Summary
Dit artikel beschrijft het productieproces voor chimere antigeenreceptor-T-cellen voor klinisch gebruik, met name met behulp van een geautomatiseerde celprocessor die virale transductie en kweek van T-cellen kan uitvoeren. We geven aanbevelingen en beschrijven valkuilen waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de procesontwikkeling en implementatie van een klinische studie in een vroege fase.
Abstract
Chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen vertegenwoordigen een veelbelovende immunotherapeutische benadering voor de behandeling van verschillende kwaadaardige en niet-kwaadaardige ziekten. CAR-T-cellen zijn genetisch gemodificeerde T-cellen die een chimeer eiwit tot expressie brengen dat een doelwit op het celoppervlak herkent en eraan bindt, wat resulteert in het doden van de doelcel. Traditionele productiemethoden voor CAR-T-cellen zijn arbeidsintensief, duur en kunnen het risico op besmetting met zich meebrengen. De CliniMACS Prodigy, een geautomatiseerde celprocessor, maakt het mogelijk om celtherapieproducten op klinische schaal te produceren in een gesloten systeem, waardoor het risico op besmetting wordt geminimaliseerd. De verwerking vindt semi-automatisch plaats onder controle van een computer en minimaliseert zo de menselijke betrokkenheid bij het proces, wat tijd bespaart en variabiliteit en fouten vermindert.
Dit manuscript en deze video beschrijven het T-celtransductieproces (TCT) voor het vervaardigen van CAR-T-cellen met behulp van deze processor. Het TCT-proces omvat CD4+/CD8+ T-celverrijking, activering, transductie met een virale vector, expansie en oogst. Met behulp van de Activity Matrix, een functionaliteit die het mogelijk maakt om deze stappen te ordenen en te timen, kan het TCT-proces uitgebreid worden aangepast. We geven een overzicht van de productie van CAR-T-cellen in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practice (cGMP) en bespreken de vereiste afgiftetests en preklinische experimenten die een aanvraag voor een nieuw geneesmiddel (Investigational New Drug) (IND) zullen ondersteunen. We demonstreren de haalbaarheid en bespreken de voor- en nadelen van het gebruik van een semi-automatisch proces voor de productie van klinische CAR-T-cellen. Ten slotte beschrijven we een lopende, door onderzoekers geïnitieerde klinische studie die zich richt op pediatrische B-celmaligniteiten [NCT05480449] als een voorbeeld van hoe dit productieproces kan worden toegepast in een klinische setting.
Introduction
Adoptieve overdracht van T-cellen die zijn ontworpen om een chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie te brengen, heeft een opmerkelijke werkzaamheid aangetoond bij de behandeling van patiënten met refractaire B-celmaligniteiten 1,2,3,4,5. De traditionele productiemethoden voor CAR-T-cellen zijn echter arbeidsintensief, tijdrovend en vereisen hoogopgeleide technici om zeer gespecialiseerde stappen uit te voeren. Het traditionele productieproces van een autoloog CAR-T-celproduct omvat bijvoorbeeld dichtheidsgradiëntcentrifugatie, elutriatie of magnetische scheiding om T-cellen te verrijken, activering en transductie met een virale vector in een steriele kolf en expansie in een bioreactor voorafgaand aan de oogst en formulering. De laatste tijd zijn er verschillende systemen ontstaan die tot doel hebben dit proces gedeeltelijk te automatiseren. De Miltenyi CliniMACS Prodigy (hierna de "processor" genoemd) is bijvoorbeeld een geautomatiseerd celverwerkingsapparaat dat veel van deze stappen op een geautomatiseerde manier kan uitvoeren 6,7,8,9. Een diepgaande bespreking van traditionele en geautomatiseerde CAR-T-productiemethoden wordt gepresenteerd in een recent overzichtsartikel10.
De processor bouwt voort op de functionaliteit van de CliniMACS Plus, een door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd medisch hulpmiddel voor de verwerking van hematopoëtische voorlopercellen. De processor bevat een celkweekeenheid die het mogelijk maakt om cellen automatisch te wassen, te fractioneren en te kweken (Figuur 1). Het T-celtransductieproces (TCT) is een vooraf ingesteld programma binnen het processorapparaat dat grotendeels de handmatige productie van CAR-T-cellen repliceert. TCT maakt aanpasbare celverwerking mogelijk met behulp van een grafische gebruikersinterface (de "Activity Matrix", Figuur 2). Omdat de processor veel stappen automatiseert en de functionaliteit van meerdere apparaten in één machine consolideert, vereist het minder training en gespecialiseerde probleemoplossingsvaardigheden van technologen. Omdat alle stappen worden uitgevoerd binnen een gesloten slangenset voor eenmalig gebruik, kan de processor worden gebruikt in faciliteiten met een minder strenge luchtbehandelingsinfrastructuur dan acceptabel zou worden geacht voor een open productieproces. We werken bijvoorbeeld met de verwerker in een faciliteit die is gecertificeerd als ISO-klasse 8 (vergelijkbaar met EU-klasse C).
Figuur 1: Productie van CAR-T-cellen met behulp van het T-celtransductiesysteem. Afgebeeld is de processor met de slangenset geïnstalleerd. De slangenset maakt het mogelijk om andere componenten zoals zakken met verwerkingsbuffer, kweekmedium en lentivirale vector via steriel lassen met elkaar te verbinden. Zodra het leukafereseproduct aan de applicatiezak is toegevoegd, kan het worden geëtiketteerd met T-celselectieparels, door de scheidingskolom worden gehaald en vervolgens worden overgebracht naar de zak voor opnieuw aanbrengen. Geselecteerde cellen worden vervolgens naar de kweekeenheid van het kweekinstrument geleid en geactiveerd met het activeringsreagens (zie materiaaltabel). Het eindproduct wordt opgevangen in de Target cell bag. Gedurende het hele proces is het mogelijk om monsters aseptisch te verwijderen voor kwaliteitscontrole. Grijze getallen in cirkels vertegenwoordigen de genummerde kleppen op de processor die het vloeistofpad door de slangenset leiden. Gereproduceerd met toestemming van 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Activiteitenmatrix. Na selectie en activering van de T-cel is de rest van het productieproces van de CAR-T-cel volledig aanpasbaar. Activiteiten kunnen worden toegevoegd of verwijderd en gepland voor de juiste dag en tijd, en het kweekvolume na de activiteit kan worden opgegeven (Volume). De transductieactiviteit is bijvoorbeeld geconfigureerd om op dag 1 om 10:00 uur te beginnen en het kweekvolume aan het einde van de activiteit is ingesteld op 100 ml. De Activity Matrix kan gedurende de hele teeltperiode worden bewerkt. De status van het proces kan worden bewaakt op het geïntegreerde scherm van het verwerkingsapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het doel van dit manuscript is om een gedetailleerd overzicht te geven van de productie van CAR-T-cellen met behulp van de processor en bovendien richtlijnen te geven voor de tests tijdens het proces en de productvrijgave die waarschijnlijk door regelgevers zullen worden vereist om een aanvraag voor een nieuw geneesmiddel (IND) goed te keuren. Het gepresenteerde protocol blijft dicht bij de aanbevolen aanpak van de leverancier en is het onderliggende protocol voor IND 28617, dat momenteel wordt geëvalueerd in een door de onderzoeker geïnitieerde fase I/II klinische studie in één centrum. Deze studie heeft tot doel de veiligheid en werkzaamheid te bepalen van het gebruik van deze processor om gehumaniseerde CD19-gerichte autologe CAR-T-cellen te produceren voor patiënten met B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) of B-lijn lymfoblastisch lymfoom (B-Lly) [NCT05480449]. De studie is gestart in september 2022 en is gepland om tot 89 patiënten in de leeftijd van 0-29 jaar in te schrijven met B-ALL of B-Lly. We rapporteren enkele productieresultaten van de proef in het manuscript.
