CD8+) er 3 × 10⁹, og det maksimale TNC-antal er 2 × 10¹⁰.
2. Overfør de optøede celler til en 150 ml overførselspose. Sterilt svejses overførselsposen til påføringsposen på slangesættet.
3. Fjern en prøve fra applikationsposen ved hjælp af QC-posen, og udfør en celletælling.
4. Tilslut CD4- og CD8-reagenshætteglassene.
5. Start udvælgelsesprocessen (T-celleforbedring).
6. Efter berigelse fjernes en prøve af de valgte CD4+/CD8+ celler fra genanvendelsesposens QC-pose til celletal, flowcytometri og cellestørrelsesanalyse.
   BEMÆRK: Resultatet af celletællingen er nødvendigt for at fortsætte til næste trin.

5. Alternativ: Start med CD4+/CD8+ valgte celler

1. Forbered mediet som beskrevet i trin 3.2. Der kræves ingen behandlingsbuffer.
2. Tænd processoren, og vælg T-celledyrkning med TS-installation (3) på skærmbilledet Procesopsætning . Følg vejledningen og vejledningen på skærmen.
3. Følg instruktionerne på skærmen, prim slangesættet med medium i stedet for behandlingsbuffer.
4. Når skærmbilledet "Forbered dyrkning-Tilslut celleprodukt" vises, skal du begynde at optø de valgte CD4+/CD8+ T-celler.
   BEMÆRK: Det mindste antal T-celler (summen af CD4+ og CD8+ T-celler) for processen er 1,0 × 10⁸.
5. Overfør celler til en 150 ml overførselspose og fortynd med medium til et slutvolumen på 50 ml.
6. Sterilt svejses cellesuspensionen til instrumentets genpåføringspose.
7. Fjern en prøve af de valgte CD4+/CD8+ celler fra genapplikationsposens QC-pose til celletælling og analyse af cellestørrelse.

6. Kulturopsætning og programmering af aktivitetsmatrixen

1. Indtast cellekoncentrationen og det ønskede startnummer (1-2 × 10⁸ T-celler).
   BEMÆRK: Instrumentet pumper automatisk det passende volumen fra genpåføringsposen ind i kulturkammeret og justerer det endelige volumen til 70 ml.
2. Sæt et hætteglas med aktiveringsreagenset på i henhold til instruktionerne på skærmen.
3. Indtast 5 % for CO₂ -koncentration og 39 ° C for kulturkammertemperatur.
   BEMÆRK: Fabrikanten anbefaler at indtaste 39 °C eller en værdi, der er specielt kalibreret til instrumentet.
4. Konfigurer aktivitetsmatrixen. Brug protokollen Udvidet fodring som udgangspunkt, og rediger individuelle trin i protokollen til brugerdefinerede specifikationer (figur 2).
   1. Sørg for, at tiden for transduktionsaktivitet er 24 timer efter såning (dag 1).
   2. Sørg for, at tidspunktet for Kulturvask aktivitet er 48 timer efter transduktion (dag 3).
   3. Indstil tiden for Activate Shaker (shaker type 2) til 30 min efter start af Culture Wash.
   4. Slet alle aktiviteter vedrørende udveksling af mellemstore poser og affaldsposer .
5. Tryk på ok på skærmen for at begynde dyrkningen.
6. Kryopræserver eventuelle resterende CD4+/CD8+ valgte celler i applikationsposen til fremtidig brug, hvis det er nødvendigt.

