Summary
本文详细介绍了临床使用的嵌合抗原受体T细胞的制造过程，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理器。我们提供建议并描述在早期临床试验的工艺开发和实施过程中应考虑的陷阱。
Abstract
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞代表了一种很有前途的免疫治疗方法，用于治疗各种恶性和非恶性疾病。CAR-T细胞是转基因T细胞，其表达嵌合蛋白，该嵌合蛋白可识别并与细胞表面靶标结合，从而杀死靶细胞。传统的CAR-T细胞制造方法劳动密集、成本高昂，并且可能存在污染风险。CliniMACS Prodigy是一种自动化细胞处理器，允许在封闭系统中以临床规模生产细胞治疗产品，从而最大限度地降低污染风险。处理在计算机的控制下半自动进行，从而最大限度地减少了人为参与该过程，从而节省了时间并减少了可变性和错误。
本手稿和视频描述了使用该处理器制造 CAR-T 细胞的 T 细胞转导 （TCT） 过程。TCT 过程涉及 CD4+/CD8+ T 细胞富集、活化、病毒载体转导、扩增和收获。使用活动矩阵（一种允许对这些步骤进行排序和计时的功能），可以广泛地定制 TCT 流程。我们根据现行药品生产质量管理规范 （cGMP） 提供 CAR-T 细胞生产的演练，并讨论支持研究性新药 （IND） 申请所需的放行测试和临床前实验。我们论证了使用半自动工艺进行临床CAR-T细胞生产的可行性，并讨论了其优缺点。最后，我们描述了一项正在进行的针对小儿B细胞恶性肿瘤的研究者发起的临床试验[NCT05480449]，作为如何在临床环境中应用这种制造工艺的一个例子。
Introduction
经改造表达嵌合抗原受体 （CAR） 的 T 细胞的过继转移在治疗难治性 B 细胞恶性肿瘤患者方面显示出显着的疗效 1,2,3,4,5。然而，CAR-T细胞的传统制造方法是劳动密集型的，耗时的，并且需要训练有素的技术人员来执行高度专业化的步骤。例如，自体CAR-T细胞产品的传统制造工艺包括密度梯度离心、洗脱或磁分离以富集T细胞，在无菌烧瓶中用病毒载体进行活化和转导，以及在收获和配制之前在生物反应器中扩增。最近出现了各种系统，旨在使这一过程部分自动化。例如，Miltenyi CliniMACS Prodigy（以下简称“处理器”）是一种自动化细胞处理设备，可以以自动化方式执行其中的许多步骤6,7,8,9。对传统和自动化CAR-T制造方法的深入讨论在最近的综述文章10中提出。
该处理器建立在 CliniMACS Plus 的功能之上，CliniMACS Plus 是美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的用于处理造血祖细胞的医疗设备。该处理器包括一个细胞培养单元，可自动清洗、分离和培养细胞（图 1）。T 细胞转导 （TCT） 过程是处理器设备中的预设程序，可在很大程度上复制手动 CAR-T 细胞制造。TCT 允许使用图形用户界面（“活动矩阵”， 图 2）进行可定制的单元格处理。由于该处理器可自动执行许多步骤并将多个设备的功能整合到一台机器中，因此需要技术人员的培训和专业故障排除技能较少。由于所有步骤都是在封闭的一次性管道套件中执行的，因此处理器可以在空气处理基础设施不那么严格的设施中运行，这比开放式制造工艺可接受的要低。例如，我们在经过 ISO 8 级认证（与欧盟 C 级相当）的设施中操作处理器。
图 1：使用 T 细胞转导系统生产 CAR-T 细胞。 显示的是安装了管路组的处理器。管路套件允许通过无菌焊接连接其他组件，例如装有处理缓冲液、培养基和慢病毒载体的袋子。将白细胞分离术产品添加到应用袋中后，可以用 T 细胞选择微球标记，通过分离柱，然后转移到再应用袋中。然后将选定的细胞引导至仪器的培养单元进行培养，并用活化试剂活化（参见 材料表）。最终产物被收集在目标细胞袋中。在整个过程中，可以无菌地取出样品进行质量控制。圆圈内的灰色数字表示处理器上引导液体路径通过管路组的编号阀门。经 11 许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：活动矩阵。 在T细胞选择和激活后，CAR-T细胞制造过程的其余部分是完全可定制的。可以添加或删除活动并安排在适当的日期和时间，并且可以指定活动后的培养体积（Volume）。例如，转导活动配置为在第 1 天上午 10：00 开始，活动结束时的培养体积设置为 100 mL。活性矩阵可以在整个培养期间进行编辑。过程状态可以在处理设备的集成屏幕上进行监控。 请点击这里查看此图的较大版本.