We willen erop wijzen dat, hoewel het manuscript wordt gepresenteerd als een protocol met te volgen stappen, het moet worden beschouwd als een startpunt voor anderen om te beginnen met het optimaliseren van hun eigen CAR-T-celproductieproces. Een niet-uitputtende lijst van mogelijke variaties op het gepresenteerde protocol omvat: het gebruik van verse in plaats van gecryopreserveerde T-cellen als uitgangsmateriaal; een andere methode van T-celverrijking te gebruiken of helemaal weg te laten; het gebruik van verschillende media en cytokinecocktails zoals IL7/IL15 in plaats van IL2; de concentratie van humaan AB-serum te variëren of helemaal weg te laten; timing van transductie; het gebruik van "multi-hit"-transducties; variërende agitatie, kweekvolumes en voedingsschema; het gebruik van verschillende methoden voor genetische overdracht, waaronder elektroporatie van nucleïnezuren of niet-lentivirale vectoren; het gebruik van een andere buffer en/of cryoprotectant voor de uiteindelijke formulering; en het toedienen van verse CAR-T-cellen in plaats van cryopreservatie voor infusie op een later tijdstip. Deze variaties kunnen een aanzienlijke invloed hebben op de cellulaire samenstelling en potentie van het therapeutische product.
| Algemene processtap | Dag van het proces | Technische gegevens | |||
| Cel verrijking | Dag 0 | Selectie van CD4+/CD8+ T-cellen | |||
| Cel Activatie | Zaaien en activeren van T-celkweek | ||||
| Celtransductie | Dag 1 | Lentivirale transductie (100 ml kweekvolume) | |||
| Celexpansie (gevolgd door celformulering) | Dag 2 | -- | |||
| Dag 3 | Culture Wash (1 cyclus); Shaker geactiveerd; Kweekvolume neemt toe tot 200 ml | ||||
| Dag 4 | -- | ||||
| Dag 5 | Voer (50 ml); Het kweekvolume bereikt het uiteindelijke volume van 250 ml | ||||
| Dag 6 | Monster in proces; Media-uitwisseling (-125 ml / +125 ml) | ||||
| Dag 7 | Media-uitwisseling (-150 ml / +150 ml) of oogst | ||||
| Dag 8 | Monster in proces; Media-uitwisseling (-150 ml / +150 ml) of oogst | ||||
| Dag 9 | Media-uitwisseling (-180 ml / +180 ml) of oogst | ||||
| Dag 10 | Monster in proces; Media-uitwisseling (-180 ml / +180 ml) of oogst | ||||
| Dag 11 | Media-uitwisseling (-180 ml / +180 ml) of oogst | ||||
| Dag 12 | Media-uitwisseling (-180 ml / +180 ml) of oogst | ||||
| Dag 13 | Oogst | ||||
Tabel 1: Procestijdlijn en overzicht. Deze tabel geeft een overzicht van de TCT-processtappen die worden gebruikt in een lopend klinisch onderzoek [NCT05480449]. Het proces begint met T-celverrijking door CD4+/CD8+-selectie, kweekzaaien en activeren op dag 0, gevolgd door transductie op dag 1. Cellen rusten 48 uur, gevolgd door een kweekwassing, een verhoging van het kweekvolume tot 200 ml en agitatie met behulp van een schudmechanisme. Op dag 6 wordt het eerste procesmonster genomen. Cellen worden geoogst zodra er voldoende cellen beschikbaar zijn voor ten minste drie volledige doses CAR-T-cellen (5 × 10, 6 CAR-T-cellen/kg als de patiënt <50 kg, anders 2,5 × 10,8 CAR-T-cellen) en kwaliteitscontroletests (~2 × 10,6 CAR-T-cellen); of zodra de kweek een totaal van 4-5 x 109 cellen bereikt. Afkortingen: TCT = T-celtransductie; CAR-T = chimere antigeenreceptor T-cellen; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen met goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van het ziekenhuis, en alle proefpersonen hebben geïnformeerde toestemming gegeven voor publicatie van de gegevens die in het kader van het onderzoek zijn verzameld.
OPMERKING: Het eerste deel van het protocol geeft een overzicht op hoog niveau van het productieproces van CAR-T. De overige secties bevatten de stap-voor-stap instructies. Het protocol beschrijft de workflow met behulp van TCT-softwareversie 1.4, de huidige versie op het moment van schrijven. De gebruikersinterface van andere versies van de TCT-software kan variëren.
1. Procestijdlijn en overzicht (tabel 1)
- Bereid je voor op de procedure op maandag (dag -1) met preflight-controles. Zorg ervoor dat de processor en andere apparatuur werken zoals verwacht en dat alle reagentia en verbruiksartikelen beschikbaar en up-to-date zijn voor de gehele productierun.
- Installeer op dag 0 de slangenset op de machine. Ontdooi eerder gecryopreserveerde T-cellen in een droog bad en verbind ze door middel van steriel lassen met de slangenset die op het instrument is geïnstalleerd.
OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat autologe T-cellen via aferese zijn verzameld, gecryopreserveerd en bewaard tot het begin van de productie. Hoewel het mogelijk is om vers verzamelde T-cellen te gebruiken, verhoogt dit de logistieke last omdat het aferese-verzameling moet worden gecoördineerd met de productie van CAR-T-cellen. We raden ten zeerste aan om een droog dooiproces te gebruiken in plaats van een waterbad om het risico op bacteriële besmetting te minimaliseren. - Label T-cellen met CD4- en CD8-reagentia (zie Materiaaltabel) en verrijk ze door magnetische selectie.
OPMERKING: Het is mogelijk om T-celverrijking achterwege te laten of uit te voeren voordat cellen op de processor worden geladen. Zie punt 5 van het protocol. - Neem na verrijking van CD4+/CD8+-cellen een monster voor een celgetal. Zaai de kweek met 1-2 × 108 cellen in een beginvolume van 70 ml medium (zie materiaaltabel) aangevuld met 5% humaan AB-serum en recombinant humaan IL2 (25 ng/ml).
- Voeg een injectieflacon met activeringsreagens toe (een colloïdale polymere nanomatrix geconjugeerd aan anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen; zie materiaaltabel) om T-cellen te activeren en de cultuur gedurende 24 uur bij 37 ºC in een atmosfeer van 5% CO2 te incuberen. Cryopreserve eventuele overgebleven CD4+/CD8+ cellen als back-up, indien gewenst.