7. Dag 1: T-celletransduktion

1. Beregn volumenet af den lentivirale vektor, der skal bruges, baseret på den ønskede MOI.
2. Udtag 20 ml reagensposen indeholdende 10 ml dyrkningsmedium, som blev opbevaret ved 4 ºC natten over (trin 3.2). Hætteglasset med vektor optøs og volumen beregnet i 7.1 overføres til 20 ml reagensposen.
   BEMÆRK: Vi anbefaler at fryse enhver resterende vektor til opbevaring eller til forskning og udvikling.
3. Rediger aktivitetsmatrixen for at indstille transduktionstidspunktet til 2 minutter ud i fremtiden. Når du bliver bedt om det, skal du trykke på ok for at starte transduktionsaktiviteten.
4. Steril svejsning af vektorposen til slangesættet ved at følge instruktionerne på skærmen.
5. Rediger aktivitetsmatrixen baseret på det faktiske tidspunkt, hvor transduktionsaktiviteten blev startet.
   BEMÆRK: Vi foreslår at starte transduktion inden for 20-24 timer efter såning for at sikre, at praktiske aktiviteter udføres inden for normal arbejdstid.
   1. Sørg for, at tidspunktet for Kulturvask er 48 timer efter transduktion (dag 3).
   2. Indstil tiden for Activate Shaker (shaker type 2) til 30 min efter Culture Wash (dag 3).
   3. Sørg for, at tidspunktet for medieudveksling er om eftermiddagen (kl. 13) på dag 6.

8. Dag 6: Første procesprøve

1. Tryk på knappen Sample , og følg vejledningen på skærmen for at hente en QC-prøve fra den aktive kultur.
2. Udfør celletal, flowcytometri og cellestørrelsesanalyser. Send 1 ml af prøven for en gramplet.
   BEMÆRK: Celletællinger skal gentages ca. hver anden dag for at overvåge kulturvækst.
3. Forbered yderligere 2 liter dyrkningsmedium (se trin 3.2).
4. Tilføj en medium poseudvekslingsaktivitet til aktivitetsmatrixen, tidsindstillet til at starte 2 minutter ud i fremtiden. Juster Media Exchange-aktiviteten til at starte 20 minutter ud i fremtiden. Følg vejledningen på skærmen.
   BEMÆRK: Media Exchange er udskiftning af kulturmediet i dyrkningskammeret. Medium Bag Exchange er udskiftningen af kulturmedieposen, der er hængt på instrumentet.

9. Høstdag (hvor som helst fra dag 7 til 13): Høst og kryopræservering

1. Tryk på knappen Sample , og følg vejledningen på skærmen for at hente en QC-prøve fra den aktive kultur.
2. QC-prøven opdeles i tre delprøver på hver 1 ml. Brug 1 ml til flowcytometri, celletal og cellestørrelsesanalyser. Brug 1 ml til mycoplasma, vektorkopinummer, replikationskompetent lentivirus og endotoksintestning. Send de sidste 1 ml for Gram-plet.
3. Forbered den endelige formuleringsbuffer (en steril isotonisk krystalloid opløsning suppleret med 4 % HSA i en 2 L pose, se materialetabel). Spar 100 ml af denne buffer for at klargøre kryoprotektiv opløsning på et senere trin.
4. Rediger aktivitetsmatrixen for at indstille tidspunktet for kulturens afslutning til 2 minutter ud i fremtiden, og slet alle andre resterende aktiviteter. Følg instruktionerne på skærmen for at fastgøre den endelige formuleringsbuffer til slangesættet og begynde høsten.
   BEMÆRK: Processoren overfører automatisk cellerne til målcelleposen. Lydstyrken vil være 100 ml.
5. Tag en 0,5 ml prøve fra Target celleposens QC-pose, og udfør en celletælling.
6. Luk målcelleposen, og fjern den fra slangesættet. Opdel CAR-T-produktet i passende doser, og kryopræserver dem i en fryser med kontrolleret hastighed. Opbevar celler i dampfasen af flydende nitrogenopbevaringstank ved ≤ -150 ºC.
   BEMÆRK: Endelig formulering og aliquoting af doser er specifikke for protokollen. Vi giver her et eksempel, hvor tre lige store doser CAR-T-celler og QC-hætteglas er kryopræserveret. Se afsnit 10 for detaljer.
7. Download procesdataene fra instrumentet, fjern og bortskaf slangesættet, og udfør en nedlukning.

