Summary
Den här artikeln beskriver tillverkningsprocessen för chimära antigenreceptor-T-celler för klinisk användning, särskilt med hjälp av en automatiserad cellprocessor som kan utföra viral transduktion och odling av T-celler. Vi ger rekommendationer och beskriver fallgropar som bör beaktas under processutveckling och genomförande av en klinisk studie i tidig fas.
Abstract
Chimära antigenreceptorer (CAR)-T-celler representerar en lovande immunterapeutisk metod för behandling av olika maligna och icke-maligna sjukdomar. CAR-T-celler är genetiskt modifierade T-celler som uttrycker ett chimärt protein som känner igen och binder till ett cellytemål, vilket resulterar i att målcellen dödas. Traditionella tillverkningsmetoder för CAR-T-celler är arbetskrävande, dyra och kan medföra risk för kontaminering. CliniMACS Prodigy, en automatiserad cellprocessor, gör det möjligt att tillverka cellterapiprodukter i klinisk skala i ett slutet system, vilket minimerar risken för kontaminering. Bearbetningen sker halvautomatiskt under kontroll av en dator och minimerar därmed mänsklig inblandning i processen, vilket sparar tid och minskar variabilitet och fel.
Detta manuskript och video beskriver processen för T-cellstransduktion (TCT) för tillverkning av CAR-T-celler med hjälp av denna processor. TCT-processen involverar CD4+/CD8+ T-cellsberikning, aktivering, transduktion med en viral vektor, expansion och skörd. Med hjälp av aktivitetsmatrisen, en funktion som gör det möjligt att ordna och tajma dessa steg, kan TCT-processen anpassas i stor utsträckning. Vi ger en genomgång av CAR-T-celltillverkning i enlighet med nuvarande Good Manufacturing Practice (cGMP) och diskuterar nödvändiga frisättningstester och prekliniska experiment som kommer att stödja en Investigational New Drug (IND)-ansökan. Vi demonstrerar genomförbarheten och diskuterar för- och nackdelar med att använda en halvautomatisk process för klinisk CAR-T-celltillverkning. Slutligen beskriver vi en pågående prövarinitierad klinisk studie som riktar sig mot pediatriska B-cellsmaligniteter [NCT05480449] som ett exempel på hur denna tillverkningsprocess kan tillämpas i en klinisk miljö.
Introduction
Adoptiv överföring av T-celler konstruerade för att uttrycka en chimär antigenreceptor (CAR) har visat anmärkningsvärd effekt vid behandling av patienter med refraktära B-cellsmaligniteter 1,2,3,4,5. De traditionella tillverkningsmetoderna för CAR-T-celler är dock arbetsintensiva, tidskrävande och kräver högutbildade tekniker för att utföra högspecialiserade steg. Till exempel involverar den traditionella tillverkningsprocessen för en autolog CAR-T-cellprodukt densitetsgradientcentrifugering, eluering eller magnetisk separation för att anrika T-celler, aktivering och transduktion med en viral vektor i en steril kolv och expansion i en bioreaktor före skörd och formulering. Olika system har nyligen dykt upp som syftar till att delvis automatisera denna process. Till exempel är Miltenyi CliniMACS Prodigy (hädanefter kallad "processorn") en automatiserad cellbearbetningsenhet som kan utföra många av dessa steg på ett automatiserat sätt 6,7,8,9. En djupgående diskussion om traditionella och automatiserade CAR-T-tillverkningsmetoder presenteras i en nyligen publicerad översiktsartikel10.
Processorn bygger på funktionaliteten hos CliniMACS Plus, en medicinteknisk produkt som godkänts av U.S. Food and Drug Administration (FDA) för bearbetning av hematopoetiska stamceller. Processorn innehåller en cellodlingsenhet som möjliggör automatiserad tvättning, fraktionering och odling av celler (figur 1). Processen för T-cellstransduktion (TCT) är ett förinställt program i processorenheten som till stor del replikerar manuell tillverkning av CAR-T-celler. TCT möjliggör anpassningsbar cellbearbetning med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt ("Aktivitetsmatrisen", figur 2). Eftersom processorn automatiserar många steg och konsoliderar funktionaliteten hos flera enheter till en maskin, kräver den mindre utbildning och specialiserade felsökningsfärdigheter från tekniker. Eftersom alla steg utförs i en sluten slangsats för engångsbruk kan processorn användas i anläggningar med mindre sträng luftbehandlingsinfrastruktur än vad som skulle anses acceptabelt för en öppen tillverkningsprocess. Till exempel driver vi processorn i en anläggning som är certifierad som ISO-klass 8 (jämförbar med EU-klass C).
Figur 1: Tillverkning av CAR-T-celler med hjälp av T-cellstransduktionssystemet. Processorn med slangsatsen installerad visas. Slangsatsen gör det möjligt att ansluta andra komponenter, t.ex. påsar som innehåller processbuffert, odlingsmedium och lentiviral vektor, via steril svetsning. När leukaferesprodukten har lagts till i applikationspåsen kan den märkas med T-cellvalspärlor, passera genom separationskolonnen och sedan överföras till återappliceringspåsen. Valda celler dirigeras sedan till odlingsenheten på instrumentet för odling och aktiveras med aktiveringsreagenset (se materialtabell). Slutprodukten samlas i Target-cellpåsen. Under hela processen är det möjligt att ta prover för kvalitetskontroll aseptiskt. Grå siffror inuti cirklarna representerar de numrerade ventilerna på processorn som leder vätskevägen genom slangsatsen. Återges med tillstånd från 11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Aktivitetsmatris. Efter val och aktivering av T-celler är resten av tillverkningsprocessen för CAR-T-celler helt anpassningsbar. Aktiviteter kan läggas till eller tas bort och schemaläggas för lämplig dag och tid, och kulturvolymen efter aktiviteten kan anges (volym). Till exempel konfigurerades transduktionsaktiviteten för att börja kl. 10:00 dag 1 och kulturvolymen i slutet av aktiviteten angavs till 100 ml. Aktivitetsmatrisen kan redigeras under hela odlingsperioden. Processens status kan övervakas på den integrerade skärmen på bearbetningsenheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Syftet med detta manuskript är att ge en detaljerad genomgång av tillverkningen av CAR-T-celler med hjälp av processorn och dessutom ge vägledning om de tester i processen och produktfrisläppning som sannolikt kommer att krävas av tillsynsmyndigheter för att godkänna en IND-ansökan (Investigational New Drug). Det presenterade protokollet ligger nära leverantörens rekommenderade tillvägagångssätt och är det underliggande protokollet för IND 28617, som för närvarande utvärderas i en prövarinitierad fas I/II-studie initierad av ett enda center. Denna studie syftar till att fastställa säkerheten och effekten av att använda denna processor för att tillverka humaniserade CD19-riktade autologa CAR-T-celler för patienter med B-cellsakut lymfatisk leukemi (B-ALL) eller B-linjelymfoblastiskt lymfom (B-Lly) [NCT05480449]. Studien startade i september 2022 och är planerad att inkludera upp till 89 patienter i åldrarna 0-29 år med B-ALL eller B-Lly. Vi redovisar några tillverkningsresultat från försöket i manuskriptet.