NOTITIE: In geval van fabricagefouten kunnen overgebleven CD4+/CD8+ geselecteerde cellen als uitgangsmateriaal worden gebruikt. Als de storing puur technisch is, zoals een contaminatie of een bedieningsfout, en er voldoende cellen overblijven, kan worden overwogen om overgebleven cellen te gebruiken om een extra productierun uit te voeren. Als de kwaliteit van het uitgangsmateriaal van belang is, kan een nieuwe afereseprocedure gerechtvaardigd zijn; Dit is echter uiteindelijk een klinische beslissing. In beide gevallen is een fabricagefout een belangrijke gebeurtenis die moet worden onderzocht en moeten de sponsor en mogelijk regelgevers op de hoogte worden gebracht. - Transduceer na 24 uur activering T-cellen met lentivirale vector bij een geschikte multipliciteit van infectie (MOI).
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de lentivirale vectortiter te bepalen en een geschikt MOI vast te stellen voordat u begint met het vervaardigen van klinische producten. De vectortiter moet worden bepaald door een kleinschalig experiment uit te voeren waarbij menselijke primaire T-cellen worden getransduceerd in verschillende concentraties van de vector. Overwegingen voor de juiste MOI zijn onder meer de kosten van de vector, de gewenste transductie-efficiëntie en een acceptabel vectorkopienummer. Dit protocol maakt gebruik van een MOI van 30-50% om de kosten van de vector te minimaliseren en het gemiddelde aantal vectorkopieën onder de 8 kopieën per getransduceerde cel te houden. - Activeer op dag 3 de Culture Wash-activiteit en begin met agitatie op laag niveau. Verhoog het kweekvolume tot 200 ml.
- Voeg op dag 5 50 ml medium toe aan de kweek en verhoog het kweekvolume tot 250 ml.
- Neem op dag 6 van de kweek een monster van de kweek en inventariseer CAR-T-cellen door middel van flowcytometrie. Gebruik deze meting om de groeisnelheid van de teelt in te schatten en het optimale moment van oogsten te bepalen.
OPMERKING: Elke bemonstering tijdens het proces levert 3 ml op voor testen en verwijdert in totaal 7 ml kweekvolume. - Van dag 7 tot dag 13, als de kweek niet is beëindigd, neem dan om de dag maximaal twee extra monsters tijdens het proces en voer dagelijkse media-uitwisselingen uit om de groeiende cultuur te voeden. Oogst het product wanneer het totale aantal kerncellen (TNC's) 5 × 109 bereikt en/of wanneer er voldoende cellen beschikbaar zijn voor het vereiste aantal doses en afgiftetests.
- Neem op de dag van de oogst een monster van de actief groeiende cultuur. Gebruik dit monster voor mycoplasma, endotoxine, replicatiecompetent lentivirus (RCL)-testen, VCN-testen (vector copy number), celgetal, celgrootte-analyse, flowcytometrie en gramkleuring.
- Start het laatste oogstprogramma, dat de verwijdering van het kweekmedium en een celwassing met de uiteindelijke formuleringsbuffer (een steriele isotone kristalloïde oplossing aangevuld met 4% humaan serumalbumine; zie Materiaaltabel) in gang zet. Nadat de oogst is voltooid, bevat de doelcelzak 100 ml celproduct in de uiteindelijke formuleringsbuffer. Voeg dimethylsulfoxide (DMSO) toe tot een concentratie van 10% (v/v), verdeel het product in individuele doses en cryopreservatie met behulp van een vriezer met gecontroleerde snelheid.
2. Dag -1: Voorbereiding en preflight-controles
- Controleer of het CO2 - gasgehalte en de perslucht voldoende zijn om op elke leiding een inlaatdruk van ten minste 20 psi te produceren.
- Schakel de processor in en controleer of er geen fouten zijn bij het opstarten. Stel indien nodig de klok in op de juiste tijd. Schakel de processor uit.
- Zorg ervoor dat het celgetal, het volume en het totale CD4+ en het totale aantal CD8+ van het T-celuitgangsmateriaal bekend zijn.
- Zorg ervoor dat er voldoende hoeveelheden van de virale vector, reagentia en verbruiksartikelen zijn voor de gehele productierun.
- Zet een flesje humaan AB-serum in de koelkast om een nacht te ontdooien.
3. Dag 0: Installatie van de slangenset
- Bereid 3 l verwerkingsbuffer (0,5 % (m/v) humaan serumalbumine (HSA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (PBS/EDTA)-buffer).
- Bereid 2 l kweekmedium (2 l medium aangevuld met 100 ml humaan AB-serum tot een eindconcentratie van 5% en twee injectieflacons recombinant humaan IL2 in een dosis van 25 μg/flacon; zie de materiaaltabel voor meer informatie over deze reagentia). Breng 10 ml kweekmedium over in een reagenszak van 20 ml en bewaar een nacht bij 4 ºC.
- Schakel het instrument in en selecteer het T-celtransductieproces (TCT) in de touchscreen-interface. Klik op Uitvoeren om het TCT-proces te starten; Laat het instrument de gebruiker door de procedure leiden met behulp van instructies en aanwijzingen op het scherm.
- Voer op het scherm Parameterinvoer de initialen van de operator, het lotnummer van de slangset en de vervaldatum in wanneer daarom wordt gevraagd.
- Het scherm Procesinstellingen presenteert vier verschillende processen. Kies Volledig proces (1).
OPMERKING: Andere beschikbare processen zijn onder meer het starten van CD4+/CD8+ geselecteerde T-cellen (zie sectie 5 hieronder) en het opnieuw starten van een eerder afgebroken productierun. - Kies desgevraagd twee injectieflacons met selectiereagens om de CD4+/CD8+-selectiemethode weer te geven.
- Installeer de slangenset volgens de instructies op het scherm. Zorg ervoor dat alle Luer-aansluitingen goed vastzitten en dat er geen defecten in de slangset zijn.
- Volg de instructies op het scherm om de geautomatiseerde integriteitstests aan de boven- en onderkant te starten.
NOTITIE: Een integriteitstest kan mislukken als gevolg van een defecte slangenset, een verkeerd geïnstalleerde slangenset of een defect in de peristaltische pomp van de machine. We raden ten zeerste aan om ten minste één extra slangenset bij de hand te hebben voor productieruns. We raden ook aan dat een tweede technoloog de juiste installatie van de slangenset controleert. - Volg de instructies op het scherm voor het bevestigen van het medium en het verwerken van bufferzakken.
- Begin met het automatisch vullen van de slangenset.
NOTITIE: Het TCT-proces moet binnen 3 uur na het aanzuigen worden voortgezet. Zorg ervoor dat het startmateriaal van de T-cel klaar is.
4. T-cel verrijking
- Wanneer het scherm Transfer cell-product verschijnt, begint u met het ontdooien van het gecryopreserveerde T-celproduct.
NOTITIE: Het acceptabele volume T-cellen dat aan de slangset kan worden toegevoegd, varieert van 50 tot 280 ml. Het maximale aantal doelcellen (som van CD4+ en CD8+) is 3 × 109 en het maximale aantal TNC's is 2 × 1010. - Breng de ontdooide cellen over in een transferzak van 150 ml. Las de transferzak steriel aan de applicatiezak van de slangenset.