10. Kryopræservering af CAR-T-celler

BEMÆRK: Denne protokol forudsætter, at CAR-T-celler kryopræserveres efter fremstilling og opbevares, indtil patienten er klar til infusion. Selvom det er muligt at infundere nyfremstillede CAR-T-celler, øger dette den logistiske byrde, da det kræver koordinering af CAR-T-cellefremstilling med CAR-T-celleinfusion. Dette kan være problematisk i tilfælde af produktionsfejl. Især hvis den kliniske protokol kræver lymfodepleterende kemoterapi før CAR-T-infusion, anbefaler vi kraftigt kryopræservering, fordi en produktionsfejl kan udsætte patienten for risikoen for unødvendig kemoterapi. Tilsynsmyndighederne kan kræve, at investigatorerne påviser, at produktet består alle frigivelsestest før infusion, hvilket kan være vanskeligt at opnå uden kryopræservering.

1. Fra de sidste 100 ml høstet produkt bestemmes og fjernes det volumen, der kræves for at opfylde de ønskede CAR-T-doser og kvalitetskontrolhætteglas (QC) til udførelse af yderligere frigivelsestest (f.eks. levedygtighed), tilbageholdelse og en sterilitetsprøve.
   BEMÆRK: Det er afgørende at udvikle en fuldt defineret strategi for aliquoting af det endelige produkt. Vi foreslår, at der fremstilles flere doser af produktet for at muliggøre reinfusioner, forudsat at der er tilstrækkeligt materiale til rådighed. Et produktvolumen på 10-20 ml i en pose muliggør hurtig optøning og nem infusion ved sprøjtetryk. Det anbefales at fylde hvert produkt til den ønskede CAR-T-celledosis (f.eks. 5 × 10⁶ CAR-T-celler pr. kg eller 2,5 × 10⁸ CAR-T-celler), da dette vil undgå behovet for dosisberegninger på infusionsdagen. Det anbefales også kryokonservering af mindst fire QC-hætteglas og hensyntagen til muligheden for, at der kan være overskydende materiale; Vi foreslår at gemme dette materiale, da det kan være nyttigt til forsknings- og udviklingsformål.
2. Centrifuger cellerne for at reducere volumenet.
3. Produktet/produkterne bringes op på halvdelen af det ønskede slutvolumen ved hjælp af den del af den endelige formuleringsbuffer, der er lagt til side i trin 9.3.
4. Forbered 2x kryoprotektivt middel ved at skabe en 20% DMSO-opløsning i den endelige formuleringsbuffer.
   BEMÆRK: Kryoprotektiv formulering og DMSO-koncentration kan ændres.
5. Tilsæt 2x kryoprotektivt middel til celler ved samme volumen for en endelig DMSO-koncentration på 10%.
   BEMÆRK: Varigheden af produktets eksponering for kryoprotektive midler bør minimeres.
6. Fyld dosisposerne og QC-hætteglassene. Send 1 ml til sterilitet.
   BEMÆRK: Regulatorer kræver normalt en 14-dages sterilitetsanalyse udført på slutproduktet. Imidlertid dukker hurtige sterilitetsanalyser op; På nuværende tidspunkt er den kompendiale 14-dages metode den mest almindelige.
7. Kryokonservesprodukter ved hjælp af en fryser med kontrolleret hastighed.
   BEMÆRK: Fryseprogrammet med kontrolleret hastighed skal valideres til at producere en kølehastighed på ~ -1 ºC/min til ~ -45 ºC med kompensation for det eutektiske punkt.
8. Opbevar produktet i dampfasen i en ultralav fryser med flydende nitrogen ved ≤ -150 °C.

11. Undersøgelse af procedurens gennemførelse

BEMÆRK: Gennem TCT-processen udtages flere QC-prøver fra den aktive kultur. Tabel 2 indeholder et gitter, der kan hjælpe læseren med at organisere resultaterne til reference og beregne metrics for procedurens ydeevne. Udtrykkene nedenfor, der består af et bogstav og et tal (f.eks. "B4"), henviser til celler i gitteret i denne tabel. Følgende værdier anvendes i præstationsberegningerne: B3 = total nucleated cells (TNC) pre-enrichment; B4 = TNC efter berigelse; E2 = Summen af CD4+- og CD8+ T-celler som en procentdel af de samlede celler i det oprindelige afereseprodukt; E4 = Summen af CD4+- og CD8+T-cellerne som en procentdel af de samlede celler efter berigelse; G2 = CD19+ celler i procent af det samlede antal celler i det oprindelige produkt; G4 = CD19+ celler som en procentdel af de samlede celler efter CD4+/CD8+ berigelse; B10 = TNC af den aktive kultur på høstdagen.