Vi vill påpeka att även om manuskriptet presenteras som ett protokoll med steg att följa, bör det ses som en startpunkt för andra att börja optimera sin egen tillverkningsprocess för CAR-T-celler. En icke-uttömmande lista över möjliga variationer av det presenterade protokollet inkluderar: användning av färska istället för kryokonserverade T-celler som utgångsmaterial; Användning av en annan metod för anrikning av T-celler eller utelämnande av den helt och hållet. Användning av olika medier och cytokincocktails såsom IL7/IL15 i stället för IL2. Att variera koncentrationen av AB-serum från människa eller att utesluta det helt och hållet. Tidpunkt för transduktion. med hjälp av "multi-hit"-transduktioner; varierande agitation, odlingsvolymer och utfodringsschema; Användning av olika metoder för genetisk överföring, inklusive elektroporering av nukleinsyror eller icke-lentivirala vektorer. Användning av en annan buffert och/eller kryoprotektivt medel för den slutliga formuleringen. och infundera CAR-T-celler färska istället för kryokonserverande för infusion vid ett senare tillfälle. Dessa variationer kan ha en betydande inverkan på den cellulära sammansättningen och styrkan hos den terapeutiska produkten.
| Övergripande processteg | Process Dag | Teknisk information | |||
| Berikning av celler | Dag 0 | Val av CD4+/CD8+ T-celler | |||
| Aktivering av celler | Sådd och aktivering av T-cellsodling | ||||
| Celltransduktion | Dag 1 | Lentiviral transduktion (100 ml odlingsvolym) | |||
| Cellexpansion (följt av cellformulering) | Dag 2 | -- | |||
| Dag 3 | Kulturtvätt (1 cykel); Shaker aktiverad; Odlingsvolymen ökar till 200 ml | ||||
| Dag 4 | -- | ||||
| Dag 5 | matning (50 ml); Odlingsvolymen når en slutlig volym på 250 ml | ||||
| Dag 6 | Prov under processen; Medieutbyte (-125 ml/+125 ml) | ||||
| Dag 7 | Mediebyte (-150 ml/+150 ml) eller skörd | ||||
| Dag 8 | Prov under processen; Mediebyte (-150 ml/+150 ml) eller skörd | ||||
| Dag 9 | Medieutbyte (-180 ml/+180 ml) eller skörd | ||||
| Dag 10 | Prov under processen; Medieutbyte (-180 ml/+180 ml) eller skörd | ||||
| Dag 11 | Medieutbyte (-180 ml/+180 ml) eller skörd | ||||
| Dag 12 | Medieutbyte (-180 ml/+180 ml) eller skörd | ||||
| Dag 13 | Skörd | ||||
Tabell 1: Tidslinje och översikt över processen. Denna tabell sammanfattar de TCT-processteg som används i en aktuell klinisk prövning [NCT05480449]. Processen börjar med T-cellsberikning genom CD4+/CD8+-selektion, odlingssådd och aktivering på dag 0, följt av transduktion på dag 1. Cellerna vilar i 48 timmar, följt av en odlingstvätt, en ökning av odlingsvolymen till 200 ml och omrörning med hjälp av en skakmekanism. På dag 6 tas det första provet i processen. Cellerna skördas när det finns tillräckligt med celler tillgängliga för minst tre fulla doser av CAR-T-celler (5 × 10 6 CAR-T-celler/kg om patienten väger <50 kg, annars 2,5 × 108 CAR-T-celler) och kvalitetskontrolltestning (~2 × 106 CAR-T-celler). eller när kulturen når totalt 4-5 x 109 celler. Förkortningar: TCT = T-cellstransduktion; CAR-T = chimära antigenreceptor T-celler; MACS = magnetiskt aktiverad cellsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer med godkännande av sjukhusets Institutional Review Board (IRB), och alla försökspersoner har gett informerat samtycke till publicering av de data som samlats in inom ramen för studien.
OBS: Det första avsnittet i protokollet ger en översikt på hög nivå över CAR-T-tillverkningsprocessen. De återstående avsnitten innehåller steg-för-steg-instruktioner. Protokollet beskriver arbetsflödet med hjälp av TCT-programvaruversion 1.4, som är den aktuella versionen när detta skrivs. Användargränssnittet för andra versioner av TCT-programvaran kan variera.
1. Tidsplan och översikt över processen (tabell 1)
- Förbered dig för proceduren på en måndag (dag -1) med preflight-kontroller. Se till att processorn och annan utrustning fungerar som förväntat och att alla reagenser och förbrukningsvaror är tillgängliga och uppdaterade för hela tillverkningskörningen.
- På dag 0, installera slangsatsen på maskinen. Tina tidigare kryokonserverade T-celler i ett torrt bad och anslut dem genom steril svetsning till slangsatsen som är installerad på instrumentet.
OBS: Detta protokoll förutsätter att autologa T-celler samlades in via aferes, kryokonserverades och lagrades fram till tillverkningsstarten. Även om det är möjligt att använda nyinsamlade T-celler, ökar detta den logistiska bördan eftersom det kräver samordning av aferesinsamling med CAR-T-celltillverkning. Vi rekommenderar starkt att du använder en torr-upptiningsprocess istället för ett vattenbad för att minimera risken för bakteriell kontaminering. - Märk T-celler med CD4- och CD8-reagenser (se materialtabell) och berika med magnetiskt urval.
OBS: Det är möjligt att utelämna T-cellsberikning eller utföra den innan cellerna laddas på processorn. Se avsnitt 5 i protokollet. - Efter anrikning av CD4+/CD8+-celler, ta ett prov för cellräkning. Sådd av kulturen med 1-2 × 108 celler i en initial volym på 70 ml medium (se materialförteckning) kompletterat med 5 % humant AB-serum och rekombinant humant IL2 (25 ng/ml).
- Tillsätt en injektionsflaska med aktiveringsreagens (en kolloidal polymer nanomatris konjugerad med anti-CD3- och anti-CD28-antikroppar, se materialtabell) för att aktivera T-celler och inkubera kulturen utan omrörning i 24 timmar vid 37 °C i en 5 % CO2 -atmosfär. Kryokonservera eventuella överblivna CD4+/CD8+-celler som backup, om så önskas.