- Verwijder een monster uit de applicatiezak met behulp van het QC-zakje en voer een celtelling uit.
- Sluit de CD4- en CD8-reagensflacons aan.
- Start het selectieproces (T-celverrijking).
- Verwijder na verrijking een monster van de door CD4+/CD8+ geselecteerde cellen uit het QC-zakje van de Reapplication-zak voor celtelling, flowcytometrie en analyse van de celgrootte.
OPMERKING: Het resultaat van het celgetal is nodig om door te gaan naar de volgende stap.
5. Alternatief: Beginnend met CD4+/CD8+ geselecteerde cellen
- Bereid het medium voor zoals beschreven in stap 3.2. Er is geen verwerkingsbuffer nodig.
- Schakel de processor in en selecteer T-celteelt met TS-installatie (3) op het scherm Procesinstellingen . Volg de instructies en aanwijzingen op het scherm.
- Volg de instructies op het scherm en vul de slangenset met medium in plaats van met verwerkingsbuffer.
- Wanneer het scherm "Prepare cultivation-Connect cell product" verschijnt, begint u met het ontdooien van de door CD4+/CD8+ geselecteerde T-cellen.
OPMERKING: Het minimum aantal T-cellen (som van CD4+ en CD8+ T-cellen) voor het proces is 1,0 × 108. - Breng de cellen over in een transferzak van 150 ml en verdun met medium tot een eindvolume van 50 ml.
- Las de celsuspensie steriel aan de Reapplication-zak van het instrument.
- Verwijder een monster van de door CD4+/CD8+ geselecteerde cellen uit het QC-zakje van de Reapplication-zak voor analyse van het aantal cellen en de celgrootte.
6. Cultuuropzet en programmering van de Activiteitenmatrix
- Voer de celconcentratie en het gewenste startnummer in (1-2 × 108 T-cellen).
NOTITIE: Het instrument pompt automatisch het juiste volume uit de zak voor opnieuw aanbrengen in de kweekkamer en past het uiteindelijke volume aan tot 70 ml. - Bevestig een injectieflacon met het activeringsreagens volgens de instructies op het scherm.
- Voer 5% in voor de CO2 -concentratie en 39 °C voor de temperatuur in de kweekkamer.
OPMERKING: De fabrikant raadt aan om 39 °C in te voeren of een waarde die specifiek voor het instrument is gekalibreerd. - Stel de Activiteitenmatrix in. Gebruik het uitgebreide voerprotocol als uitgangspunt en pas afzonderlijke stappen binnen het protocol aan volgens de door de gebruiker gedefinieerde specificaties (Afbeelding 2).
- Zorg ervoor dat de tijd van transductieactiviteit 24 uur na het zaaien is (dag 1).
- Zorg ervoor dat de tijd van de Culture Wash-activiteit 48 uur na de transductie is (dag 3).
- Stel de tijd van Activate Shaker (shaker type 2) in op 30 min na het begin van de Culture Wash.
- Verwijder alle activiteiten voor het omwisselen van middelgrote zakken en het omruilen van afvalzakken .
- Tik op ok op het scherm om te beginnen met cultiveren.
- Cryopreserve alle overgebleven CD4+/CD8+ geselecteerde cellen in de applicatiezak voor toekomstig gebruik, indien nodig.
7. Dag 1: T-celtransductie
- Bereken het volume van de te gebruiken lentivirale vector op basis van het gewenste MOI.
- Pak de reagenszak van 20 ml met 10 ml kweekmedium die een nacht bij 4 ºC is bewaard (stap 3.2). Ontdooi de vectorinjectieflacon en breng het in 7.1 berekende volume over in de reagenszak van 20 ml.
OPMERKING: We raden aan om overgebleven vector in te vriezen voor retentie of voor onderzoek en ontwikkeling. - Wijzig de activiteitsmatrix om de tijd van transductie in te stellen op 2 minuten in de toekomst. Wanneer daarom wordt gevraagd, tikt u op ok om de transductieactiviteit te starten.
- Las de vectorzak steriel aan de slangenset volgens de instructies op het scherm.
- Wijzig de activiteitsmatrix op basis van het werkelijke tijdstip waarop de transductieactiviteit is gestart.
OPMERKING: We raden aan om binnen 20-24 uur na het zaaien met transductie te beginnen om ervoor te zorgen dat hands-on activiteiten tijdens normale werkuren worden uitgevoerd.- Zorg ervoor dat het tijdstip van Culture Wash 48 uur na transductie is (dag 3).
- Stel de tijd van Activate Shaker (shaker type 2) in op 30 min na Culture Wash (dag 3).
- Zorg ervoor dat het tijdstip van Media Exchange in de middag (1 uur) van dag 6 is.
8. Dag 6: Eerste monster in proces
- Raak de knop Monster aan en volg de instructies op het scherm om een QC-monster van de actieve cultuur te verkrijgen.
- Voer celgetal-, flowcytometrie- en celgrootteanalyses uit. Stuur 1 ml van het monster voor een Gram-kleuring.
OPMERKING: Het aantal cellen moet ongeveer om de dag worden herhaald om de groei van de kweek te controleren. - Bereid nog eens 2 L kweekmedium (zie stap 3.2).
- Voeg een Medium Bag Exchange-activiteit toe aan de Activity Matrix, getimed om 2 minuten in de toekomst te beginnen. Pas de Media Exchange-activiteit aan om 20 minuten in de toekomst te beginnen. Volg de instructies op het scherm.
LET OP: Media Exchange is de vervanger van het kweekmedium in de kweekkamer. Medium Bag Exchange is de vervanging van de kweekmedium tas die aan het instrument wordt gehangen.
9. Dag van de oogst (ergens tussen dag 7 en 13): Oogst en cryopreservatie
- Raak de knop Monster aan en volg de instructies op het scherm om een QC-monster van de actieve cultuur te verkrijgen.
- Scheid het QC-monster in drie aliquots van elk 1 ml. Gebruik 1 ml voor flowcytometrie, celgetal en celgrootte-analyses. Gebruik 1 ml voor mycoplasma, vectorkopienummer, replicatiecompetent lentivirus en endotoxinetesten. Stuur de laatste 1 ml voor Gram-kleuring.
- Bereid de uiteindelijke formuleringsbuffer (een steriele isotone kristalloïde oplossing aangevuld met 4 % HSA in een zak van 2 liter, zie materiaaltabel). Bewaar 100 ml van deze buffer om de cryoprotectieve oplossing in een latere stap te bereiden.
- Wijzig de activiteitenmatrix om de tijd van het einde van de cultuur in te stellen op 2 minuten in de toekomst en verwijder alle andere resterende activiteiten. Volg de instructies op het scherm om de uiteindelijke formuleringsbuffer aan de slangenset te bevestigen en met de oogst te beginnen.
NOTITIE: De processor brengt de cellen automatisch over in de doelcelzak. Het volume zal 100 ml zijn. - Neem een monster van 0,5 ml uit het QC-zakje van de doelcelzak en voer een celtelling uit.