Tabel 2: Gitter for procedurens ydeevne. Vi leverer dette gitter til at hjælpe med at organisere testreults i processen, der er nødvendige for at beregne procedureydelsesstatistikker. Rækker repræsenterer prøver analyseret på forskellige tidspunkter under proceduren og er mærket med tallene 1-11. Række 6-9 kan bruges til at registrere resultater fra prøver taget efter dag 6 af dyrkning, men før høstdagen. Kolonner repræsenterer målte parametre og er mærket med bogstaverne A-H. Felter, der er gråtonede, gælder ikke. Nogle yderligere marker gælder muligvis ikke, afhængigt af om CD4+/CD8+-tilsætning udføres som en del af proceduren og dyrkningens varighed. Vi foreslår, at du skriver "I/T" i disse felter. Forkortelser: TNC = samlet kernecelletal; QC = kvalitetskontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

1. Beregn genvinding af CD4+/CD8+ celler efter selektion ved at dividere det samlede antal CD4+ plus CD8+ T-celler efter berigelse med det samlede antal CD4+ plus CD8+ T-celler før berigelse ved hjælp af ligning (1).
   CD4+/CD8+ T-cellegendannelse = (1)
2. Beregn udtømning af CD19+ celler efter berigelse ved at dividere det samlede antal CD19+ celler efter CD4+/CD8+ berigelse med det samlede antal CD19+ celler før berigelse. Da dette tal forventes at være meget lille, rapporteres logaritmen til denne brøk som vist i ligning (2):
   Log CD19-celleudtømning = log₁₀ (2)
3. Den samlede foldvækst beregnes ved at dividere det samlede antal celler i aktiv kultur ved høst med antallet af frøede celler ved hjælp af ligning (3):
   Samlet foldvækst = (3)
4. Den gennemsnitlige daglige vækst beregnes ved at tage roden af den samlede foldvækst i forhold til høstdagen ved hjælp af ligning (4):
   Gennemsnitlig daglig vækst = høstdag √ (samlet foldvækst) (4)

Representative Results

Resultaterne fra de første tre CAR-T-produktionskørsler af NCT05480449-forsøget er vist nedenfor i tabel 3. Udgangsmaterialet, vektoren, kulturcytokinerne og AB-serumkoncentrationerne blev holdt konsistente for hver kørsel. Produkter blev høstet på dag 7 eller 8. Den gennemsnitlige daglige cellevækst var 46% (stigning i total celletælling), hvilket indikerer, at TCT-processen var effektiv til at fremme celleudvidelse. Disse resultater tyder på, at processoren kan producere konsistente og reproducerbare CAR-T-celleprodukter.

Testresultaterne for det endelige produkt, opsummeret i tabel 4, viser, at CAR-T-cellerne bestod kvalitetskontrolstandarderne. Cellelevedygtigheden var mellem 88% og 94%, og CD3 T-cellens renhed var 89-93%. Det er vigtigt, at endotoksin, mycoplasma, sterilitet, replikationskompetent lentivirus og resterende leukæmiske celler ikke kunne påvises. Disse resultater bekræfter, at TCT-processen producerer CAR-T-celler af høj kvalitet, der opfylder lovgivningsmæssige standarder for klinisk brug.

Tre flowcytometripaneler blev udviklet til denne procedure (figur 3). De omfatter CD4 / CD8-panelet til at teste for procentdelen af CD4 + og CD8 + T-celler før og efter berigelse, CD19 CAR-T-panelet til at teste for transduktionseffektivitet og CD3 / CD19-panelet til at bestemme levedygtighed og indholdet af resterende leukæmiske (CD19 +) celler i slutproduktet. Resultaterne af disse paneler bekræfter den vellykkede fremstilling af CAR-T-celler og fraværet af resterende leukæmiske celler i slutproduktet.

Samlet set tyder resultaterne på, at TCT-processen kan producere konsistente CAR-T-celleprodukter af høj kvalitet, der er egnede til klinisk brug.