OBS: I händelse av tillverkningsfel kan överblivna CD4+/CD8+ valda celler användas som utgångsmaterial. Om felet är rent tekniskt, t.ex. kontaminering eller operatörsfel, och det finns tillräckligt många celler kvar, kan man överväga att använda överblivna celler för att utföra ytterligare en tillverkningskörning. Om kvaliteten på utgångsmaterialet är oroväckande kan en ny aferesprocedur vara motiverad. Detta är dock i slutändan ett kliniskt beslut. I båda fallen är ett tillverkningsfel en betydande händelse som bör undersökas, och sponsorn och eventuellt tillsynsmyndigheterna bör informeras. - Efter 24 timmars aktivering transduceras T-celler med lentiviral vektor vid en lämplig multiplicitet av infektion (MOI).
OBS: Det är viktigt att bestämma den lentivirala vektortitern och fastställa en lämplig MOI innan man börjar tillverka kliniska produkter. Vektortitern bör bestämmas genom att utföra ett småskaligt experiment där humana primära T-celler transduceras vid olika koncentrationer av vektorn. Överväganden för lämplig MOI inkluderar kostnaden för vektorn, den önskade transduktionseffektiviteten och ett acceptabelt vektorkopieringsnummer. Detta protokoll använder en MOI på 30-50 % för att minimera kostnaden för vektorn och hålla det genomsnittliga antalet vektorkopior under 8 kopior per transducerad cell. - På dag 3 aktiverar du Culture Wash-aktiviteten och startar agitation på låg nivå. Öka odlingsvolymen till 200 ml.
- På dag 5, tillsätt 50 ml medium till kulturen och öka odlingsvolymen till 250 ml.
- På odlingsdag 6 tas ett prov från odlingen och CAR-T-cellerna räknas med flödescytometri. Använd denna mätning för att uppskatta hur snabbt grödan växer och identifiera den optimala skördetiden.
OBS: Varje pågående provtagning ger 3 ml för testning och tar bort 7 ml total odlingsvolym. - Från dag 7 till 13, om odlingen inte har avslutats, ta upp till två ytterligare prover under processen varannan dag och utför dagliga medieutbyten för att mata den växande kulturen. Skörda produkten när det totala antalet kärnceller (TNC) når 5 × 109 och/eller när tillräckligt många celler finns tillgängliga för det antal doser och frisättningstester som krävs.
- På skördedagen tar du ett prov från den aktivt växande kulturen. Använd detta prov för mykoplasma, endotoxin, replikationskompetent lentivirus (RCL) testning, vektorkopieringsnummer (VCN) testning, cellantal, cellstorleksanalys, flödescytometri och gramfärgning.
- Initiera det slutliga skördeprogrammet, vilket utlöser avlägsnande av odlingsmediet och en celltvätt med den slutliga formuleringsbufferten (en steril isoton kristalloid lösning kompletterad med 4 % humant serumalbumin; se materialförteckning). Efter att skörden är klar kommer målcellpåsen att rymma 100 ml cellprodukt i den slutliga formuleringsbufferten. Tillsätt dimetylsulfoxid (DMSO) till en koncentration av 10 % (v/v), alikvot av produkten i individuella doser och kryokonservering med en kontrollerad frys.
2. Dag -1: Förberedelse och preflight-kontroller
- Kontrollera att CO2 -gasnivåerna och tryckluften är tillräckliga för att producera ett inloppstryck på minst 20 psi på varje ledning.
- Slå på processorn och bekräfta att det inte finns några fel vid start. Ställ in klockan på rätt tid om det behövs. Stäng av processorn.
- Se till att cellantal, volym och totalt CD4+ och totalt CD8+-antal för T-cellens utgångsmaterial är kända.
- Se till att det finns tillräckliga mängder av virusvektorn, reagenser och förbrukningsvaror för hela tillverkningskörningen.
- Ställ en flaska humant AB-serum i kylskåpet för att tina över natten.
3. Dag 0: Installation av slangsats
- Bered 3 l bearbetningsbuffert (0,5 % (vikt/volym) humant serumalbumin (HSA) i fosfatbuffrad koksaltlösning/etylendiamintetraättiksyra (PBS/EDTA)buffert).
- Bered 2 l odlingssubstrat (2 l medium tillsatt med 100 ml humant AB-serum till en slutlig koncentration av 5 % och två injektionsflaskor med rekombinant humant IL2 vid 25 μg/injektionsflaska; se materialtabell för mer information om dessa reagenser). Överför 10 ml odlingsmedium till en 20 ml reagenspåse och förvara vid 4 °C över natten.
- Slå på instrumentet och välj T Cell Transduction Process (TCT) från pekskärmsgränssnittet. Klicka på Kör för att starta TCT-processen. Låt instrumentet guida användaren genom proceduren med hjälp av instruktioner och uppmaningar på skärmen.
- På skärmen Parameterinmatning anger du operatörens initialer, slangsatsens partinummer och dess utgångsdatum när du uppmanas att göra det.
- Skärmen Processinställning visar fyra olika processer. Välj Fullständig process (1).
OBS: Andra tillgängliga processer inkluderar att starta från CD4+/CD8+ valda T-celler (se avsnitt 5 nedan) och starta om en tidigare avbruten tillverkningskörning. - När du uppmanas, välj två injektionsflaskor med selektionsreagens för att återspegla CD4+/CD8+-urvalsmetoden.
- Installera slangsatsen enligt instruktionerna på skärmen. Se till att alla Luer-anslutningar är täta och att det inte finns några defekter i slangsatsen.
- Följ instruktionerna på skärmen för att starta de automatiska övre och nedre integritetstesterna.
OBS: Ett integritetstest kan misslyckas på grund av en felaktig slangsats, en felaktigt installerad slangsats eller en defekt i maskinens peristaltiska pump. Vi rekommenderar starkt att du har minst en extra slangsats till hands för produktionskörningar. Vi rekommenderar också att en andra tekniker verifierar att slangsatsen är korrekt installerad. - Följ instruktionerna på skärmen för att fästa mediet och bearbeta buffertpåsar.
- Starta den automatiska fyllningen av slangsatsen.
OBS: TCT-processen måste fortsätta inom 3 timmar efter grundning. Se till att T-cellens startmaterial är klart.
4. Berikning av T-celler
- När skärmen Överför cellprodukt visas börjar du tina upp den kryokonserverade T-cellsprodukten.