本手稿的目的是提供使用处理器制造 CAR-T 细胞的详细演练，并就监管机构批准研究性新药 （IND） 申请可能需要的过程和产品放行测试提供指导。所提出的方案接近供应商推荐的方法，是IND 28617的基础方案，目前正在单中心研究者发起的I/II期临床试验中进行评估。该试验旨在确定使用该处理器为B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）或B系淋巴母细胞淋巴瘤（B-Lly）患者制造人源化CD19定向自体CAR-T细胞的安全性和有效性[NCT05480449]。该试验于 2022 年 9 月开始，计划招募多达 89 名 0-29 岁的 B-ALL 或 B-Lly 患者。我们在手稿中报告了试验的一些制造结果。
我们想指出的是，尽管该手稿是作为协议提出的，并有可遵循的步骤，但它应该被视为其他人开始优化自己的CAR-T细胞制造工艺的起点。所提出的方案的可能变化的不完整列表包括：使用新鲜而不是冷冻保存的T细胞作为起始材料;使用不同的 T 细胞富集方法或完全省略它;使用不同的培养基和细胞因子混合物，例如 IL7/IL15 而不是 IL2;改变人 AB 血清的浓度或完全省略;转导的时间;使用“多命中”转导;不同的搅拌、培养体积和喂养时间表;使用不同的基因转移方法，包括核酸或非慢病毒载体的电穿孔;使用不同的最终配方缓冲液和/或冷冻保护剂;并新鲜输注CAR-T细胞，而不是冷冻保存以备日后输注。这些变化可能对治疗产品的细胞组成和效力产生重大影响。
| 整个过程步骤 | 流程日 | 技术细节 | |||
| 细胞富集 | 第 0 天 | CD4+/CD8+ T细胞的选择 | |||
| 细胞活化 | T细胞培养接种和活化 | ||||
| 细胞转导 | 第1天 | 慢病毒转导（100 mL 培养体积） | |||
| 细胞扩增（随后进行细胞配方） | 第2天 | -- | |||
| 第3天 | 培养液洗涤（1个周期）;振动器激活;培养体积增加到 200 mL | ||||
| 第4天 | -- | ||||
| 第5天 | 补料 （50 mL）;培养体积达到 250 mL 的最终体积 | ||||
| 第6天 | 过程中样品;培养基更换 （-125 mL / +125 mL） | ||||
| 第7天 | 培养基置换 （-150 mL / +150 mL） 或收获 | ||||
| 第8天 | 过程中样品;培养基置换 （-150 mL / +150 mL） 或收获 | ||||
| 第9天 | 培养基置换 （-180 mL / +180 mL） 或 Harvest | ||||
| 第10天 | 过程中样品;培养基置换 （-180 mL / +180 mL） 或 Harvest | ||||
| 第11天 | 培养基置换 （-180 mL / +180 mL） 或 Harvest | ||||
| 第12天 | 培养基置换 （-180 mL / +180 mL） 或 Harvest | ||||
| 第13天 | 收获 | ||||
表 1：流程时间表和概述。 下表总结了当前临床试验中采用的TCT工艺步骤[NCT05480449]。该过程从第 0 天通过 CD4+/CD8+ 选择、培养接种和激活来富集 T 细胞开始，然后在第 1 天进行转导。细胞静置48小时，然后进行培养洗涤，将培养体积增加至200mL，并使用振荡机制进行搅拌。在第 6 天，采集第一个过程中样品。一旦有足够的细胞可用于至少三个全剂量的CAR-T细胞（如果患者为<50kg，则为5×106 个CAR-T细胞/kg，否则为2.5×108 个CAR-T细胞）和质量控制测试（~2 × 106 个CAR-T细胞），就收获细胞;或者一旦培养物达到总共 4-5 x 109 个细胞。缩写：TCT=T细胞转导;CAR-T=嵌合抗原受体T细胞;MACS = 磁激活细胞分选。
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Protocol
所有研究均在医院机构审查委员会 （IRB） 的批准下按照机构指南进行，并且所有受试者均已对发布在试验背景下收集的数据提供知情同意。
注：该协议的第一部分提供了CAR-T制造过程的高级概述。其余部分提供了分步说明。该协议描述了使用 TCT 软件版本 1.4 的工作流程，该版本是撰写本文时的当前版本。其他版本的 TCT 软件的用户界面可能会有所不同。
1. 流程时间表和概述（表 1）
- 在星期一（第 -1 天）准备手术，并进行飞行前检查。确保处理器和其他设备按预期运行，并且所有试剂和耗材都可用于整个生产运行。
- 在第 0 天，在机器上安装管路组。在干浴中解冻先前冷冻保存的 T 细胞，并通过无菌焊接将它们连接到安装在仪器上的管路组。
注：该方案假设通过单采术收集自体T细胞，冷冻保存并储存直至开始生产。虽然可以使用新鲜收集的 T 细胞，但这会增加后勤负担，因为它需要协调单采收集和 CAR-T 细胞制造。我们强烈建议使用干融工艺代替水浴，以最大限度地降低细菌污染的风险。 - 用 CD4 和 CD8 试剂标记 T 细胞（参见 材料表）并通过磁性选择富集。