Figur 3: Flowcytometriassays. Gating -strategien, der anvendes til flowcytometrianalyse, er afbildet for hvert panel. Porte tegnes som sorte bokse eller ellipser og mærkes, og blå pile angiver gatingens retning. (A) CD4/CD8-panel. B-celler defineres som CD19+ delmængden og T-celler som CD3+ delmængden af lymfeporten. CD4+ og CD8+ T-celler er delmængder af T-celleporten. B) CD19 CAR-T-panel. CAR+ T-celler defineres som CD19-CAR+-delmængden af CD3+T-celler. Derudover optælles CD4+- og CD8+-delmængder, der er CD19 CAR+. C) CD3/CD19-panel. Dette panel er identisk med CD4/CD8-panelet, bortset fra at CD4- og CD8-mærkerne udelades. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; lymfe = lymfocyt; CD19-CAR = CD19-specifik kimær antigenreceptor; 7AAD = 7-aminoactinomycin D. Klik her for at se en større version af denne figur.

Løbe #	Udgangsmateriale		Vektor	Kultur cytokiner	AB Serum %	Endelig TNC	Samlet høstet CAR-T-celler		Samlet foldvækst	Gennemsnitlig daglig vækst	Høstdag
1	Patient T-celler, aferese, Kryopræserveret		huCART19	IL2	5%	2.75x109	2.24x108		14	45%	7
2	Patient T-celler, aferese, Kryopræserveret		huCART19	IL2	5%	4.15x109	1.14x108		21	46%	8
3	Patient T-celler, aferese, Kryopræserveret		huCART19	IL2	5%	4.20x109	8.40x107		21	46%	8

Tabel 3: Parametre og vækstkarakteristika for tre CAR-T-produktionsserier i klinisk skala. Detaljer om dyrkningsforhold, vækst og høstdag for de første tre patientproduktionskørsler ved hjælp af processoren til det NCT05480449 kliniske forsøg vises. huCART19, humaniseret CD19-rettet CAR lentiviral vektor. Bemærk, at transduktionseffektiviteten og levedygtigheden for disse produkter er vist i tabel 4. Forkortelser: CAR-T-celler = kimære antigenreceptor-T-celler; TNC = samlede nukleerede celler.

Test af frigivelse
Undersøgelse	Celle levedygtighed	CD3 %	Endotoksin	Myko-plasma	Transduktion effektivitet	Resterende leukæmiske celler	Sterilitet Dag 14	Vektor-DNA-sekvens pr. celle	Vektor-DNA-sekvens pr. transduceret celle	Replikationskompetent Lentivirus
Specifikation	≥ 70%	≥ 80%	≤ 3,5 EU/ml	Negativ	≥ 2 %	< 1 %	Ingen vækst	Rapportér resultat	0.04-8 kopier/ transduceret celle	< 50 kopier/μg DNA
Resultater
Kør 1	90	89	<0,4	Negativ	36 %	Ikke Opdaget	Nej Vækst	1.04	2.89	Ikke Opdaget
Kør 2	88	93	<0,4	Negativ	39 %	Ikke Opdaget	Nej Vækst	1.16	2.97	Ikke Opdaget
Kør 3	94	91	<0,4	Negativ	18 %	Ikke Opdaget	Nej Vækst	0.43	2.39	Ikke Opdaget

Tabel 4: Endelige produkttest og frigivelsesspecifikationer. Specifikationerne i denne tabel gælder for det NCT05480449 kliniske forsøg (IND 28617). Post-optøning levedygtighed, CD3%, transduktionseffektivitet og resterende leukæmisk celleindhold blev målt ved flowcytometri. Endotoxin blev målt ved hjælp af en FDA-licenseret limulus amebocytlysatbaseret kromogen test. Sterilitetstest blev udført ved hjælp af en USP<71>-kompatibel metode. Mycoplasma, vektor-DNA-sekvensnummer pr. celle og replikationskompetent lentivirus blev målt ved hjælp af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR). Vektor-DNA-sekvensnummer pr. transduceret celle blev beregnet ved at dividere vektor-DNA-sekvensnummeret med transduktionseffektiviteten. Forkortelser: EU = endotoksinenhed; IND = nyt forsøgslægemiddel; FDA = Food and Drug Administration.