OBS: Den acceptabla volymen T-celler som kan läggas till slangsatsen sträcker sig från 50 till 280 ml. Det maximala antalet målceller (summan av CD4+ och CD8+) är 3 × 109 och det maximala antalet transnationella celler är 2 × 1010. - Överför de tinade cellerna till en 150 ml överföringspåse. Svetsa fast överföringspåsen sterilt i slangsatsens appliceringspåse.
- Ta bort ett prov från applikationspåsen med hjälp av QC-påsen och utför en cellräkning.
- Anslut CD4- och CD8-reagensflaskorna.
- Starta urvalsprocessen (T-cellsberikning).
- Efter anrikning, ta bort ett sample av de CD4+/CD8+ valda cellerna från Reapplication-påsens QC-påse för cellantal, flödescytometri och cellstorleksanalys.
OBS: Cellräkningsresultatet behövs för att gå vidare till nästa steg.
5. Alternativ: Börja med CD4+/CD8+ valda celler
- Förbered mediet enligt beskrivningen i steg 3.2. Ingen bearbetningsbuffert behövs.
- Slå på processorn och välj T-cellsodling med TS-installation (3) på skärmen Process Setup . Följ instruktionerna och anvisningarna på skärmen.
- Följ instruktionerna på skärmen och fyll slangsatsen med medium istället för bearbetningsbuffert.
- När skärmen "Prepare cultivation-Connect cell product" visas, börja tina upp de CD4+/CD8+ valda T-cellerna.
OBS: Det minsta antalet T-celler (summan av CD4+ och CD8+ T-celler) för processen är 1,0 × 108. - Överför cellerna till en 150 ml överföringspåse och späd med medium till en slutlig volym på 50 ml.
- Steril svetsa cellsuspensionen till instrumentets återappliceringspåse.
- Ta bort ett prov av de CD4+/CD8+ valda cellerna från återappliceringspåsens QC-påse för cellantal och cellstorleksanalys.
6. Kulturupplägg och programmering av aktivitetsmatrisen
- Ange cellkoncentration och önskat startnummer (1-2 × 108 T-celler).
OBS: Instrumentet kommer automatiskt att pumpa lämplig volym från återappliceringspåsen till odlingskammaren och justera den slutliga volymen till 70 ml. - Fäst en injektionsflaska med aktiveringsreagenset enligt instruktionerna på skärmen.
- Ange 5 % för CO2 -koncentration och 39 °C för odlingskammarens temperatur.
OBS: Tillverkaren rekommenderar att du anger 39 °C eller ett värde som är specifikt kalibrerat för instrumentet. - Ställ in aktivitetsmatrisen. Använd det förbättrade matningsprotokollet som utgångspunkt och ändra enskilda steg i protokollet till användardefinierade specifikationer (figur 2).
- Se till att tiden för transduktionsaktiviteten är 24 timmar efter sådd (dag 1).
- Se till att tiden för Culture Wash-aktiviteten är 48 timmar efter transduktion (dag 3).
- Ställ in tiden för Activate Shaker (shaker typ 2) till 30 minuter efter start av Culture Wash.
- Ta bort alla aktiviteter för byte av mellansäck och byte av avfallspåse .
- Tryck på ok på skärmen för att börja odla.
- Kryokonservera eventuella överblivna CD4+/CD8+-valda celler i applikationsväskan för framtida bruk, om det behövs.
7. Dag 1: T-cellstransduktion
- Beräkna volymen av den lentivirala vektorn som ska användas baserat på önskad MOI.
- Ta upp 20 ml reagenspåsen med 10 ml odlingsmedium som förvarades vid 4 °C över natten (steg 3.2). Tina injektionsflaskan med vektor och överför den beräknade volymen enligt 7.1 till 20 ml reagenspåsen.
OBS: Vi rekommenderar att du fryser alla överblivna vektorer för retention eller för forskning och utveckling. - Ändra aktivitetsmatrisen för att ställa in tiden för transduktion till 2 minuter in i framtiden. När du uppmanas, tryck på ok för att starta transduktionsaktiviteten.
- Steril svetsa vektorpåsen till slangsatsen enligt instruktionerna på skärmen.
- Ändra aktivitetsmatrisen baserat på den faktiska tiden då transduktionsaktiviteten startades.
OBS: Vi föreslår att du påbörjar transduktionen inom 20-24 timmar efter sådd för att säkerställa att praktiska aktiviteter utförs under normal arbetstid.- Se till att tiden för kulturtvätt är 48 timmar efter transduktion (dag 3).
- Ställ in tiden för Activate Shaker (shaker typ 2) till 30 minuter efter Culture Wash (dag 3).
- Se till att tiden för Media Exchange är på eftermiddagen (kl. 13) dag 6.
8. Dag 6: Första provet i processen
- Tryck på Sample knappen och följ instruktionerna på skärmen för att få en QC sample från den aktiva kulturen.
- Utföra cellräknings-, flödescytometri- och cellstorleksanalyser. Skicka 1 ml av provet för en gramfärgning.
OBS: Cellräkningen bör upprepas ungefär varannan dag för att övervaka kulturens tillväxt. - Förbered ytterligare 2 l odlingsmedium (se steg 3.2).
- Lägg till en Medium Bag Exchange-aktivitet i aktivitetsmatrisen, tidsinställd för att starta 2 minuter in i framtiden. Justera Media Exchange-aktiviteten så att den startar 20 minuter in i framtiden. Följ instruktionerna på skärmen.
OBS: Media Exchange är ersättningen av odlingsmediet i odlingskammaren. Medium Bag Exchange är ersättningen av odlingsmediumpåsen som hängs på instrumentet.
9. Skördedag (var som helst från dag 7 till 13): Skörd och kryokonservering
- Tryck på Sample knappen och följ instruktionerna på skärmen för att få en QC sample från den aktiva kulturen.
- Separera QC-provet i tre alikvoter på 1 ml vardera. Använd 1 ml för flödescytometri, cellantal och cellstorleksanalyser. Använd 1 ml för mykoplasma, vektorkopienummer, replikationskompetent lentivirus och endotoxintestning. Skicka de sista 1 ml för Gram-fläck.
- Bered den slutliga formuleringsbufferten (en steril isoton kristalloidlösning kompletterad med 4 % HSA i en 2 L påse, se Materialtabell). Spara 100 ml av denna buffert för att förbereda kryoprotektivlösningen i ett senare steg.
- Ändra aktivitetsmatrisen för att ställa in tiden för kulturens slut till 2 minuter in i framtiden och ta bort alla andra återstående aktiviteter. Följ instruktionerna på skärmen för att fästa den slutliga formuleringsbufferten på slangsatsen och börja skörda.