- Sluit de Target-celzak af en verwijder deze uit de slangset. Verdeel het CAR-T-product in de juiste doses en cryopreservatie ze in een vriezer met gecontroleerde snelheid. Bewaar cellen in de dampfase van de opslagtank voor vloeibare stikstof bij ≤ -150 ºC.
OPMERKING: De uiteindelijke formulering en aliquotering van de doses zijn specifiek voor het protocol. We geven hier een voorbeeld waarin drie gelijke doses CAR-T-cellen en QC-flacons worden gecryopreserveerd. Zie rubriek 10 voor meer informatie. - Download de procesgegevens van het instrument, verwijder de slangenset en gooi deze weg en voer een uitschakeling uit.
10. Cryopreservatie van CAR-T-cellen
OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat CAR-T-cellen na fabricage worden ingevroren en bewaard totdat de patiënt klaar is voor infusie. Hoewel het mogelijk is om vers vervaardigde CAR-T-cellen te injecteren, verhoogt dit de logistieke last omdat de productie van CAR-T-cellen moet worden gecoördineerd met CAR-T-celinfusie. Dit kan problematisch zijn in het geval van een fabricagefout. Vooral als het klinische protocol lymfodepletie vereist voorafgaand aan CAR-T-infusie, raden we ten zeerste cryopreservering aan, omdat een fabricagefout de patiënt kan blootstellen aan het risico van onnodige chemotherapie. Regelgevers kunnen van onderzoekers eisen dat ze aantonen dat het product alle afgiftetests voorafgaand aan de infusie doorstaat, wat moeilijk te bereiken kan zijn zonder cryopreservatie.
- Bepaal en verwijder uit de laatste 100 ml van het geoogste product het volume dat nodig is om te voldoen aan de gewenste CAR-T-doses en kwaliteitscontroleflacons (QC) voor het uitvoeren van aanvullende afgiftetests (bijv. levensvatbaarheid), retentie en een steriliteitsmonster.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om een volledig gedefinieerde strategie te ontwikkelen voor het aliquoteren van het eindproduct. We raden aan om meerdere doses van het product te produceren om herinfusies mogelijk te maken, aangezien er voldoende materiaal beschikbaar is. Een productvolume van 10-20 ml in een zak zorgt voor een snelle ontdooiing en eenvoudige infusie door de injectiespuit te duwen. Het wordt aanbevolen om elk product af te vullen tot de gewenste dosis CAR-T-cellen (bijv. 5 × 106 CAR-T-cellen per kg of 2,5 × 108 CAR-T-cellen), omdat dit de noodzaak van dosisberekeningen op de dag van infusie voorkomt. Ook aanbevolen wordt om ten minste vier QC-flacons te cryopreservatie te maken en rekening te houden met de mogelijkheid dat er materiaal overblijft; We raden aan dit materiaal op te slaan, omdat het nuttig kan zijn voor onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden. - Centrifugeer de cellen om het volume te verminderen.
- Breng het (de) product(en) tot de helft van het gewenste eindvolume met behulp van het deel van de uiteindelijke formuleringsbuffer dat in stap 9.3 is gereserveerd.
- Bereid 2x cryoprotectant voor door een 20% DMSO-oplossing te creëren in de uiteindelijke formuleringsbuffer.
OPMERKING: De formulering van de cryoprotectant en de DMSO-concentratie kunnen worden gewijzigd. - Voeg 2x cryoprotectant toe aan cellen in gelijk volume voor een uiteindelijke DMSO-concentratie van 10%.
OPMERKING: De duur van de blootstelling van het product aan cryoprotectant moet tot een minimum worden beperkt. - Vul de doseerzakken en QC-flacons. Stuur 1 ml voor steriliteit.
OPMERKING: Regelgevers vereisen gewoonlijk een steriliteitstest van 14 dagen die op het eindproduct wordt uitgevoerd. Er zijn echter snelle steriliteitstests in opkomst; Op dit moment is de Compendial 14-daagse methode de meest gebruikelijke. - Cryopreservatie van producten met behulp van een vriezer met gecontroleerde snelheid.
NOTITIE: Het vriesprogramma met gecontroleerde snelheid moet worden gevalideerd om een koelsnelheid van ~ -1 ºC/min tot ~ -45 ºC te produceren, met compensatie voor het eutectische punt. - Bewaar het product in de dampfase van een ultralage vriezer met vloeibare stikstof bij ≤ -150 °C.
11. Onderzoek van de uitvoering van de procedure
OPMERKING: Tijdens het TCT-proces worden verschillende QC-monsters genomen uit de actieve cultuur. Tabel 2 bevat een raster dat de lezer kan helpen bij het ordenen van de resultaten ter referentie en het berekenen van de prestatiestatistieken van de procedure. De onderstaande termen, bestaande uit een letter en een cijfer (bijv. "B4") verwijzen naar cellen in het raster van deze tabel. Bij de prestatieberekeningen worden de volgende waarden gebruikt: B3 = totale kerncellen (TNC) voorverrijking; B4 = TNC na verrijking; E2 = De som van CD4+ en CD8+ T-cellen als percentage van het totale aantal cellen van het initiële afereseproduct; E4 = De som van de CD4+ en CD8+ T-cellen als percentage van het totale aantal cellen na verrijking; G2 = CD19+ cellen als percentage van het totale aantal cellen van het oorspronkelijke product; G4 = CD19+ cellen als percentage van het totale aantal cellen na CD4+/CD8+ verrijking; B10 = TNC van de actieve cultuur op de dag van de oogst.
Tabel 2: Prestatieschema van de procedure. We bieden dit raster om te helpen bij het organiseren van testresultaten tijdens het proces die nodig zijn om procedureprestatiestatistieken te berekenen. Rijen vertegenwoordigen monsters die op verschillende tijdstippen tijdens de procedure zijn geanalyseerd en zijn gelabeld met de nummers 1-11. Rijen 6-9 kunnen worden gebruikt om de resultaten vast te leggen van monsters die zijn genomen na dag 6 van de teelt, maar vóór de dag van de oogst. Kolommen vertegenwoordigen gemeten parameters en zijn gelabeld met de letters A-H. Velden die grijs zijn gearceerd, zijn niet van toepassing. Sommige extra percelen zijn mogelijk niet van toepassing, afhankelijk van het feit of CD4+/CD8+-verrijking wordt uitgevoerd als onderdeel van de procedure en de duur van de teelt. We raden aan om "N.v.t." in die velden te schrijven. Afkortingen: TNC = totaal aantal cellen met kernen; QC = kwaliteitscontrole. Klik hier om deze tabel te downloaden.
- Bereken het herstel van CD4+/CD8+-cellen na selectie door het totale aantal CD4+ plus CD8+ T-cellen na verrijking te delen door het totale aantal CD4+ plus CD8+ T-cellen voorafgaand aan verrijking met behulp van vergelijking (1).