Supplerende figur S1: Præklinisk test af CAR-T-celler fremstillet ved hjælp af TCT-processen. Immunodeficiente (NSG) mus blev injiceret med patientafledte xenograft leukæmiceller på dag 0 og efterfølgende behandlet med CD19-rettede CAR-T-celler fremstillet på processoren ("Semi-Automatic Manufacturing"), traditionelt fremstillede CD19-rettede CAR-T-celler ("Standard Manufacturing") eller saltvand på dag 7. (A, B) Overlevelse af mus behandlet med halvautomatiske CAR-T-celler ved to dosisniveauer (0,5 × 10, 6 eller 2 × 10⁶ CAR-T-celler) sammenlignet med saltvand (p < 0,0001 for begge dosisniveauer). C) Sammenligning af halvautomatiske og standardfremstillede CAR-T-celler ved et dosisniveau, der vides at være ikke-helbredende for standardceller (0,5 × 10⁶ CAR-T-celler). Overlevelsen var signifikant bedre hos mus behandlet med CAR-T-celler fra processoren (p = 0,001). D) Sammenligning af halvautomatiske og standardfremstillede CAR-T-celler ved et dosisniveau, der vides at være helbredende for CD19-standard-CAR-T-celler. Overlevelsen var ikke signifikant anderledes (p = 0,4). E) Sammenligning af CAR-T-celler fra processoren ved de to dosisniveauer. Der blev observeret en signifikant dosiseffekt med bedre overlevelse hos mus behandlet med 2 × 10⁶ huCART19-celler (p = 0,007). Hver gruppe indeholdt 5 mus. Forkortelser: NSG = non-overvægtig diabetiker severe kombineret immundefekt gamma; TCT = T-celletransduktion; CAR-T = kimære antigenreceptor T-celler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Sammenligning af vækst og lentiviral transduktion af humane T-celler dyrket i medium suppleret med forskellige partier humant AB-serum. (A) Udvidelse af humane T-celler utransduceret (UTD) eller transduceret med CD19 CAR-T lentiviral vektor (CAR19) i kulturer suppleret med tre forskellige partier humant AB-serum (7J, 22A eller 21J). Vækstraterne for et af partierne (22A) var væsentligt større end for de to andre. (B) Gennemsnitlig procentdel (3 replikater) af CAR19+-celler i CD3+- og CD3+/CD4+- eller CD3+/CD8+-delpopulationerne af ex vivo-ekspanderede T-celler fra raske donorer. Bemærk, at forskelle i væksthastigheder ikke syntes at påvirke cellernes evne til at optage lentivirus som bestemt ved flowcytometrisk analyse af cellerne fra de ekspanderede kulturer. Transduktionseffektiviteten af T-celler og CD4+ og CD8+ subpopulationer var konsistent fra kultur til kultur. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelser for 3 gentagelseskulturer. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

CAR-T-celleterapi har vist sig at være en lovende behandlingsmetode for B-celle og andre maligniteter. Imidlertid har traditionelle CAR-T-cellefremstillingsmetoder flere begrænsninger, såsom høje omkostninger, arbejdskrævende produktion og åbne trin, der øger risikoen for kontaminering. For nylig er flere halvautomatiske platforme, herunder Miltenyi CliniMACS Prodigy ("processoren"), dukket op for at løse disse begrænsninger. T-celletransduktionsprocessen (TCT), integreret i processoren beskrevet i dette manuskript, omfatter T-celleberigelse, aktivering, viral transduktion, kulturudvidelse og høst i et lukket system. Konkurrerende automatiserede celleprocessorplatforme er mindre udbredt på nuværende tidspunkt, men kan have bedre overvågning under processen af kulturparametre, gunstigt udstyr eller materialeomkostninger eller et mindre fodaftryk, hvilket muligvis tillader brug i et biosikkerhedsskab i stedet for et dedikeret renrumsrum. Det er vigtigt at vælge en platform, der er optimalt egnet til en given applikation og et givet miljø.