OBS: Processorn överför automatiskt cellerna till målcellspåsen. Volymen kommer att vara 100 ml. - Ta ett 0.5 ml prov från Target cell bag QC-påsen och utför en cellräkning.
- Försegla Target-cellpåsen och ta bort den från slangsetet. Dela upp CAR-T-produkten i lämpliga doser och kryokonservera dem i en frys med kontrollerad hastighet. Förvara cellerna i ångfasen i lagringstanken för flytande kväve vid ≤ -150 ºC.
OBS: Slutlig formulering och alikvotering av doser är specifika för protokollet. Vi ger här ett exempel där tre lika stora doser av CAR-T-celler och QC-flaskor kryokonserveras. Se avsnitt 10 för mer information. - Ladda ner processdata från instrumentet, ta bort och kassera slangsatsen och utför en avstängning.
10. Kryokonservering av CAR-T-celler
OBS: Detta protokoll förutsätter att CAR-T-celler kryokonserveras efter tillverkning och lagras tills patienten är redo för infusion. Även om det är möjligt att infusera nytillverkade CAR-T-celler, ökar detta den logistiska bördan eftersom det kräver samordning av CAR-T-celltillverkning med CAR-T-cellinfusion. Detta kan vara problematiskt vid ett tillverkningsfel. Särskilt om det kliniska protokollet kräver lymfonedbrytande kemoterapi före CAR-T-infusion, rekommenderar vi starkt kryokonservering, eftersom ett tillverkningsfel kan utsätta patienten för risken för onödig kemoterapi. Tillsynsmyndigheter kan kräva att utredarna visar att produkten klarar alla frisättningstester före infusion, vilket kan vara svårt att uppnå utan kryokonservering.
- Från de sista 100 ml skördad produkt, bestäm och avlägsna den volym som krävs för att uppfylla de önskade CAR-T-doserna och kvalitetskontrollampullerna (QC) för att utföra ytterligare frisättningstestning (t.ex. viabilitet), retention och ett sterilitetsprov.
OBS: Det är viktigt att utveckla en fullständigt definierad strategi för alikvotering av slutprodukten. Vi föreslår att man tillverkar flera doser av produkten för att möjliggöra reinfusioner, förutsatt att tillräckligt med material finns tillgängligt. En produktvolym på 10-20 ml i en påse möjliggör snabb upptining och enkel infusion genom att trycka på sprutan. Det rekommenderas att varje produkt fylls till önskad CAR-T-celldos (t.ex. 5 × 106 CAR-T-celler per kg eller 2,5 × 108 CAR-T-celler) eftersom detta gör att dosberäkningar på infusionsdagen undviks. Det rekommenderas också att kryokonservera minst fyra QC-flaskor och ta hänsyn till möjligheten att det kan finnas överblivet material; Vi föreslår att du sparar detta material eftersom det kan vara användbart för forsknings- och utvecklingsändamål. - Centrifugera cellerna för att minska volymen.
- Höj produkten/produkterna till hälften av den önskade slutliga volymen med hjälp av den del av bufferten för slutlig formulering som avsatts i steg 9.3.
- Förbered 2x kryoprotektivt medel genom att skapa en 20 % DMSO-lösning i den slutliga formuleringsbufferten.
OBS: Kryoskyddande formulering och DMSO-koncentration kan modifieras. - Tillsätt 2x kryoprotektivt till cellerna i samma volym för en slutlig DMSO-koncentration på 10 %.
OBS: Varaktigheten av exponering av produkten för kryoprotektionsmedel bör minimeras. - Fyll dospåsarna och QC-flaskorna. Skicka 1 ml för sterilitet.
OBS: Regulatorer kräver vanligtvis en 14-dagars sterilitetsanalys utförd på slutprodukten. Snabba sterilitetsanalyser håller dock på att växa fram; För närvarande är kompendiet 14-dagarsmetoden den vanligaste. - Kryokonservera produkter med hjälp av en frys med kontrollerad hastighet.
OBS: Frysprogrammet med kontrollerad hastighet bör valideras för att producera en kylhastighet på ~ -1 ºC/min till ~ -45 ºC, med kompensation för den eutektiska punkten. - Förvara produkten i ångfasen i en frys med ultralåg nivå av flytande kväve vid ≤ -150 °C.
11. Granskning av förfarandets utförande
OBS: Under hela TCT-processen tas flera QC-prover från den aktiva kulturen. Tabell 2 innehåller ett rutnät som kan hjälpa läsaren att organisera resultaten som referens och beräkna prestandamått för procedurer. Termerna nedan som består av en bokstav och en siffra (t.ex. "B4") hänvisar till celler i rutnätet i denna tabell. Följande värden används i prestandaberäkningarna: B3 = totalt antal kärnförsedda celler (TNC) före anrikning; B4 = TNC efter anrikning, E2 = summan av CD4+ och CD8+ T-celler i procent av det totala antalet celler i den ursprungliga aferesprodukten, E4 = summan av CD4+- och CD8+ T-cellerna i procent av det totala antalet celler efter anrikning, G2 = CD19+-celler i procent av det totala antalet celler i den ursprungliga produkten, G4 = CD19+-celler i procent av det totala antalet celler efter CD4+/CD8+-anrikning, B10 = TNC för den aktiva kulturen på skördedagen.
Tabell 2: Rutnät för procedurprestanda. Vi tillhandahåller det här rutnätet för att hjälpa till att organisera testresultat under processen som behövs för att beräkna statistik över procedurprestanda. Rader representerar prover som analyserats vid olika tidpunkter under proceduren och är märkta med siffrorna 1-11. Raderna 6–9 kan användas för att samla in resultat från prover som tagits efter odlingsdag 6 men före skördedagen. Kolumner representerar uppmätta parametrar och är märkta med bokstäverna A-H. Fält som är skuggade i grått gäller inte. Vissa ytterligare fält kanske inte är tillämpliga beroende på om CD4+/CD8+-berikning utförs som en del av proceduren och odlingens längd. Vi föreslår att du skriver "N/A" i dessa fält. Förkortningar: TNC = totalt antal kärnförsedda celler; QC = kvalitetskontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
- Beräkna utbytet av CD4+/CD8+-celler efter selektion genom att dividera det totala antalet CD4+ plus CD8+ T-celler efter anrikning med det totala antalet CD4+ plus CD8+ T-celler före anrikning med hjälp av ekvation (1).