CD4+/CD8+ T-cel herstel =
(1) - Bereken de uitputting van CD19+-cellen na verrijking door het totale aantal CD19+-cellen na CD4+/CD8+-verrijking te delen door het totale aantal CD19+-cellen vóór verrijking. Aangezien dit getal naar verwachting zeer klein zal zijn, rapporteert u de logaritme van deze breuk zoals weergegeven in vergelijking (2):
Log CD19 cel depletie = log10
(2) - Bereken de totale vouwgroei door het totale aantal cellen in actieve cultuur bij de oogst te delen door het aantal gezaaide cellen met behulp van vergelijking (3):
Totale vouwgroei =
(3) - Bereken de gemiddelde dagelijkse groei door de wortel te nemen van de totale vouwgroei ten opzichte van de dag van de oogst met behulp van vergelijking (4):
Gemiddelde dagelijkse groei = dag van oogst √ (totale vouwgroei) (4)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de eerste drie productieruns van CAR-T van de NCT05480449 proef worden hieronder weergegeven in tabel 3. Het uitgangsmateriaal, de vector, de kweekcytokines en de AB-serumconcentraties werden voor elke run consistent gehouden. Producten werden geoogst op dag 7 of 8. De gemiddelde dagelijkse celgroei was 46% (toename van het totale celgetal), wat aangeeft dat het TCT-proces effectief was in het bevorderen van celexpansie. Deze resultaten suggereren dat de processor consistente en reproduceerbare CAR-T-celproducten kan produceren.
De testresultaten van het eindproduct, samengevat in tabel 4, tonen aan dat de CAR-T-cellen de kwaliteitscontrolenormen hebben doorstaan. De levensvatbaarheid van de cellen lag tussen 88% en 94% en de zuiverheid van de CD3 T-cellen was 89-93%. Belangrijk is dat endotoxine, mycoplasma, steriliteit, replicatiecompetent lentivirus en resterende leukemische cellen niet detecteerbaar waren. Deze resultaten bevestigen dat het TCT-proces hoogwaardige CAR-T-cellen produceert die voldoen aan de wettelijke normen voor klinisch gebruik.
Voor deze procedure zijn drie flowcytometriepanels ontwikkeld (Figuur 3). Ze omvatten het CD4/CD8-panel om te testen op het percentage CD4+- en CD8+-T-cellen voor en na verrijking, het CD19 CAR-T-panel om te testen op transductie-efficiëntie en het CD3/CD19-panel om de levensvatbaarheid en het gehalte aan resterende leukemische (CD19+) cellen in het eindproduct te bepalen. De resultaten van deze panels bevestigen de succesvolle productie van CAR-T-cellen en de afwezigheid van resterende leukemische cellen in het eindproduct.
Over het algemeen suggereren de resultaten dat het TCT-proces consistente en hoogwaardige CAR-T-celproducten kan produceren die geschikt zijn voor klinisch gebruik.
Figuur 3: Flowcytometrie-assays. De poortstrategie die wordt gebruikt voor flowcytometrie-analyse wordt voor elk paneel weergegeven. Poorten worden getekend als zwarte dozen of ellipsen en gelabeld, en blauwe pijlen geven de richting van de gating aan. (A) CD4/CD8-paneel. B-cellen worden gedefinieerd als de CD19+-subset en T-cellen als de CD3+-subset van de lymfepoort. CD4+ en CD8+ T-cellen zijn subsets van de T-celpoort. (B) CD19 CAR-T-paneel. CAR+ T-cellen worden gedefinieerd als de CD19-CAR+-subset van CD3+ T-cellen. Daarnaast worden CD4+- en CD8+-subsets opgesomd die CD19 CAR+ zijn. (C) CD3/CD19-paneel. Dit paneel is identiek aan het CD4/CD8-paneel, behalve dat de CD4- en CD8-markeringen zijn weggelaten. Afkortingen: SSC-A = side scatter area; lymfe = lymfocyt; CD19-CAR = CD19-specifieke chimere antigeenreceptor; 7AAD = 7-aminoactinomycine D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Rennen # | Uitgangsmateriaal | Vector | Kweek cytokinen | AB Serum % | Definitieve TNC | Totaal aantal geoogste CAR-T-cellen | Totale vouwgroei | Gemiddelde dagelijkse groei | Dag van de Oogst | ||
| 1 | Patiënt T-cellen, aferese, Gecryopreserveerd |
huCART19 zei: | IL2 | 5% | 2,75x109 | 2,24x108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Patiënt T-cellen, aferese, Gecryopreserveerd |
huCART19 zei: | IL2 | 5% | 4,15x109 | 1,14x108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Patiënt T-cellen, aferese, Gecryopreserveerd |
huCART19 zei: | IL2 | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
Tabel 3: Parameters en groeikarakteristieken van drie CAR-T-productieruns op klinische schaal. Details over de kweekomstandigheden, de groei en de oogstdag voor de eerste drie productieruns van patiënten met behulp van de processor voor de klinische proef van NCT05480449 worden getoond. huCART19, gehumaniseerde CD19-gerichte CAR lentivirale vector. Merk op dat de transductie-efficiëntie en levensvatbaarheid voor deze producten worden weergegeven in tabel 4. Afkortingen: CAR-T-cellen = chimere antigeenreceptor-T-cellen; TNC = totaal aantal kerncellen.
| Release testen | ||||||||||
| Test | Levensvatbaarheid van de cel | CD3 % | Endotoxine | Myco-plasma | Transductie Efficiëntie | Resterende leukemische cellen | Steriliteit Dag 14 | Vector DNA-sequentie per cel | Vector-DNA-sequentie per getransduceerde cel | Replicatie Competent Lentivirus |
| Specificatie | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3,5 EU/ml |
Negatief | ≥ 2 % | < 1 % | Geen groei | Resultaat rapporteren | 0.04-8 kopieën/getransduceerde cel |
< 50 kopieën/μg DNA |
| Resultaten | ||||||||||
| Uitvoering 1 | 90 | 89 | <0,4 | Negatief | 36 % | Niet Gedetecteerd |
Nee Groei |
1.04 | 2.89 | Niet Gedetecteerd |
| Uitvoering 2 | 88 | 93 | <0,4 | Negatief | 39 % | Niet Gedetecteerd |
Nee Groei |
1.16 | 2.97 | Niet Gedetecteerd |
| Uitvoering 3 | 94 | 91 | <0,4 | Negatief | 18 % | Niet Gedetecteerd |
Nee Groei |
0.43 | 2.39 | Niet Gedetecteerd |
Tabel 4: Tests van het eindproduct en specificaties voor vrijgave. De specificaties in deze tabel hebben betrekking op de NCT05480449 klinische proef (IND 28617). De levensvatbaarheid na dooi, CD3%, transductie-efficiëntie en het resterende gehalte aan leukemische cellen werden gemeten met behulp van flowcytometrie. Endotoxine werd gemeten met behulp van een door de FDA goedgekeurde chromogene test op basis van limulus-amebocytlysaat. De steriliteitstest werd uitgevoerd met behulp van een USP<71>-conforme methode. Mycoplasma, vector-DNA-sequentienummer per cel en replicatiecompetent lentivirus werden gemeten met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). Het aantal vector-DNA-sequenties per getransduceerde cel werd berekend door het vector-DNA-sequentienummer te delen door de transductie-efficiëntie. Afkortingen: EU = endotoxine-eenheid; IND = nieuw geneesmiddel in onderzoek; FDA = Food and Drug Administration.