注意：可以省略 T 细胞富集或在将细胞加载到处理器之前进行富集。见《议定书》第5节。 - CD4+/CD8+细胞富集后，取样进行细胞计数。将 1-2 × 108 个细胞接种在初始体积为 70 mL 的培养基（参见 材料表）中，该培养基补充有 5% 人 AB 血清和重组人 IL2 （25 ng/mL）。
- 加入一小瓶活化试剂（与抗CD3和抗CD28抗体偶联的胶体聚合物纳米基质;参见 材料表）以激活T细胞，并在37ºC下在5%CO2 气氛中孵育培养物24小时，不搅拌。如果需要，冷冻保存任何剩余的 CD4+/CD8+ 细胞作为备份。
注意：在制造失败的情况下，剩余的 CD4+/CD8+ 选定细胞可用作起始材料。如果故障纯粹是技术性的，例如污染或操作员错误，并且有足够的电池残留，则可以考虑使用剩余的电池进行额外的生产运行。如果起始材料的质量令人担忧，则可能需要采用新的单采术;然而，这最终是一个临床决定。无论哪种情况，制造故障都是应进行调查的重大事件，并应通知发起人和可能的监管机构。 - 激活24小时后，以适当的感染多重性（MOI）用慢病毒载体转导T细胞。
注：在开始生产临床产品之前，确定慢病毒载体滴度并建立适当的MOI至关重要。载体滴度应通过进行小规模实验来确定，其中人原代T细胞在不同浓度的载体下转导。适当MOI的考虑因素包括载体成本、所需的转导效率和可接受的载体拷贝数。该方案使用 30-50% 的 MOI 来最大限度地降低载体的成本，并将每个转导细胞的平均载体拷贝数保持在 8 拷贝以下。 - 在第 3 天，触发培养物洗涤活动，并开始低水平搅拌。将培养体积增加到 200 mL。
- 在第 5 天，向培养物中加入 50 mL 培养基，将培养体积增加到 250 mL。
- 在培养的第6天，从培养物中取样，并通过流式细胞术计数CAR-T细胞。使用此测量值来估计培养物的生长速度并确定最佳收获时间。
注：每次过程中取样产生 3 mL 用于测试，并去除 7 mL 总培养体积。 - 从第 7 天到第 13 天，如果培养物尚未终止，则隔天最多再采集两个过程中样品，并每天进行培养基更换以喂养生长中的培养物。当总有核细胞 （TNC） 计数达到 5 × 109 和/或有足够的细胞可用于所需的剂量数和释放测试时收获产品。
- 在收获当天，从积极生长的培养物中采集过程中的样品。该样品用于支原体、内毒素、具有复制能力的慢病毒 （RCL） 检测、载体拷贝数 （VCN） 检测、细胞计数、细胞大小分析、流式细胞术和革兰氏染色。
- 启动最终收获程序，触发去除培养基并用最终制剂缓冲液（补充有 4% 人血清白蛋白的无菌等渗晶体溶液;参见 材料表）进行细胞洗涤。收获完成后，目标细胞袋将在最终配方缓冲液中容纳 100 mL 细胞产物。将二甲基亚砜 （DMSO） 加入浓度为 10% （v/v），将产品分装成单个剂量，并使用控速冰箱冷冻保存。
2. 第 -1 天：准备和飞行前检查
- 验证 CO2 气体水平和压缩空气是否足以在每条管路上产生至少 20 psi 的入口压力。
- 打开处理器并确认启动时没有错误。如果需要，请将时钟设置为正确的时间。关闭处理器。
- 确保已知 T 细胞起始材料的细胞计数、体积、总 CD4+ 和总 CD8+ 计数。
- 确保有足够数量的病毒载体、试剂和耗材用于整个生产过程。
- 将一瓶人 AB 血清放入冰箱解冻过夜。
3. 第 0 天：管路套件安装
- 制备3L处理缓冲液（0.5%（w / v）人血清白蛋白（HSA）在磷酸盐缓冲盐水/乙二胺四乙酸（PBS / EDTA）缓冲液中）。
- 制备 2 L 培养基（2 L 培养基，补充有 100 mL 人 AB 血清，终浓度为 5%，两瓶重组人 IL2，浓度为 25 μg/小瓶;有关这些试剂的更多信息，请参见 材料表 ）。将 10 mL 培养基转移到 20 mL 试剂袋中，并在 4 ºC 下储存过夜。
- 打开仪器，从触摸屏界面选择 T 细胞转导过程 （TCT）。单击 “运行 ”以启动 TCT 进程;让仪器使用屏幕上的说明和提示指导用户完成该过程。
- 在 “参数输入 ”屏幕上，输入操作员的姓名首字母缩写、油管组批号及其到期日期（出现提示）。
- “进程设置”屏幕显示四个不同的进程。选择“完整进程 （1）”。
注意：其他可用的过程包括从 CD4+/CD8+ 选定的 T 细胞开始（参见下面的第 5 节）并重新开始先前中止的生产运行。 - 出现提示时，选择 两瓶 选择试剂以反映 CD4+/CD8+ 选择方法。
- 按照屏幕上的说明安装管道组。确保所有鲁尔连接都紧密，并且管组没有缺陷。
- 按照屏幕上的说明启动自动上下完整性测试。
注意： 由于管路组故障、管路组安装不正确或机器蠕动泵缺陷，完整性测试可能会失败。我们强烈建议手头至少准备一套额外的管路用于生产运行。我们还建议由第二位技术人员验证管路组的正确安装。 - 按照屏幕上的说明安装培养基和处理缓冲袋。
- 开始自动灌注管组。
注意：TCT过程必须在灌注后3小时内继续。确保 T 细胞起始材料准备就绪。