CD4+/CD8+ T-cellsåterhämtning =
(1) - Beräkna utarmning av CD19+-celler efter anrikning genom att dividera det totala antalet CD19+-celler efter CD4+/CD8+-anrikning med det totala antalet CD19+-celler före anrikning. Eftersom detta tal förväntas vara mycket litet, rapportera logaritmen för detta bråk enligt ekvation (2):
Logg CD19-cellutarmning = log10
(2) - Beräkna den totala veckningstillväxten genom att dividera det totala antalet celler i aktiv kultur vid skörd med antalet celler som såddes med hjälp av ekvation (3):
Total tillväxt =
(3) - Beräkna den genomsnittliga dagliga tillväxten genom att ta roten till den totala vecklingen med avseende på skördedagen med hjälp av ekvation (4):
Genomsnittlig daglig tillväxt = skördedag √ (total vecktillväxt) (4)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten från de tre första CAR-T-tillverkningskörningarna i NCT05480449-studien presenteras nedan i tabell 3. Koncentrationerna av utgångsmaterial, vektor, odlingscytokiner och AB hölls konstanta för varje körning. Produkterna skördades dag 7 eller 8. Den genomsnittliga dagliga celltillväxten var 46 % (ökning av det totala celltalet), vilket indikerar att TCT-processen var effektiv för att främja cellexpansion. Dessa resultat tyder på att processorn kan producera konsekventa och reproducerbara CAR-T-cellprodukter.
De slutliga produkttestresultaten, sammanfattade i tabell 4, visar att CAR-T-cellerna klarade kvalitetskontrollstandarderna. Cellviabiliteten var mellan 88 % och 94 %, och CD3 T-cellernas renhet var 89-93 %. Det är viktigt att notera att endotoxin, mykoplasma, sterilitet, replikationskompetent lentivirus och kvarvarande leukemiceller inte kunde detekteras. Dessa resultat bekräftar att TCT-processen producerar högkvalitativa CAR-T-celler som uppfyller regulatoriska standarder för klinisk användning.
Tre flödescytometripaneler utvecklades för denna procedur (figur 3). De inkluderar CD4/CD8-panelen för att testa procentandelen CD4+ och CD8+ T-celler före och efter anrikning, CD19 CAR-T-panelen för att testa transduktionseffektivitet och CD3/CD19-panelen för att bestämma viabilitet och innehållet av kvarvarande leukemiceller (CD19+) i slutprodukten. Resultaten från dessa paneler bekräftar den framgångsrika tillverkningen av CAR-T-celler och frånvaron av kvarvarande leukemiceller i slutprodukten.
Sammantaget tyder resultaten på att TCT-processen kan producera konsekventa och högkvalitativa CAR-T-cellprodukter som är lämpliga för klinisk användning.
Figur 3: Flödescytometrianalyser. Den gatingstrategi som används för flödescytometrianalys visas för varje panel. Grindarna är ritade som svarta rutor eller ellipser och märkta, och blå pilar anger gatingens riktning. (A) CD4/CD8-panel. B-celler definieras som CD19+-undergruppen och T-celler som CD3+-delmängden av lymfporten. CD4+ och CD8+ T-celler är delmängder av T-cellgrinden. (B) CD19 CAR-T-panel. CAR+ T-celler definieras som CD19-CAR+-delmängden av CD3+ T-celler. Dessutom räknas CD4+- och CD8+-delmängder som är CD19 CAR+ upp. (C) CD3/CD19-panel. Denna panel är identisk med CD4/CD8-panelen, förutom att den utelämnar CD4- och CD8-markörerna. Förkortningar: SSC-A = sidospridningsområde; lymfa = lymfocyt; CD19-CAR = CD19-specifik chimär antigenreceptor; 7AAD = 7-aminoaktinomycin D. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Springa # | Utgångsmaterial | Vektor | Odling av cytokiner | AB Serum % | Slutlig TNC | Totalt antal skördade CAR-T-celler | Total tillväxt | Genomsnittlig daglig tillväxt | Skördedagen | ||
| 1 | Tålmodig T-celler, aferes, Kryokonserverad |
huCART19 | IL2 | 5% | 2,75 × 109 | 2,24 × 108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Tålmodig T-celler, aferes, Kryokonserverad |
huCART19 | IL2 | 5% | 4,15 × 109 | 1,14 × 108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Tålmodig T-celler, aferes, Kryokonserverad |
huCART19 | IL2 | 5% | 4,20 × 109 | 8,40 × 107 | 21 | 46% | 8 | ||
Tabell 3: Parametrar och tillväxtkarakteristika för tre CAR-T-tillverkningsomgångar i klinisk skala. Detaljer om odlingsförhållanden, tillväxt och skördedag för de tre första patienttillverkningskörningarna med processorn för den NCT05480449 kliniska prövningen visas. huCART19, humaniserad CD19-riktad CAR lentiviral vektor. Observera att transduktionseffektivitet och livskraft för dessa produkter visas i tabell 4. Förkortningar: CAR-T-celler = chimära antigenreceptor-T-celler; TNC = totalt antal kärnförsedda celler.
| Testning av utgåvor | ||||||||||
| Prövning | Cellernas livskraft | CD3 % | Endotoxin | Myko-plasma | Effektivitet vid transduktion | Kvarvarande leukemiceller | Sterilitet dag 14 | Vektor-DNA-sekvens per cell | Vektor-DNA-sekvens per transducerad cell | Replikationskompetent Lentivirus |
| Specifikation | ≥ 70 % | ≥ 80 % | ≤ 3,5 EU/ml |
Negativ | ≥ 2 % | < 1 % | Ingen tillväxt | Rapportera resultat | 0.04-8 Kopior/transducerade celler |
< 50 kopior/μg DNA |
| Resultat | ||||||||||
| Körning 1 | 90 | 89 | <0.4 | Negativ | 36 % | Inte Upptäckt |
Nej Tillväxt |
1.04 | 2.89 | Inte Upptäckt |
| Åk 2 | 88 | 93 | <0.4 | Negativ | 39 % | Inte Upptäckt |
Nej Tillväxt |
1.16 | 2.97 | Inte Upptäckt |
| Åk 3 | 94 | 91 | <0.4 | Negativ | 18 % | Inte Upptäckt |
Nej Tillväxt |
0.43 | 2.39 | Inte Upptäckt |
Tabell 4: Slutliga produkttester och specifikationer för lansering. Specifikationerna i denna tabell gäller för den NCT05480449 kliniska prövningen (IND 28617). Livsduglighet efter upptining, CD3 %, transduktionseffektivitet och kvarvarande leukemicellinnehåll mättes med flödescytometri. Endotoxin mättes med hjälp av ett FDA-licensierat limulus amebocytlysatbaserat kromogent test. Sterilitetstestning utfördes med en USP<71>kompatibel metod. Mykoplasma, vektor-DNA-sekvensnummer per cell och replikationskompetent lentivirus mättes med kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR). Vektor-DNA-sekvensnummer per transducerad cell beräknades genom att dividera vektor-DNA-sekvensnumret med transduktionseffektiviteten. Förkortningar: EU = endotoxinenhet; IND = prövningsläkemedel för nya läkemedel; FDA = Food and Drug Administration.