Aanvullende figuur S1: Preklinische tests van CAR-T-cellen vervaardigd met behulp van het TCT-proces. Immunodeficiënte (NSG) muizen werden op dag 0 geïnjecteerd met van patiënten afkomstige xenotransplantaatleukemiecellen en vervolgens behandeld met CD19-gerichte CAR-T-cellen vervaardigd op de processor ("Semi-Automatic Manufacturing"), traditioneel vervaardigde CD19-gerichte CAR-T-cellen ("Standard Manufacturing"), of zoutoplossing op dag 7. (A, B) Overleving van muizen die werden behandeld met semi-automatisch producerende CAR-T-cellen bij twee dosisniveaus (0,5 × 10, 6 of 2 × 10,6 CAR-T-cellen) in vergelijking met zoutoplossing (p < 0,0001 voor beide dosisniveaus). (C) Vergelijking van semi-automatische CAR-T-cellen met CAR-T-cellen voor standaardproductie op een dosisniveau waarvan bekend is dat het niet-curatief is voor standaardcellen (0,5 × 10,6 CAR-T-cellen). De overleving was significant beter bij muizen die werden behandeld met CAR-T-cellen uit de processor (p = 0,001). (D) Vergelijking van semi-automatische CAR-T-cellen met CAR-T-cellen voor standaardproductie op een dosisniveau waarvan bekend is dat het curatief is voor standaard CD19 CAR-T-cellen. De overleving was niet significant verschillend (p = 0,4). (E) Vergelijking van CAR-T-cellen van de processor op de twee dosisniveaus. Een significant dosiseffect werd waargenomen met een betere overleving bij muizen die werden behandeld met 2 × 106 huCART19-cellen (p = 0,007). Elke groep bevatte 5 muizen. Afkortingen: NSG = non-obese diabetici severe gecombineerde immunodeficiëntie gamma; TCT = T-cel transductie; CAR-T = chimere antigeenreceptor T-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Vergelijking van groei en lentivirale transductie van menselijke T-cellen gekweekt in medium aangevuld met verschillende partijen humaan AB-serum. (A) Expansie van menselijke T-cellen niet-getransduceerd (UTD) of getransduceerd met CD19 CAR-T lentivirale vector (CAR19) in culturen aangevuld met drie verschillende partijen humaan AB-serum (7J, 22A of 21J). De groeipercentages voor een van de percelen (22A) waren aanzienlijk hoger dan die van de twee andere. (B) Gemiddeld percentage (3 replicaten) van CAR19+-cellen in de CD3+- en CD3+/CD4+- of CD3+/CD8+-subpopulaties van ex vivo-geëxpandeerde T-cellen afkomstig van gezonde donoren. Merk op dat verschillen in groeisnelheid geen invloed leken te hebben op het vermogen van de cellen om lentivirus op te nemen, zoals bepaald door flowcytometrische analyse van de cellen uit de geëxpandeerde culturen. De transductie-efficiëntie van T-cellen en CD4+- en CD8+-subpopulaties was consistent van kweek tot kweek. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties van 3 herhalingsculturen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-celtherapie is naar voren gekomen als een veelbelovende behandelingsbenadering voor B-cel en andere maligniteiten. Traditionele productiemethoden voor CAR-T-cellen hebben echter verschillende beperkingen, zoals hoge kosten, arbeidsintensieve productie en open stappen die het risico op besmetting vergroten. Onlangs zijn er verschillende semi-geautomatiseerde platforms, waaronder de Miltenyi CliniMACS Prodigy (de "processor"), ontstaan om deze beperkingen aan te pakken. Het T-celtransductieproces (TCT), geïntegreerd in de processor die in dit manuscript wordt beschreven, omvat T-celverrijking, activering, virale transductie, kweekexpansie en oogst in een gesloten systeem. Concurrerende geautomatiseerde celprocessorplatforms worden op dit moment minder veel gebruikt, maar hebben mogelijk een betere bewaking van kweekparameters tijdens het proces, gunstige apparatuur- of materiaalkosten, of een kleinere voetafdruk, waardoor gebruik in een bioveiligheidskast mogelijk is in plaats van in een speciale cleanroomruimte. Het is belangrijk om een platform te kiezen dat optimaal geschikt is voor een bepaalde toepassing en omgeving.
Een belangrijke beperking van cel- en gentherapieën zoals CAR-T-celtherapie zijn de hoge kosten van commerciële producten, die de toegang tot levensreddende therapie beperken. Dit is met name het geval in omgevingen met weinig middelen en niet-eerstewereldlanden. We hebben ontdekt dat het mogelijk is om CAR-T-cellen te produceren tegen aanzienlijk lagere kosten dan een vergelijkbaar commercieel product wanneer een semi-geautomatiseerd proces wordt geïmplementeerd in de omgeving van een academisch ziekenhuis met bestaande huidige Good Manufacturing Practice (cGMP)-conforme cleanroomfaciliteiten in de context van een stamcellaboratorium en de ondersteuning van een klinisch laboratorium dat een deel van de in-process en release-tests kan uitvoeren. Onder deze omstandigheden vinden we dat de marginale kosten voor het uitvoeren van een productierun, inclusief materialen en arbeid voor productie en alle in-process en release-tests (maar exclusief apparatuur en faciliteiten) ongeveer $ 30.000 bedragen. Opgemerkt moet worden dat de kapitaalkosten van de apparatuur van de processor lager zijn dan de kosten van een enkel commercieel CAR-T-celproduct.
Een van de mogelijke problemen bij het overschakelen van een handmatige naar een geautomatiseerde methode is verminderde flexibiliteit. Het TCT-proces, hoewel geprogrammeerd met sterke vangrails, is nog steeds uitgebreid aanpasbaar. Het proces biedt meerdere aanknopingspunten, waaronder een volledig proces met T-celverrijking, een volledig proces zonder verrijking (bijv. voor gebruik met CD4+/CD8+ voorverrijkte cellen, zie sectie 5 van het protocol hierboven), en een hervatting van een afgebroken proces. Bovendien maakt de Activity Matrix-functie het mogelijk om het hele teeltproces aan te passen. Met de groeiende belangstelling voor snelle CAR-T-productie, moet worden opgemerkt dat het mogelijk is om de Activity Matrix te configureren om desgewenst al een paar uur na de transductie met de oogst te beginnen. De snelle procedure heeft het potentiële dubbele voordeel van een kortere productietijd en een krachtiger product door differentiatie en verlies van antileukemische activiteit tevoorkomen12. Bovendien is een variant van de TCT ontworpen voor niet-virale vectoren door gebruik te maken van elektroporatie, wat de flexibiliteit van het systeem verder vergroot.