4. T细胞富集
- 当 出现转移细胞产物 屏幕时，开始解冻冻存的 T 细胞产物。
注意：可添加到管组的可接受体积的 T 细胞范围为 50 至 280 mL。靶细胞的最大数量（CD4+和CD8+的总和）为3×109，最大TNC计数为2 × 1010。 - 将解冻的细胞转移到 150 mL 转移袋中。无菌将转移袋焊接到管路组的应用袋上。
- 使用 QC 袋从应用袋中取出样品并进行细胞计数。
- 连接 CD4 和 CD8 试剂瓶。
- 开始选择（T 细胞富集）过程。
- 富集后，从再应用袋的 QC 袋中取出 CD4+/CD8+ 选定细胞的样品，用于细胞计数、流式细胞术和细胞大小分析。
注意：需要细胞计数结果才能进行下一步。
5. 备选方案：从CD4+/CD8+选定细胞开始
- 按照步骤 3.2 中的说明准备培养基。不需要处理缓冲区。
- 打开处理器，在“工艺设置”屏幕上选择“使用 TS 安装 （3） 进行 T 细胞培养”。按照屏幕上的说明和提示进行操作。
- 按照屏幕上的说明，用介质而不是处理缓冲液灌注管路组。
- 当出现“准备培养-连接细胞产品”屏幕时，开始解冻选定的 CD4+/CD8+ T 细胞。
注：该过程的最小 T 细胞数（CD4+ 和 CD8+ T 细胞的总和）为 1.0 × 108。 - 将细胞转移到 150 mL 转移袋中，并用培养基稀释至最终体积为 50 mL。
- 无菌地将细胞悬液焊接到仪器的再应用袋上。
- 从再应用袋的 QC 袋中取出 CD4+/CD8+ 选定细胞的样品，用于细胞计数和细胞大小分析。
6. 活动矩阵的培养设置和编程
- 输入细胞浓度和所需的起始数量（1-2 × 108 个 T 细胞）。
注意：仪器会自动将适当体积从再应用袋中泵入培养室，并将最终体积调节至 70 mL。 - 按照屏幕上的说明连接一小瓶活化试剂。
- 输入5%的CO2浓度和39°C的培养室温度。
注意： 制造商建议输入 39 °C 或专门为仪器校准的值。 - 设置 活动矩阵。使用 增强型进料 方案作为起点，并根据用户定义的规格修改方案中的各个步骤（图 2）。
- 确保 转导 活动的时间为接种后 24 小时（第 1 天）。
- 确保 培养物洗涤 活动的时间为转导后 48 小时（第 3 天）。
- 将 激活摇床 （摇床类型 2）的时间设置为培养物洗涤开始后 30 分钟。
- 删除任何“ 中型袋子 交换”和 “废纸袋交换 ”活动。
- 在屏幕上触摸 确定 开始种植。
- 如果需要，将任何剩余的 CD4+/CD8+ 选定细胞冷冻保存在应用袋中以备将来使用。
7. 第 1 天：T 细胞转导
- 根据所需的MOI计算要使用的慢病毒载体的体积。
- 取回含有10 mL培养基的20 mL试剂袋，该培养基在4ºC下储存过夜（步骤3.2）。解冻载体小瓶，并将 7.1 中计算的体积转移到 20 mL 试剂袋中。
注意：我们建议冷冻任何剩余的载体以保留或用于研究和开发。 - 修改活动矩阵，将 转导 时间设置为未来 2 分钟。出现提示时，轻触 确定 以启动 Transduction 活动。
- 按照屏幕上的说明将载体袋无菌焊接到管路组上。
- 根据转导活动启动的实际时间修改活动矩阵。
注意：我们建议在接种后 20-24 小时内开始转导，以确保在正常工作时间内进行动手活动。- 确保 培养物洗涤 的时间为转导后48小时（第3天）。
- 将激活振荡器（振 荡器 类型2）的时间设置为培养物洗涤后30分钟（第3天）。
- 确保 媒体交换 的时间在第 6 天的下午（下午 1 点）。
8. 第 6 天：第一个过程中样品
- 触摸样品按钮，然后按照屏幕上的说明从活性培养物中获取 QC 样品 。
- 进行细胞计数、流式细胞术和细胞大小分析。送去 1 mL 样品进行革兰氏染色。
注意：细胞计数应大约每隔一天重复一次，以监测培养物的生长。 - 再准备2L培养基（参见步骤3.2）。
- 将“中 型行李交换 ”活动添加到“活动矩阵”中，该活动定时为未来 2 分钟后开始。将 Media Exchange 活动调整为在 20 分钟后开始。按照屏幕上的说明进行操作。
注意：培养 基交换是培养 室中培养基的替代。培养基袋更换是更换挂在仪器上的 培养基袋 。
9. 收获日（第 7 天至第 13 天）：收获和冷冻保存
- 触摸样品按钮，然后按照屏幕上的说明从活性培养物中获取 QC 样品 。
- 将 QC 样品分成三个等分试样，每个等分试样 1 mL。使用 1 mL 进行流式细胞术、细胞计数和细胞大小分析。使用 1 mL 进行支原体、载体拷贝数、具有复制能力的慢病毒和内毒素检测。发送最后的 1 mL 进行革兰氏染色。
- 制备最终配方缓冲液（在2L袋中补充有4%HSA的无菌等渗晶体液，参见 材料表）。保存 100 mL 该缓冲液，以在后续步骤中制备冷冻保护剂溶液。
- 修改活动矩阵，将 区域性结束 时间设置为未来 2 分钟，并删除所有其他剩余活动。按照屏幕上的说明将最终配方缓冲液连接到管组并开始收获。
注意： 处理器会自动将细胞转移到目标细胞袋中。体积为 100 mL。 - 从靶细胞袋 QC 袋中取出 0.5 mL 样品并进行细胞计数。
- 密封目标细胞袋并将其从管路组中取出。将CAR-T产品分成适当的剂量，并在控速冰箱中冷冻保存。将细胞储存在液氮储罐的气相中，温度为≤-150ºC。
注意：剂量的最终配制和等分是特定于方案的。我们在这里提供了一个例子，其中三个等剂量的CAR-T细胞和QC小瓶被冷冻保存。有关详细信息，请参阅第 10 节。 - 从仪器下载过程数据，拆卸和处理管路组，然后执行关闭。
10. CAR-T细胞的冷冻保存
注意：该协议假设CAR-T细胞在制造后冷冻保存并储存，直到患者准备好输注。虽然可以输注新制造的CAR-T细胞，但这增加了后勤负担，因为它需要协调CAR-T细胞制造和CAR-T细胞输注。在制造失败的情况下，这可能会有问题。特别是如果临床方案要求在输注CAR-T之前进行淋巴细胞清除化疗，我们强烈建议进行冷冻保存，因为生产失败可能会使患者面临不必要的化疗风险。监管机构可能会要求研究人员证明产品在输注前通过了所有放行测试，如果没有冷冻保存，这可能很难实现。
- 从最终 100 mL 收获的产品中，确定并取出满足所需 CAR-T 剂量所需的体积和质量控制 （QC） 样品瓶，以执行额外的释放测试（例如，活力）、保留和无菌样品。
注意：制定一个完全定义的策略来分装最终产品至关重要。我们建议在有足够的材料的情况下生产多剂量的产品以允许再次输注。袋装产品体积为 10-20 mL，可通过注射器推动快速解冻和轻松输液。建议将每种产品填充到所需的 CAR-T 细胞剂量（例如，每公斤 5 × 106 个 CAR-T 细胞或 2.5 × 108 个 CAR-T 细胞），因为这样可以避免在输注当天进行剂量计算。还建议冷冻保存至少四个 QC 样品瓶，并考虑可能存在剩余材料的可能性;我们建议保存这些材料，因为它可用于研究和开发目的。 - 离心细胞以减小体积。
- 使用步骤9.3中留出的最终配方缓冲液部分，将产品提高到所需最终体积的一半。
- 通过在最终配方缓冲液中制备 20% DMSO 溶液来制备 2x 冷冻保护剂。
注意：冷冻保护剂配方和DMSO浓度可以修改。 - 以等体积向细胞中加入 2x 冷冻保护剂，使最终 DMSO 浓度为 10%。
注意： 应尽量减少产品暴露于冷冻保护剂的持续时间。 - 填充剂量袋和QC瓶。送 1 mL 进行无菌处理。
注意：监管机构通常要求对最终产品进行 14 天的无菌测定。然而，快速无菌检测正在兴起;此时，药典 14 天法是最常见的。 - 使用控速冰箱冷冻保存产品。
注意： 应验证可控速率冷冻程序以产生 ~ -1 ºC/min 至 ~ -45 ºC 的冷却速率，并对共晶点进行补偿。 - 将产品储存在≤-150°C的液氮超低温冰箱的气相中。
11. 检查程序性能
注：在整个TCT过程中，从活性培养物中抽取了几个QC样品。 表 2 提供了一个网格，可以帮助读者组织结果以供参考并计算过程性能指标。以下术语由字母和数字组成（例如，“B4”）是指此表网格中的单元格。以下值用于性能计算：B3 = 总有核细胞 （TNC） 预富集;B4 = TNC 富集后;E2 = CD4+ 和 CD8+ T 细胞的总和占初始单采产物总细胞的百分比;E4 = CD4+ 和 CD8+ T 细胞的总和占富集后总细胞的百分比;G2 = CD19+细胞占初始产物总细胞的百分比;G4 = CD19+ 细胞占 CD4+/CD8+ 富集后总细胞的百分比;B10 = 收获当天活性培养物的 TNC。
表 2：过程性能网格。 我们提供此网格是为了帮助组织计算过程性能统计信息所需的进程内测试响应。行表示在手术过程中不同时间点分析的样品，并用数字 1-11 标记。第 6-9 行可用于捕获在培养第 6 天之后但在收获日之前采集的样品的结果。列代表测量的参数，并用字母 A-H 标记。灰色阴影字段不适用。根据CD4 + / CD8 +富集是否作为程序的一部分进行以及培养的长度，一些额外的字段可能不适用。我们建议在这些字段中写入“N/A”。缩写：TNC=总有核细胞计数;QC = 质量控制。 请按此下载此表格。
- 使用公式 （1） 将富集后的 CD4+ 加 CD8+ T 细胞总数除以富集前的 CD4+ 加 CD8+ T 细胞总数，计算选择后 CD4+/CD8+ 细胞的回收率。
CD4+/CD8+ T 细胞回收率 =
（1） - 通过将 CD4+/CD8+ 富集后的 CD19+ 细胞总数除以富集前的 CD19+ 细胞总数来计算富集后 CD19+ 细胞的耗竭。由于该数字预计非常小，因此报告该分数的对数，如公式 （2） 所示：
记录 CD19 细胞耗竭 = 记录数10
（2） - 通过使用公式（3）将收获时活性培养物中的细胞总数除以接种的细胞数来计算总倍数增长：
总倍数增长 =
（3） - 通过使用公式 （4） 取总倍数增长相对于收获日期的根来计算平均日生长量：
平均日生长量 = 收获日√（总倍数增长） （4）
（1）
（2）
（3）Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NCT05480449试验的最初三次CAR-T生产运行的结果如下 表3所示。每次运行的起始材料、载体、培养细胞因子和 AB 血清浓度保持一致。产品在第 7 天或第 8 天收获。平均每日细胞生长率为46%（总细胞计数增加），表明TCT过程可有效促进细胞扩增。这些结果表明，该处理器可以产生一致且可重复的CAR-T细胞产品。
表4总结的最终产品测试结果表明，CAR-T细胞通过了质量控制标准。细胞活力在88%-94%之间，CD3 T细胞纯度为89-93%。重要的是，内毒素、支原体、不育、具有复制能力的慢病毒和残留的白血病细胞均未检测到。这些结果证实，TCT工艺可生产出符合临床监管标准的高质量CAR-T细胞。
为此程序开发了三个流式细胞术panel（图3）。它们包括用于检测富集前后 CD4+ 和 CD8+ T 细胞百分比的 CD4/CD8 panel、用于测试转导效率的 CD19 CAR-T panel，以及用于确定最终产物中残留白血病 （CD19+） 细胞的活力和含量的 CD3/CD19 panel。这些panel的结果证实了CAR-T细胞的成功制造，并且最终产品中没有残留的白血病细胞。
总体而言，结果表明，TCT工艺可以生产出适合临床使用的一致且高质量的CAR-T细胞产品。
图 3：流式细胞术检测。 描述了每个panel用于流式细胞术分析的设门策略。浇口绘制为黑框或椭圆并标记，蓝色箭头指示浇口的方向。（A） CD4/CD8 组合。B 细胞定义为淋巴门的 CD19+ 亚群，T 细胞定义为淋巴门的 CD3+ 亚群。CD4+ 和 CD8+ T 细胞是 T 细胞门的亚群。（B） CD19 CAR-T panel。CAR+ T 细胞定义为 CD3+ T 细胞的 CD19-CAR+ 亚群。此外，还枚举了CD19 CAR+的CD4+和CD8+亚群。（C） CD3/CD19 panel。 该panel与CD4/CD8 panel相同，只是省略了CD4和CD8标记物。缩写：SSC-A = 侧散射区;淋巴=淋巴细胞;CD19-CAR=CD19特异性嵌合抗原受体;7AAD = 7-氨基放线菌素 D. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 跑# | 起始材料 | 向量 | 培养细胞因子 | AB 血清 % | 最终TNC | 收获的 CAR-T 细胞总数 | 总倍数增长 | 平均每日增长 | 丰收日 | ||
| 1 | 病人 T细胞、单采术、 冷冻保存 |
胡卡特19 | IL2 （英语） | 5% | 2.75x109 | 2.24×108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | 病人 T细胞、单采术、 冷冻保存 |
胡卡特19 | IL2 （英语） | 5% | 4.15×109 | 1.14×108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | 病人 T细胞、单采术、 冷冻保存 |
胡卡特19 | IL2 （英语） | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
表3：三种临床规模CAR-T生产运行的参数和生长特征。 图中显示了使用该处理器进行NCT05480449临床试验的前三次患者生产运行的培养条件、生长和收获日的详细信息。huCART19，人源化CD19定向CAR慢病毒载体。请注意，这些产物的转导效率和活力如 表4所示。缩写：CAR-T细胞=嵌合抗原受体T细胞;TNC = 总有核细胞。
| 发布测试 | ||||||||||
| 测定 | 细胞活力 | CD3 % | 内毒素 | 霉菌血浆 | 转导效率 | 残留白血病细胞 | 不育第 14 天 | 每个细胞的载体DNA序列 | 每个转导细胞的载体 DNA 序列 | 具有复制能力的慢病毒 |
| 规范 | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3.5 欧标/mL |
阴性 | ≥ 2 % | < 1 % | 无增长 | 报告结果 | 0.04-8 拷贝/转导细胞 |
< 50 拷贝数/μg DNA |
| 结果 | ||||||||||
| 运行 1 | 90 | 89 | <0.4 | 阴性 | 36 % | 不 检测 |
不 成长 |
1.04 | 2.89 | 不 检测 |
| 运行 2 | 88 | 93 | <0.4 | 阴性 | 39 % | 不 检测 |
不 成长 |
1.16 | 2.97 | 不 检测 |
| 运行 3 | 94 | 91 | <0.4 | 阴性 | 18 % | 不 检测 |
不 成长 |
0.43 | 2.39 | 不 检测 |
表 4：最终产品测试和发布规范。 此表中显示的规格适用于NCT05480449临床试验 （IND 28617）。通过流式细胞术测量解冻后活力、CD3%、转导效率和残留白血病细胞含量。使用 FDA 许可的基于鲎变形细胞裂解物的显色试验测量内毒素。使用符合 USP<71> 的方法进行无菌测试。使用定量聚合酶链反应 （qPCR） 测量支原体、每个细胞的载体 DNA 序列数和具有复制能力的慢病毒。通过将载体 DNA 序列号除以转导效率来计算每个转导细胞的载体 DNA 序列号。缩写：EU=内毒素单位;IND = 研究性新药;FDA = 食品和药物管理局。
补充图S1：使用TCT工艺生产的CAR-T细胞的临床前测试。 免疫缺陷 （NSG） 小鼠在第 0 天注射患者来源的异种移植白血病细胞，随后在第 7 天用处理器上制造的 CD19 定向 CAR-T 细胞（“半自动制造”）、传统制造的 CD19 定向 CAR-T 细胞（“标准制造”）或生理盐水处理。（甲、 乙）与生理盐水相比，用半自动制造CAR-T细胞处理的小鼠在两种剂量水平（0.5×106 或2 × 106 CAR-T细胞）的存活率（两种剂量水平的p < 0.0001）。（C） 半自动与标准制造 CAR-T 细胞的比较，其剂量水平已知对标准细胞（0.5 × 106 个 CAR-T 细胞）不可治愈。用来自处理器的CAR-T细胞处理的小鼠的存活率明显更好（p = 0.001）。（D） 半自动与标准制造 CAR-T 细胞在已知可治愈标准 CD19 CAR-T 细胞的剂量水平上的比较。生存率无显著差异（p = 0.4）。（E） 来自处理器的 CAR-T 细胞在两种剂量水平上的比较。在用 2 × 106 个 huCART19 细胞治疗的小鼠中观察到显着的剂量效应和更好的存活率 （p = 0.007）。每组包含5只小鼠。缩写：NSG = non-obese diabetic severe combined immunodeficiency gamma;TCT = T 细胞转导;CAR-T = 嵌合抗原受体 T 细胞。请点击这里下载此文件。
补充图S2：在补充有不同批次人AB血清的培养基中培养的人T细胞的生长和慢病毒转导的比较。（A） 在补充有三种不同批次的人 AB 血清（7J、22A 或 21J）的培养物中扩增未转导 （UTD） 或用 CD19 CAR-T 慢病毒载体 （CAR19） 转导的人 T 细胞。其中一个批次（22A）的增长率大大高于其他两个批次。（B） 来自健康供体的离体扩增 T 细胞的 CD3+ 和 CD3+/CD4+ 或 CD3+/CD8+ 亚群中 CAR19+ 细胞的平均百分比（3 次重复）。请注意，生长速率的差异似乎并不影响细胞吸收慢病毒的能力，这是通过对扩增培养物中的细胞进行流式细胞术分析确定的。T 细胞以及 CD4+ 和 CD8+ 亚群的转导效率在不同培养物之间保持一致。误差线表示 3 种重复培养物的标准偏差。请点击这里下载此文件。
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Discussion
CAR-T细胞疗法已成为B细胞和其他恶性肿瘤的一种有前途的治疗方法。然而，传统的CAR-T细胞制造方法存在一些局限性，例如成本高、劳动密集型生产以及增加污染风险的开放步骤。最近，出现了几个半自动化平台，包括Miltenyi CliniMACS Prodigy（“处理器”），以解决这些限制。T细胞转导（TCT）过程集成到本手稿中描述的处理器中，包括封闭系统中的T细胞富集、活化、病毒转导、培养扩增和收获。目前，竞争的自动化细胞处理器平台使用得不太广泛，但可能具有更好的培养参数过程监测、有利的设备或材料成本或更小的占地面积，这可能允许在生物安全柜中使用，而不是在专用的洁净室空间中使用。选择最适合给定应用程序和环境的平台非常重要。
CAR-T细胞疗法等细胞和基因疗法的一个重大局限性是商业产品成本高昂，这限制了获得挽救生命的疗法。在资源匮乏地区和非第一世界国家尤其如此。我们发现，在干细胞实验室的背景下，在具有当前符合良好生产规范 （cGMP） 的洁净室设施的学术医院环境中部署半自动化工艺时，可以以比同类商业产品低得多的成本制造 CAR-T 细胞，并得到可以执行一些过程中和放行测试的临床实验室的支持。在这种情况下，我们发现执行制造运行的边际成本，包括制造的材料和劳动力以及所有在制品和放行测试（但不包括设备和设施）约为 30,000 美元。需要注意的是，处理器的设备资本成本低于单个商业CAR-T细胞产品的成本。
从手动方法切换到自动方法的潜在问题之一是灵活性降低。TCT 流程虽然使用强大的护栏进行编程，但仍可广泛定制。该过程提供了多个起点，包括具有 T 细胞富集的完整过程、不富集的完整过程（例如，用于 CD4+/CD8+ 预富集细胞，参见上述方案第 5 节）以及恢复中止的过程。此外，活性矩阵功能允许自定义整个培养过程。随着人们对快速CAR-T生产的兴趣日益浓厚，应该注意的是，如果需要，可以将活性基质配置为最早在转导后几个小时开始收获。快速程序具有潜在的双重好处，即通过避免分化和抗白血病活性的丧失，减少制造时间和更有效的产品12。此外，TCT的变体通过使用电穿孔为非病毒载体设计，这进一步提高了系统的灵活性。
CAR-T细胞的最佳收获时间取决于多种因素，包括所需的目标剂量、所需的剂量数以及培养容器在不影响细胞活力的情况下可以支持的最大细胞密度。制造商建议在 250 mL 的体积中不超过 50 亿个细胞。确定所需的目标剂量应基于动物模型中的临床前数据。例如，在这项研究中，我们使用注射患者来源的白血病异种移植物并用 CAR-T 细胞处理的 NOD scid γ 敲除 （NSG） 小鼠来估计有效剂量约为每公斤 200 万至 500 万个 CAR-T 细胞（补充图 S1）。监测细胞大小也可用于确定收获CAR-T细胞的最佳时间。通过仔细考虑这些因素，研究人员可以优化CAR-T细胞的收获时间，以确保最终产品具有高质量和功效。
制定适当的放行测试计划是获得IND申请批准的关键组成部分。我们提出了一套放行测试，包括我们的 IND 28617 的规格，我们相信这将是类似产品的良好起点。然而，监管机构的意见在不断变化，所提出的协议的变化可能会导致监管机构需要不同的测试或不同的规范阈值。我们强烈建议您仔细阅读当前的监管指导文件，例如 FDA 的人类基因治疗研究性新药申请 （IND） 的化学、制造和控制 （CMC） 信息13。一般原则是，证明产品安全性的测试比证明效力的测试更严格地评估。通常，应验证无菌性、内毒素、支原体和具有复制能力的慢病毒等检测，并了解其性能标准。相比之下，在早期试验中，效价测试相对不被重视，可能不需要充分验证。美国食品和药物管理局（FDA）最近的一份指南草案指出，“仅将转基因表达作为效力的衡量标准可能足以支持早期IND研究”14。此外，还应验证用于剂量测定的试验。对于可能没有任何标准化流式测定或参考材料的新 CAR 靶标来说，这可能是个问题。对于这种情况，FDA建议“检测的参考物质可能是基因治疗产品本身的良好表征批次。13 例如，我们使用早期工程运行的 CAR-T 细胞建立了 CD19 CAR 血流测定的阳性对照。
正如我们在工作中所经历的那样，开发和优化CAR-T细胞疗法的制造工艺可能具有挑战性且耗时。我们遇到了一些挫折，包括细菌污染问题。我们强烈建议使用干解冻方法解冻细胞，因为水浴会增加污染的风险。由于培养，即使是很小的接种物也会导致明显的污染，导致产品无法使用。此外，我们建议规划发布测试的后勤工作，这可能涉及额外的验证和与外部各方的合同，以确保及时和准确的测试。开发CAR-T制造工艺的另一个重要因素是优化转导效率。IND申请应包括证明病毒载体效力的数据。为了满足这一要求，同时获得优化MOI的信息，我们强烈建议对人T细胞进行临床级病毒载体的小规模滴定。考虑使用传统制造的CAR-T细胞作为小鼠实验的对照也很重要（如 补充图S1所示）。获得这些细胞可能很困难，需要仔细计划。另一个需要考虑的因素是使用人 AB 血清，这是一种定义不明确的试剂，可能对细胞生长和产品的其他特性产生显着影响。为了解决这个问题，我们建议测试多个批次的AB血清并进行小规模实验，以评估批次对细胞生长的特异性影响（补充图S2）。一旦确定了合适的批次，应购买足够大的批次，以确保整个试验队列的一致性，并最大限度地降低由于血清批次变化而对患者预后产生批次效应的风险。
总之，处理器和所包含的TCT工艺提供了一种制造方法，可以解决当前CAR-T制造程序的几个局限性，包括高成本、劳动密集型生产和开放操作步骤。通过提供封闭和半自动化系统，该处理器有可能提高CAR-T细胞疗法的可用性和可负担性。它可以适应快速制造和非病毒载体，使其成为传统制造方法的灵活替代方案。通过仔细考虑所需的靶剂量、最大细胞密度以及人 AB 血清对细胞生长的影响等因素，研究人员可以优化 CAR-T 细胞的收获时间，以确保最终产品的质量和功效。尽管该过程可能复杂而费力，但规划放行测试的物流和消除污染源有助于降低风险并确保成功的CAR-T细胞生产。总体而言，TCT工艺为CAR-T细胞疗法提供了一条有前途的途径，有可能克服当前的局限性并改善患者的可及性，最终使癌症患者受益。
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Disclosures
S.K.、S.G. 和 Y.W. 已获得 Miltenyi Biotec 的研究支持。
Acknowledgments
作者要感谢一些个人和组织对这项工作的贡献。细胞和基因治疗实验室以及宾夕法尼亚大学转化和相关研究实验室在工艺开发和IND提交准备方面提供了宝贵的帮助。Melissa Varghese 和 Amanda DiNofia 为本手稿基础的 IND 提交的工艺开发和准备做出了贡献。这项工作得到了费城儿童医院细胞和基因治疗合作组织的加速资助。作者还要感谢Miltenyi Biotec的技术和研究支持。 图 1 版权归 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG 所有©;保留所有权利。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
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