Kompletterande figur S1: Preklinisk testning av CAR-T-celler tillverkade med hjälp av TCT-processen. Möss med immunbrist (NSG) injicerades med patienthärledda xenograftleukemiceller på dag 0 och behandlades därefter med CD19-riktade CAR-T-celler tillverkade på processorn ("halvautomatisk tillverkning"), traditionellt tillverkade CD19-riktade CAR-T-celler ("standardtillverkning") eller koksaltlösning på dag 7. (A, B) Överlevnad hos möss som behandlats med halvautomatiska CAR-T-celler vid två dosnivåer (0,5 × 10 6 eller 2 × 106 CAR-T-celler) jämfört med koksaltlösning (p < 0,0001 för båda dosnivåerna). C) Jämförelse mellan halvautomatiska CAR-T-celler och CAR-T-celler för standardtillverkning vid en dosnivå som är känd för att vara icke-botande för standardceller (0,5 × 106 CAR-T-celler). Överlevnaden var signifikant bättre hos möss som behandlades med CAR-T-celler från processorn (p = 0,001). D) Jämförelse av halvautomatiska CAR-T-celler med standardceller vid en dosnivå som är känd för att vara botande för standard-CD19 CAR-T-celler. Överlevnaden skilde sig inte signifikant (p = 0,4). E) Jämförelse av CAR-T-celler från processorn vid de två dosnivåerna. En signifikant doseffekt observerades med bättre överlevnad hos möss som behandlades med 2 × 106 huCART19-celler (p = 0,007). Varje grupp innehöll 5 möss. Förkortningar: NSG = növerviktiga diabetiker severe kombinerad immunbrist gamma; TCT = Överföring av T-celler; CAR-T = chimära antigenreceptor T-celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Jämförelse av tillväxt och lentiviral transduktion av humana T-celler odlade i medium kompletterat med olika partier humant AB-serum. A) Expansion av humana T-celler som inte har transducerats (UTD) eller som har transducerats med CD19 CAR-T lentiviral vektor (CAR19) i odlingar som kompletterats med tre olika partier humant AB-serum (7J, 22A eller 21J). Tillväxttakten för en av delarna (22A) var betydligt högre än för de två andra. B) Genomsnittlig procentandel (3 replikat) CAR19+-celler i subpopulationerna CD3+ och CD3+/CD4+ eller CD3+/CD8+ av ex vivo-expanderade T-celler från friska donatorer. Observera att skillnader i tillväxthastighet inte verkade påverka cellernas förmåga att ta upp lentivirus, vilket bestämdes genom flödescytometrisk analys av cellerna från de expanderade kulturerna. Transduktionseffektiviteten hos T-celler och subpopulationerna CD4+ och CD8+ var konsekvent från odling till odling. Felstaplar representerar standardavvikelser för 3 upprepade kulturer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-cellterapi har visat sig vara en lovande behandlingsmetod för B-celler och andra maligniteter. Traditionella tillverkningsmetoder för CAR-T-celler har dock flera begränsningar, såsom höga kostnader, arbetsintensiv produktion och öppna steg som ökar risken för kontaminering. Nyligen har flera halvautomatiserade plattformar, inklusive Miltenyi CliniMACS Prodigy ("processorn"), dykt upp för att ta itu med dessa begränsningar. T-cellstransduktionsprocessen (TCT), integrerad i processorn som beskrivs i detta manuskript, omfattar T-cellsberikning, aktivering, viral transduktion, odlingsexpansion och skörd i ett slutet system. Konkurrerande automatiserade cellprocessorplattformar används i mindre utsträckning för närvarande men kan ha bättre övervakning av odlingsparametrar i processen, gynnsam utrustnings- eller materialkostnad eller ett mindre fotavtryck, vilket kan möjliggöra användning i ett biosäkerhetsskåp istället för ett dedikerat renrumsutrymme. Det är viktigt att välja en plattform som är optimalt lämpad för en viss applikation och miljö.
En betydande begränsning för cell- och genterapier som CAR-T-cellterapi är de höga kostnaderna för kommersiella produkter, vilket begränsar tillgången till livräddande terapi. Detta är särskilt fallet i resursfattiga miljöer och länder utanför den första världen. Vi har funnit att det är möjligt att tillverka CAR-T-celler till en dramatiskt lägre kostnad än en jämförbar kommersiell produkt när man använder en halvautomatiserad process i miljön på ett akademiskt sjukhus som har befintliga nuvarande Good Manufacturing Practice (cGMP)-kompatibla renrumsanläggningar i samband med ett stamcellslaboratorium och stöd från ett kliniskt laboratorium som kan utföra några av process- och frisättningstesterna. Under dessa omständigheter finner vi att marginalkostnaden för att utföra en tillverkningskörning, inklusive material och arbetskraft för tillverkning och all process- och frisläppningstestning (men inte inklusive utrustning och anläggningar) är cirka 30 000 USD. Det bör noteras att utrustningens kapitalkostnad för processorn är lägre än kostnaden för en enda kommersiell CAR-T-cellprodukt.
Ett av de potentiella problemen med att byta från en manuell till en automatiserad metod är minskad flexibilitet. TCT-processen, även om den är programmerad med starka skyddsräcken, är fortfarande i stor utsträckning anpassningsbar. Processen erbjuder flera startpunkter, inklusive en fullständig process med T-cellsanrikning, en fullständig process utan anrikning (t.ex. för användning med CD4+/CD8+ föranrikade celler, se avsnitt 5 i protokollet ovan) och ett återupptagande av en avbruten process. Dessutom gör Activity Matrix-funktionen det möjligt att anpassa hela odlingsprocessen. Med det växande intresset för snabb CAR-T-tillverkning bör det noteras att det är möjligt att konfigurera aktivitetsmatrisen så att den börjar skörda så tidigt som några timmar efter transduktion, om så önskas. Det snabba förfarandet har den potentiella dubbla fördelen av minskad tillverkningstid och en mer potent produkt genom att undvika differentiering och förlust av anti-leukemisk aktivitet12. Dessutom har en variant av TCT designats för icke-virala vektorer med hjälp av elektroporering, vilket ytterligare ökar systemets flexibilitet.