En væsentlig begrænsning ved celle- og genterapier såsom CAR-T-celleterapi er de høje omkostninger ved kommercielle produkter, hvilket begrænser adgangen til livreddende terapi. Dette er især tilfældet i ressourcefattige omgivelser og ikke-førsteverdenslande. Vi har fundet ud af, at det er muligt at fremstille CAR-T-celler til en dramatisk lavere pris end et sammenligneligt kommercielt produkt, når vi implementerer en halvautomatiseret proces i et akademisk hospital, der har eksisterende nuværende renrumsfaciliteter, der overholder god fremstillingspraksis (cGMP), i forbindelse med et stamcellelaboratorium og støtte fra et klinisk laboratorium, der kan udføre nogle af de igangværende og frigivelsestest. Under disse omstændigheder finder vi, at de marginale omkostninger ved at udføre en produktionskørsel, herunder materialer og arbejdskraft til fremstilling og al proces- og frigivelsestest (men ikke inklusive udstyr og faciliteter) er ca. $ 30.000. Det skal bemærkes, at processorens kapitalomkostninger til udstyr er mindre end omkostningerne ved et enkelt kommercielt CAR-T-celleprodukt.

En af de potentielle bekymringer ved at skifte fra en manuel til en automatiseret metode er nedsat fleksibilitet. TCT-processen, selvom den er programmeret med stærke gelændere, kan stadig tilpasses i vid udstrækning. Processen tilbyder flere udgangspunkter, herunder en fuld proces med T-celleberigelse, en fuld proces uden berigelse (f.eks. til brug med CD4+/CD8+ præberigede celler, se afsnit 5 i protokollen ovenfor) og en genoptagelse af en afbrudt proces. Derudover giver aktivitetsmatrixfunktionen mulighed for tilpasning af hele dyrkningsprocessen. Med den stigende interesse for hurtig CAR-T-fremstilling skal det bemærkes, at det er muligt at konfigurere aktivitetsmatrixen til at begynde høst så tidligt som et par timer efter transduktion, hvis det ønskes. Den hurtige procedure har den potentielle dobbelte fordel ved nedsat fremstillingstid og et mere potent produkt ved at undgå differentiering og tab af antileukæmisk aktivitet¹². Desuden er en variant af TCT designet til ikke-virale vektorer ved hjælp af elektroporation, hvilket yderligere øger systemets fleksibilitet.

Den optimale høsttid for CAR-T-celler afhænger af forskellige faktorer, herunder den ønskede måldosis, antallet af krævede doser og den maksimale celletæthed, som dyrkningsbeholderen kan understøtte uden at gå på kompromis med cellelevedygtigheden. Fabrikanten anbefaler ikke at overstige 5 milliarder celler i et volumen på 250 ml. Bestemmelse af den ønskede måldosis bør baseres på prækliniske data i en dyremodel. For eksempel brugte vi i denne undersøgelse NOD scid gamma knockout (NSG) mus injiceret med patientafledte leukæmiske xenotransplantater og behandlet med CAR-T-celler for at estimere, at en effektiv dosis ville være ca. mellem 2 og 5 millioner CAR-T-celler pr. Kg (supplerende figur S1). Overvågning af cellestørrelse kan også være nyttig til bestemmelse af det optimale tidspunkt for høst af CAR-T-celler. Ved nøje at overveje disse faktorer kan forskere optimere høsttiden for CAR-T-celler for at sikre, at slutproduktet er af høj kvalitet og effektivitet.