De optimale oogsttijd voor CAR-T-cellen hangt af van verschillende factoren, waaronder de gewenste doeldosis, het aantal benodigde doses en de maximale celdichtheid die het kweekvat kan ondersteunen zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen. De fabrikant beveelt aan om niet meer dan 5 miljard cellen in een volume van 250 ml te gebruiken. Het bepalen van de gewenste streefdosis moet gebaseerd zijn op preklinische gegevens in een diermodel. In deze studie gebruikten we bijvoorbeeld NOD scid gamma knock-out (NSG) muizen geïnjecteerd met van patiënten afgeleide leukemische xenotransplantaten en behandeld met CAR-T-cellen om te schatten dat een effectieve dosis ongeveer tussen de 2 en 5 miljoen CAR-T-cellen per kilogram zou zijn (aanvullende figuur S1). Het monitoren van de celgrootte kan ook nuttig zijn bij het bepalen van het optimale tijdstip voor het oogsten van CAR-T-cellen. Door deze factoren zorgvuldig in overweging te nemen, kunnen onderzoekers de oogsttijd van CAR-T-cellen optimaliseren om ervoor te zorgen dat het eindproduct van hoge kwaliteit en werkzaamheid is.
Het ontwikkelen van een geschikt testplan voor vrijgave is een cruciaal onderdeel van het verkrijgen van goedkeuring voor een IND-aanvraag. We presenteren een reeks vrijgavetests inclusief specificaties voor onze IND 28617, en we denken dat dit een goed startpunt zal zijn voor vergelijkbare producten. De adviezen van de regelgevers evolueren echter voortdurend, en variaties van het gepresenteerde protocol kunnen ertoe leiden dat regelgevers andere tests of verschillende specificatiedrempels vereisen. We raden u ten zeerste aan de huidige regelgevingsrichtlijnen aandachtig te lezen, zoals de FDA's Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)13. Een algemeen principe is dat tests die de veiligheid van een product aantonen, strenger worden geëvalueerd dan tests die de werkzaamheid aantonen. Over het algemeen moeten tests zoals steriliteit, endotoxine, mycoplasma en replicatiecompetent lentivirus worden gevalideerd en moeten hun prestatiecriteria bekend zijn. Daarentegen worden potentietests relatief minder benadrukt in onderzoeken in de vroege fase en hoeven ze mogelijk niet volledig te worden gevalideerd. Een recente ontwerprichtlijn van de FDA stelt dat "transgenexpressie alleen als maatstaf voor potentie voldoende kan zijn om IND-studies in een vroege fase te ondersteunen"14. Bovendien moeten tests die worden gebruikt voor de bepaling van de dosis worden gevalideerd. Dit kan problematisch zijn voor nieuwe CAR-doelen waarvoor mogelijk geen gestandaardiseerde stromingsassays of referentiematerialen bestaan. Voor dit geval suggereert de FDA dat "het referentiemateriaal voor een test een goed gekarakteriseerd lot van het gentherapieproduct zelf kan zijn." 13 We hebben bijvoorbeeld een positieve controle vastgesteld voor de CD19 CAR-flowtest met behulp van CAR-T-cellen uit vroege engineeringruns.
Het ontwikkelen en optimaliseren van het productieproces voor CAR-T-celtherapie kan uitdagend en tijdrovend zijn, zoals we in ons werk hebben ervaren. We hebben verschillende tegenslagen ondervonden, waaronder problemen met bacteriële besmetting. We zijn sterk voorstander van het gebruik van een droge dooimethode voor het ontdooien van cellen, omdat waterbaden het risico op besmetting kunnen vergroten. Door de teelt kan zelfs een klein entmateriaal leiden tot een duidelijke besmetting, met een onbruikbaar product tot gevolg. Daarnaast raden we aan om logistiek te plannen voor het testen van releases, wat extra validaties en contracten met externe partijen kan inhouden om tijdige en nauwkeurige tests te garanderen. Een ander belangrijk element bij het ontwikkelen van een CAR-T-productieproces is het optimaliseren van de transductie-efficiëntie. Een IND-aanvraag moet gegevens bevatten om de potentie van de virale vector aan te tonen. Om aan deze eis te voldoen en tegelijkertijd informatie te verkrijgen om het MOI te optimaliseren, raden we ten zeerste aan om een kleinschalige titratie van de virale vector van klinische kwaliteit uit te voeren op menselijke T-cellen. Het is ook belangrijk om het gebruik van traditioneel vervaardigde CAR-T-cellen te overwegen als controle voor muizenexperimenten (zoals weergegeven in aanvullende figuur S1). Het verkrijgen van deze cellen kan moeilijk zijn en vereist een zorgvuldige planning. Een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden, is het gebruik van humaan AB-serum, een slecht gedefinieerd reagens dat een aanzienlijk effect kan hebben op de celgroei en andere kenmerken van het product. Om dit aan te pakken, raden we aan om meerdere partijen AB-serum te testen en kleinschalige experimenten uit te voeren om partijspecifieke effecten op celgroei te beoordelen (aanvullende figuur S2). Zodra een geschikte partij is geïdentificeerd, moet een voldoende groot volume worden gekocht om consistentie in het onderzoekscohort te garanderen en het risico op batcheffecten in patiëntuitkomsten te minimaliseren die het gevolg zijn van veranderingen in de serumpartij.
Samenvattend bieden de processor en het meegeleverde TCT-proces een productiemethode die verschillende beperkingen van de huidige CAR-T-productieprocedures kan aanpakken, waaronder hoge kosten, arbeidsintensieve productie en open manipulatiestappen. Door een gesloten en semi-geautomatiseerd systeem aan te bieden, heeft deze processor het potentieel om de beschikbaarheid en betaalbaarheid van CAR-T-celtherapie te verbeteren. Het is geschikt voor snelle productie en niet-virale vectoren, waardoor het een flexibel alternatief is voor traditionele productiemethoden. Door zorgvuldig rekening te houden met factoren zoals de gewenste doeldosis, maximale celdichtheid en de effecten van humaan AB-serum op celgroei, kunnen onderzoekers de oogsttijd van CAR-T-cellen optimaliseren om de kwaliteit en werkzaamheid van het eindproduct te waarborgen. Hoewel het proces complex en arbeidsintensief kan zijn, kan het plannen van logistiek voor het testen van vrijgave en het elimineren van bronnen van verontreiniging helpen om risico's te beperken en een succesvolle productie van CAR-T-cellen te garanderen. Over het algemeen biedt het TCT-proces een veelbelovende weg voor CAR-T-celtherapie, met het potentieel om de huidige beperkingen te overwinnen en de toegankelijkheid voor de patiënt te verbeteren, wat uiteindelijk ten goede komt aan patiënten met kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.K., S.G. en Y.W. hebben onderzoekssteun ontvangen van Miltenyi Biotec.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de bijdragen van verschillende individuen en organisaties aan dit werk erkennen. Het Cell and Gene Therapy Laboratory en het Penn Translational and Correlative Studies Laboratory hebben waardevolle hulp geboden bij de procesontwikkeling en voorbereiding op IND-indieningen. Melissa Varghese en Amanda DiNofia hebben bijgedragen aan de procesontwikkeling en voorbereiding van IND-inzendingen die ten grondslag liggen aan dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Acceleration Grant van de Cell and Gene Therapy Collaborative van het Children's Hospital of Philadelphia. De auteurs willen ook Miltenyi Biotec bedanken voor hun technische en onderzoeksondersteuning. Figuur 1 valt onder copyright © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Alle rechten voorbehouden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217 (2016).
- Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
- Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).
- Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
- Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