Den optimala skördetiden för CAR-T-celler beror på olika faktorer, inklusive den önskade måldosen, antalet doser som krävs och den maximala celltäthet som odlingskärlet kan stödja utan att kompromissa med cellviabiliteten. Tillverkaren rekommenderar att man inte överskrider 5 miljarder celler i en volym på 250 ml. Bestämning av önskad måldos bör baseras på prekliniska data i en djurmodell. Till exempel, i denna studie, använde vi NOD scid gamma knockout (NSG) möss injicerade med patienthärledda leukemiska xenografter och behandlade med CAR-T-celler för att uppskatta att en effektiv dos skulle vara ungefär mellan 2 och 5 miljoner CAR-T-celler per kilogram (kompletterande figur S1). Övervakning av cellstorlek kan också vara användbart för att bestämma den optimala tidpunkten för skörd av CAR-T-celler. Genom att noggrant överväga dessa faktorer kan forskare optimera skördetiden för CAR-T-celler för att säkerställa att slutprodukten är av hög kvalitet och effektivitet.
Att utveckla en lämplig plan för utgivningstestning är en viktig komponent för att få godkännande för en IND-ansökan. Vi presenterar en uppsättning releasetester inklusive specifikationer för vår IND 28617, och vi tror att detta kommer att vara en bra utgångspunkt för liknande produkter. Tillsynsmyndigheternas åsikter utvecklas dock ständigt, och variationer av det presenterade protokollet kan leda till att tillsynsmyndigheterna kräver olika tester eller olika specifikationströsklar. Vi rekommenderar starkt att du noggrant läser aktuella regulatoriska vägledningsdokument som FDA:s Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)13. En allmän princip är att tester som visar en produkts säkerhet utvärderas strängare än tester som visar styrka. I allmänhet bör tester som sterilitet, endotoxin, mykoplasma och replikationskompetent lentivirus valideras, och deras prestandakriterier bör vara kända. Däremot är potenstester relativt nedtonade i prövningar i tidig fas och behöver kanske inte valideras fullt ut. I ett nyligen utarbetat utkast till riktlinjer från FDA står det att "enbart transgenuttryck som ett mått på styrka kan vara tillräckligt för att stödja IND-studier i tidig fas"14. Dessutom bör tester som används för dosbestämning valideras. Detta kan vara problematiskt för nya CAR-mål för vilka det kanske inte finns några standardiserade flödesanalyser eller referensmaterial. I det här fallet föreslår FDA att "referensmaterialet för en analys kan vara en välkarakteriserad del av själva genterapiprodukten." 13 Till exempel etablerade vi en positiv kontroll för CD19 CAR-flödesanalysen med hjälp av CAR-T-celler från tidiga tekniska körningar.
Att utveckla och optimera tillverkningsprocessen för CAR-T-cellterapi kan vara utmanande och tidskrävande, vilket vi upplevde i vårt arbete. Vi stötte på flera motgångar, bland annat problem med bakteriell kontaminering. Vi förespråkar starkt att man använder en torr upptiningsmetod för upptining av celler, eftersom vattenbad kan öka risken för kontaminering. På grund av odling kan även ett litet inokulat leda till öppen kontaminering, vilket resulterar i en oanvändbar produkt. Dessutom rekommenderar vi att du planerar logistik för versionstestning, vilket kan innebära ytterligare valideringar och avtal med externa parter för att säkerställa snabb och korrekt testning. En annan viktig del när man utvecklar en CAR-T-tillverkningsprocess är att optimera transduktionseffektiviteten. En IND-ansökan bör innehålla data för att visa virusvektorns styrka. För att uppfylla detta krav och samtidigt få information för att optimera MOI rekommenderar vi starkt att man utför en småskalig titrering av den kliniska virusvektorn på humana T-celler. Det är också viktigt att överväga användningen av traditionellt tillverkade CAR-T-celler som kontroll för musexperiment (som visas i kompletterande figur S1). Att få tag på dessa celler kan vara svårt och kräva noggrann planering. En annan faktor att ta hänsyn till är användningen av humant AB-serum, som är ett dåligt definierat reagens som kan ha en betydande effekt på celltillväxt och andra egenskaper hos produkten. För att ta itu med detta föreslår vi att man testar flera partier av AB-serum och genomför småskaliga experiment för att bedöma partispecifika effekter på celltillväxt (kompletterande figur S2). När ett lämpligt parti har identifierats bör en tillräckligt stor volym köpas in för att säkerställa enhetlighet över hela prövningskohorten och minimera risken för satseffekter i patientutfall som beror på förändringar i serumpartiet.
Sammanfattningsvis erbjuder processorn och den medföljande TCT-processen en tillverkningsmetod som kan hantera flera begränsningar i nuvarande CAR-T-tillverkningsprocedurer, inklusive höga kostnader, arbetsintensiv produktion och öppna manipuleringssteg. Genom att tillhandahålla ett slutet och halvautomatiskt system har denna processor potential att förbättra tillgängligheten och prisvärdheten för CAR-T-cellterapi. Den kan rymma snabb tillverkning och icke-virala vektorer, vilket gör den till ett flexibelt alternativ till traditionella tillverkningsmetoder. Genom att noggrant överväga faktorer som önskad måldos, maximal celltäthet och effekterna av humant AB-serum på celltillväxt kan forskare optimera skördetiden för CAR-T-celler för att säkerställa slutproduktens kvalitet och effektivitet. Även om processen kan vara komplex och mödosam kan planering av logistik för frisläppningstestning och eliminering av föroreningskällor bidra till att minska riskerna och säkerställa framgångsrik tillverkning av CAR-T-celler. Sammantaget utgör TCT-processen en lovande väg för CAR-T-cellterapi, med potential att övervinna nuvarande begränsningar och förbättra patienttillgängligheten, vilket i slutändan gynnar patienter med cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.K., S.G. och Y.W. har fått forskningsstöd från Miltenyi Biotec.
Acknowledgments
Författarna vill tacka flera personer och organisationer för deras bidrag till detta arbete. Cell and Gene Therapy Laboratory och Penn Translational and Correlative Studies Laboratory gav värdefull hjälp med processutveckling och förberedelse för IND-ansökningar. Melissa Varghese och Amanda DiNofia bidrog till processutvecklingen och förberedelserna för IND-inlämningar som ligger till grund för detta manuskript. Detta arbete stöddes av ett Acceleration Grant från Cell and Gene Therapy Collaborative vid Children's Hospital of Philadelphia. Författarna vill också tacka Miltenyi Biotec för deras tekniska stöd och forskningsstöd. Figur 1 omfattas av copyright © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Alla rättigheter förbehållna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217 (2016).
- Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
- Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).
- Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
- Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