Udvikling af en passende frigivelsestestplan er en kritisk komponent for at opnå godkendelse af en IND-applikation. Vi præsenterer et sæt frigivelsestests, herunder specifikationer for vores IND 28617, og vi mener, at dette vil være et godt udgangspunkt for lignende produkter. Tilsynsmyndighedernes udtalelser udvikler sig imidlertid konstant, og variationer af den fremlagte protokol kan føre til, at tilsynsmyndighederne kræver forskellige test eller forskellige specifikationstærskler. Vi anbefaler på det kraftigste, at du læser aktuelle lovgivningsmæssige vejledningsdokumenter såsom FDA's Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)¹³. Et generelt princip er, at test, der demonstrerer et produkts sikkerhed, evalueres strengere end test, der viser styrke. Generelt bør test såsom sterilitet, endotoksin, mycoplasma og replikationskompetent lentivirus valideres, og deres ydeevnekriterier bør være kendt. I modsætning hertil er styrketest relativt nedprioriteret i tidlige faseforsøg og behøver muligvis ikke at blive fuldt valideret. I et nyligt FDA-udkast til retningslinje hedder det, at "transgenekspression alene som et mål for styrke kan være tilstrækkeligt til at understøtte tidlige fase IND-undersøgelser"¹⁴. Desuden bør test, der anvendes til dosisbestemmelse, valideres. Dette kan være problematisk for nye CAR-mål, for hvilke der muligvis ikke findes standardiserede flowassays eller referencematerialer. I dette tilfælde foreslår FDA, at "referencematerialet til et assay kan være et velkarakteriseret parti af selve genterapiproduktet." ¹³ For eksempel etablerede vi en positiv kontrol for CD19 CAR-flowanalysen ved hjælp af CAR-T-celler fra tidlige tekniske kørsler.

Udvikling og optimering af fremstillingsprocessen til CAR-T-celleterapi kan være udfordrende og tidskrævende, som vi oplevede i vores arbejde. Vi stødte på flere tilbageslag, herunder problemer med bakteriel forurening. Vi anbefaler kraftigt at bruge en tør optøningsmetode til optøning af celler, da vandbad kan øge risikoen for forurening. På grund af dyrkning kan selv et lille inokulum føre til ærlig forurening, hvilket resulterer i et ubrugeligt produkt. Derudover anbefaler vi at planlægge logistik til frigivelsestest, hvilket kan indebære yderligere valideringer og kontrakt med eksterne parter for at sikre rettidig og nøjagtig testning. Et andet vigtigt element i udviklingen af en CAR-T-fremstillingsproces er optimering af transduktionseffektiviteten. En IND-ansøgning bør indeholde data til påvisning af den virale vektors styrke. For at opfylde dette krav og samtidig indhente oplysninger til optimering af MOI anbefaler vi kraftigt at udføre en lille titrering af den kliniske virusvektor på humane T-celler. Det er også vigtigt at overveje brugen af traditionelt fremstillede CAR-T-celler som kontrol for museforsøg (som vist i supplerende figur S1). At opnå disse celler kan være vanskeligt og kræver omhyggelig planlægning. En anden faktor at overveje er brugen af humant AB-serum, som er et dårligt defineret reagens, der kan have en signifikant effekt på cellevækst og andre egenskaber ved produktet. For at løse dette foreslår vi at teste flere partier AB-serum og udføre små eksperimenter for at vurdere partispecifikke virkninger på cellevækst (supplerende figur S2). Når et passende parti er identificeret, skal der købes et tilstrækkeligt stort volumen for at sikre konsistens på tværs af forsøgskohorten og minimere risikoen for batcheffekter i patientresultater, der skyldes ændringer i serumpartiet.

Sammenfattende tilbyder processoren og den medfølgende TCT-proces en fremstillingsmetode, der kan løse flere begrænsninger i de nuværende CAR-T-fremstillingsprocedurer, herunder høje omkostninger, arbejdskrævende produktion og åbne manipulationstrin. Ved at levere et lukket og halvautomatisk system har denne processor potentialet til at forbedre tilgængeligheden og overkommeligheden af CAR-T-celleterapi. Det kan rumme hurtig fremstilling og ikke-virale vektorer, hvilket gør det til et fleksibelt alternativ til traditionelle fremstillingsmetoder. Ved nøje at overveje faktorer som den ønskede måldosis, maksimal celletæthed og virkningerne af humant AB-serum på cellevækst kan forskere optimere høsttiden for CAR-T-celler for at sikre kvaliteten og effektiviteten af det endelige produkt. Selvom processen kan være kompleks og besværlig, kan planlægning af logistik til frigivelsestest og eliminering af forureningskilder bidrage til at mindske risici og sikre en vellykket CAR-T-cellefremstilling. Samlet set udgør TCT-processen en lovende vej til CAR-T-celleterapi med potentiale til at overvinde de nuværende begrænsninger og forbedre patienttilgængeligheden, hvilket i sidste ende gavner patienter med kræft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex