Summary
Cet article détaille le processus de fabrication des lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques à usage clinique, en particulier à l’aide d’un processeur cellulaire automatisé capable d’effectuer la transduction virale et la culture de lymphocytes T. Nous formulons des recommandations et décrivons les pièges à éviter qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration du processus et de la mise en œuvre d’un essai clinique de phase précoce.
Abstract
Les cellules T à récepteurs antigéniques chimériques (CAR)-T représentent une approche immunothérapeutique prometteuse pour le traitement de diverses maladies malignes et non malignes. Les cellules CAR-T sont des cellules T génétiquement modifiées qui expriment une protéine chimérique qui reconnaît et se lie à une cible de surface cellulaire, entraînant la destruction de la cellule cible. Les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, coûteuses et peuvent comporter un risque de contamination. Le CliniMACS Prodigy, un processeur cellulaire automatisé, permet de fabriquer des produits de thérapie cellulaire à l’échelle clinique dans un système fermé, minimisant ainsi le risque de contamination. Le traitement s’effectue de manière semi-automatique sous le contrôle d’un ordinateur et minimise ainsi l’implication humaine dans le processus, ce qui permet de gagner du temps et de réduire la variabilité et les erreurs.
Ce manuscrit et cette vidéo décrivent le processus de transduction des cellules T (TCT) pour la fabrication de cellules CAR-T à l’aide de ce processeur. Le processus TCT implique l’enrichissement des lymphocytes T CD4+/CD8+, l’activation, la transduction avec un vecteur viral, l’expansion et la récolte. À l’aide de la matrice d’activité, une fonctionnalité qui permet d’ordonner et de chronométrer ces étapes, le processus TCT peut être largement personnalisé. Nous fournissons une présentation de la fabrication des cellules CAR-T conformément aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) actuelles et discutons des tests de libération requis et des expériences précliniques qui soutiendront une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Nous démontrons la faisabilité et discutons des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un processus semi-automatique pour la fabrication clinique de cellules CAR-T. Enfin, nous décrivons un essai clinique en cours initié par un chercheur qui cible les tumeurs malignes à cellules B pédiatriques [NCT05480449] comme un exemple de la façon dont ce processus de fabrication peut être appliqué dans un cadre clinique.
Introduction
Le transfert adoptif de lymphocytes T modifiés pour exprimer un récepteur antigénique chimérique (CAR) a montré une efficacité remarquable dans le traitement des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B réfractaires 1,2,3,4,5. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, prennent beaucoup de temps et nécessitent des techniciens hautement qualifiés pour effectuer des étapes hautement spécialisées. Par exemple, le processus de fabrication traditionnel d’un produit cellulaire CAR-T autologue implique la centrifugation par gradient de densité, l’élutriation ou la séparation magnétique pour enrichir les lymphocytes T, l’activation et la transduction avec un vecteur viral dans un flacon stérile, et l’expansion dans un bioréacteur avant la récolte et la formulation. Divers systèmes ont vu le jour récemment dans le but d’automatiser partiellement ce processus. Par exemple, le Miltenyi CliniMACS Prodigy (ci-après dénommé le « processeur ») est un dispositif de traitement cellulaire automatisé qui peut effectuer un grand nombre de ces étapes de manière automatisée 6,7,8,9. Une discussion approfondie des méthodes de fabrication CAR-T traditionnelles et automatisées est présentée dans un récent article de synthèse10.
Le processeur s’appuie sur les fonctionnalités du CliniMACS Plus, un dispositif médical approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le traitement des cellules progénitrices hématopoïétiques. Le processeur comprend une unité de culture cellulaire qui permet le lavage, le fractionnement et la culture automatisés des cellules (Figure 1). Le processus de transduction des cellules T (TCT) est un programme prédéfini dans le dispositif du processeur qui reproduit en grande partie la fabrication manuelle des cellules CAR-T. TCT permet un traitement personnalisable des cellules à l’aide d’une interface utilisateur graphique (la « matrice d’activité », Figure 2). Étant donné que le processeur automatise de nombreuses étapes et consolide les fonctionnalités de plusieurs appareils en une seule machine, il nécessite moins de formation et de compétences de dépannage spécialisées de la part des technologues. Étant donné que toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’un ensemble de tubes fermés à usage unique, le processeur peut être utilisé dans des installations dotées d’une infrastructure de traitement de l’air moins stricte que celle qui serait considérée comme acceptable pour un processus de fabrication ouvert. Par exemple, nous exploitons le transformateur dans une installation certifiée ISO classe 8 (comparable à la classe C de l’UE).
Figure 1 : Fabrication de cellules CAR-T à l’aide du système de transduction des cellules T. L’illustration montre le processeur avec le jeu de tubes installé. L’ensemble de tubes permet de connecter d’autres composants tels que des sacs contenant un tampon de traitement, un milieu de culture et un vecteur lentiviral par soudage stérile. Une fois que le produit de leucaphérèse est ajouté au sac d’application, il peut être étiqueté avec des billes de sélection de lymphocytes T, passé à travers la colonne de séparation, puis transféré dans le sac de réapplication. Les cellules sélectionnées sont ensuite dirigées vers l’unité de culture de l’instrument pour la culture et activées avec le réactif d’activation (voir le tableau des matériaux). Le produit final est collecté dans le sac de cellules cibles. Tout au long du processus, il est possible de prélever des échantillons pour le contrôle de la qualité de manière aseptique. Les chiffres gris à l’intérieur des cercles représentent les vannes numérotées du processeur qui dirigent le chemin du liquide à travers le jeu de tubes. Reproduit avec la permission de 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Matrice d’activité. Après la sélection et l’activation des cellules T, le reste du processus de fabrication des cellules CAR-T est entièrement personnalisable. Les activités peuvent être ajoutées ou supprimées et programmées pour le jour et l’heure appropriés, et le volume de culture après l’activité peut être spécifié (Volume). Par exemple, l’activité de transduction a été configurée pour commencer à 10h00 le jour 1 et le volume de culture à la fin de l’activité a été défini sur 100 ml. La matrice d’activité peut être modifiée tout au long de la période de culture. L’état du processus peut être surveillé sur l’écran intégré de l’appareil de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’objectif de ce manuscrit est de fournir un aperçu détaillé de la fabrication des cellules CAR-T à l’aide du processeur et de fournir des conseils sur les tests en cours de fabrication et de libération du produit qui seront probablement requis par les organismes de réglementation pour approuver une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Le protocole présenté reste proche de l’approche recommandée par le fournisseur et constitue le protocole sous-jacent de l’IND 28617, qui est actuellement en cours d’évaluation dans le cadre d’un essai clinique de phase I/II initié par un investigateur monocentrique. Cet essai vise à déterminer l’innocuité et l’efficacité de l’utilisation de ce processeur pour fabriquer des cellules CAR-T autologues humanisées dirigées contre CD19 pour les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B (LAL B) ou de lymphome lymphoblastique de lignée B (B-LLY) [NCT05480449]. L’essai a débuté en septembre 2022 et devrait recruter jusqu’à 89 patients âgés de 0 à 29 ans atteints de B-ALL ou de B-Lly. Nous rapportons quelques résultats de fabrication de l’essai dans le manuscrit.
Nous tenons à souligner que, bien que le manuscrit soit présenté comme un protocole avec des étapes à suivre, il devrait être considéré comme un point de départ pour que d’autres commencent à optimiser leur propre processus de fabrication de cellules CAR-T. Une liste non exhaustive des variations possibles du protocole présenté comprend : l’utilisation de lymphocytes T frais au lieu de lymphocytes T cryoconservés comme matériau de départ ; l’utilisation d’une méthode différente d’enrichissement des lymphocytes T ou son omission totale ; l’utilisation de différents milieux et cocktails de cytokines tels que l’IL7/IL15 au lieu de l’IL2 ; faire varier la concentration de sérum AB humain ou l’omettre complètement ; le moment de la transduction ; l’utilisation de transductions « multi-hits » ; variation de l’agitation, des volumes de culture et du calendrier d’alimentation ; l’utilisation de différentes méthodes de transfert génétique, y compris l’électroporation d’acides nucléiques ou de vecteurs non lentiviraux ; l’utilisation d’un tampon de formulation finale et/ou d’un cryoprotecteur différent ; et l’infusion de cellules CAR-T fraîches au lieu d’être cryoconservées pour une perfusion ultérieure. Ces variations peuvent avoir un impact significatif sur la composition cellulaire et la puissance du produit thérapeutique.
| Étape globale du processus | Journée du processus | Détails techniques | |||
| Enrichissement cellulaire | Jour 0 | Sélection des lymphocytes T CD4+/CD8+ | |||
| Activation cellulaire | Ensemencement et activation de la culture des lymphocytes T | ||||
| Transduction cellulaire | Jour 1 | Transduction lentivirale (volume de culture de 100 ml) | |||
| Expansion cellulaire (suivie de la formulation cellulaire) | Jour 2 | -- | |||
| Jour 3 | Lavage de culture (1 cycle) ; Agitateur activé ; Le volume de culture augmente jusqu’à 200 mL | ||||
| Jour 4 | -- | ||||
| Jour 5 | Aliment (50 ml) ; Le volume de culture atteint le volume final de 250 mL | ||||
| Jour 6 | Échantillon en cours de fabrication ; Échange de médias (-125 mL / +125 mL) | ||||
| Jour 7 | Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 8 | Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 9 | Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 10 | Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 11 | Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 12 | Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest | ||||
| Jour 13 | Récolter | ||||
Tableau 1 : Chronologie et aperçu du processus. Ce tableau résume les étapes du processus TCT utilisées dans un essai clinique en cours [NCT05480449]. Le processus commence par l’enrichissement des lymphocytes T par la sélection des CD4+/CD8+, l’ensemencement de la culture et l’activation le jour 0, suivi de la transduction le jour 1. Les cellules se reposent pendant 48 h, suivies d’un lavage de culture, d’une augmentation du volume de culture à 200 ml et d’une agitation à l’aide d’un mécanisme d’agitation. Le jour 6, le premier échantillon en cours de fabrication est prélevé. Les cellules sont prélevées une fois qu’il y a suffisamment de cellules disponibles pour au moins trois doses complètes de cellules CAR-T (5 × 10 6 cellules CAR-T/kg si le patient pèse <50 kg, sinon 2,5 × 108 cellules CAR-T) et des tests de contrôle de la qualité (~2 × 106 cellules CAR-T) ; ou une fois que la culture atteint un total de 4-5 x 109 cellules. Abréviations : TCT = transduction des lymphocytes T ; CAR-T = lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique ; MACS = tri cellulaire activé par magnétisme.
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Protocol
Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives de l’établissement avec l’approbation de l’Institutional Review Board (IRB) de l’hôpital, et tous les sujets ont donné leur consentement éclairé à la publication des données recueillies dans le cadre de l’essai.
REMARQUE : La première section du protocole donne un aperçu général du processus de fabrication des CAR-T. Les sections restantes fournissent les instructions étape par étape. Le protocole décrit le flux de travail à l’aide de la version 1.4 du logiciel TCT, qui est la version actuelle au moment de la rédaction de cet article. L’interface utilisateur des autres versions du logiciel TCT peut varier.
1. Échéancier et aperçu du processus (tableau 1)
- Préparez-vous à la procédure un lundi (jour -1) avec des vérifications avant le vol. Assurez-vous que le processeur et les autres équipements fonctionnent comme prévu et que tous les réactifs et consommables sont disponibles et à jour pour l’ensemble du cycle de fabrication.
- Le jour 0, installez le jeu de tubes sur la machine. Décongelez les lymphocytes T préalablement cryoconservés dans un bain sec et connectez-les par soudure stérile à l’ensemble de tubes installé sur l’instrument.
REMARQUE : Ce protocole suppose que les lymphocytes T autologues ont été prélevés par aphérèse, cryoconservés et stockés jusqu’au début de la fabrication. Bien qu’il soit possible d’utiliser des lymphocytes T fraîchement prélevés, cela augmente la charge logistique car il faut coordonner le prélèvement d’aphérèse avec la fabrication des lymphocytes CAR-T. Nous recommandons fortement d’utiliser un procédé de décongélation à sec plutôt qu’un bain-marie afin de minimiser le risque de contamination bactérienne. - Étiqueter les lymphocytes T avec des réactifs CD4 et CD8 (voir Tableau des matériaux) et les enrichir par sélection magnétique.
REMARQUE : Il est possible d’omettre l’enrichissement des lymphocytes T ou de l’effectuer avant de charger les cellules sur le processeur. Voir la section 5 du Protocole. - Après l’enrichissement des cellules CD4+/CD8+, prélever un échantillon pour la numération cellulaire. Ensemencer la culture avec 1-2 × 108 cellules dans un volume initial de 70 mL de milieu (voir le tableau des matériaux) complété par 5 % de sérum AB humain et d’IL2 humaine recombinante (25 ng/mL).
- Ajouter un flacon de réactif d’activation (une nanomatrice polymère colloïdale conjuguée à des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 ; voir le tableau des matériaux) pour activer les lymphocytes T et incuber la culture sans agitation pendant 24 h à 37 ºC dans une atmosphère à 5 % de CO2 . Cryoconservez les cellules CD4+/CD8+ restantes comme solution de secours, si vous le souhaitez.
REMARQUE : En cas d’échec de fabrication, les cellules sélectionnées CD4+/CD8+ restantes peuvent être utilisées comme matière première. Si la défaillance est purement technique, telle qu’une contamination ou une erreur de l’opérateur, et qu’il reste suffisamment de cellules, il peut être envisagé d’utiliser des cellules restantes pour effectuer un cycle de fabrication supplémentaire. Si la qualité du matériel de départ est préoccupante, une nouvelle procédure d’aphérèse pourrait être justifiée ; Cependant, il s’agit en fin de compte d’une décision clinique. Dans un cas comme dans l’autre, une défaillance de fabrication est un événement important qui doit faire l’objet d’une enquête, et le promoteur et éventuellement les organismes de réglementation doivent en être informés. - Après 24 h d’activation, transduisez les lymphocytes T avec un vecteur lentiviral à une multiplicité d’infection (MOI) appropriée.
REMARQUE : Il est essentiel de déterminer le titre du vecteur lentiviral et d’établir une MMŒ appropriée avant de commencer à fabriquer des produits cliniques. Le titre du vecteur doit être déterminé en effectuant une expérience à petite échelle dans laquelle les lymphocytes T primaires humains sont transduits à différentes concentrations du vecteur. Les éléments à prendre en compte pour le moment d’inertie approprié comprennent le coût du vecteur, l’efficacité de transduction souhaitée et un nombre de copies de vecteur acceptable. Ce protocole utilise un moment d’inertie de 30 à 50 % afin de minimiser le coût du vecteur et de maintenir le nombre moyen de copies vectorielles en dessous de 8 copies par cellule transduite. - Le jour 3, déclenchez l’activité Culture Wash et commencez l’agitation de faible niveau. Augmenter le volume de culture à 200 ml.
- Le jour 5, ajoutez 50 mL de milieu à la culture, en augmentant le volume de culture à 250 mL.
- Au jour 6 de la culture, prélevez un échantillon de la culture et dénombrez les cellules CAR-T par cytométrie en flux. Utilisez cette mesure pour estimer la vitesse de croissance de la culture et identifier le moment optimal de la récolte.
REMARQUE : Chaque échantillon en cours de fabrication donne 3 mL pour l’analyse et élimine 7 mL de volume total de culture. - Du jour 7 au jour 13, si la culture n’a pas été terminée, prélever jusqu’à deux échantillons supplémentaires en cours de fabrication un jour sur deux et effectuer des échanges quotidiens avec les milieux pour alimenter la culture en croissance. Récoltez le produit lorsque le nombre total de cellules nucléées (TNC) atteint 5 × 109 et/ou lorsqu’il y a suffisamment de cellules disponibles pour le nombre requis de doses et d’essais de libération.
- Le jour de la récolte, prélevez un échantillon en cours de fabrication de la culture en pleine croissance. Utilisez cet échantillon pour les tests de mycoplasmes, d’endotoxines, de lentivirus compétents pour la réplication (RCL), les tests de nombre de copies vectorielles (VCN), la numération cellulaire, l’analyse de la taille des cellules, la cytométrie en flux et la coloration de Gram.
- Lancer le programme de récolte finale, qui déclenche l’élimination du milieu de culture et un lavage cellulaire avec le tampon de formulation finale (une solution cristalloïde isotonique stérile complétée par de l’albumine sérique humaine à 4 % ; voir le tableau des matériaux). Une fois la récolte terminée, le sac de cellules cible contiendra 100 mL de produit cellulaire dans le tampon de formulation finale. Ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 10 % (v/v), aliquoter le produit en doses individuelles et cryoconserver à l’aide d’un congélateur à débit contrôlé.
2. Jour -1 : Préparation et vérifications en amont
- Vérifiez que les niveaux de gaz CO2 et d’air comprimé sont suffisants pour produire une pression d’entrée d’au moins 20 psi sur chaque conduite.
- Allumez le processeur et vérifiez qu’il n’y a pas d’erreur au démarrage. Si nécessaire, réglez l’horloge à l’heure correcte. Arrêtez le processeur.
- Assurez-vous que le nombre de cellules, le volume et le compte de CD4+ total et de CD8+ total du matériel de départ des lymphocytes T sont connus.
- Assurez-vous qu’il y a des quantités suffisantes de vecteur viral, de réactifs et de consommables pour l’ensemble du cycle de fabrication.
- Placez une bouteille de sérum AB humain au réfrigérateur pour la décongeler pendant la nuit.
3. Jour 0 : Installation de l’ensemble de tubes
- Préparer 3 L de tampon de traitement (0,5 % (p/v) d’albumine sérique humaine (HSA) dans un tampon salin tamponné au phosphate / acide éthylènediaminetétraacétique (PBS/EDTA)).
- Préparer 2 L de milieu de culture (2 L de milieu additionné de 100 mL de sérum AB humain jusqu’à une concentration finale de 5 % et deux flacons d’IL2 humaine recombinante à 25 μg/flacon ; voir le tableau des matériaux pour plus d’informations sur ces réactifs). Transférer 10 mL de milieu de culture dans un sac de réactif de 20 mL et conserver à 4 ºC pendant la nuit.
- Allumez l’instrument et sélectionnez le processus de transduction des lymphocytes T (TCT) à partir de l’interface à écran tactile. Cliquez sur Exécuter pour lancer le processus TCT ; Laissez l’instrument guider l’utilisateur tout au long de la procédure à l’aide d’instructions et d’invites à l’écran.
- Sur l’écran Entrée des paramètres , entrez les initiales de l’opérateur, le numéro de lot de l’ensemble de tubes et sa date d’expiration lorsque vous y êtes invité.
- L’écran Configuration du processus présente quatre processus différents. Choisissez Processus complet (1)).
NOTA : D’autres procédés sont disponibles, notamment le démarrage à partir de lymphocytes T CD4+/CD8+ sélectionnés (voir la section 5 ci-dessous) et le redémarrage d’un cycle de fabrication précédemment interrompu. - Lorsque vous y êtes invité, choisissez deux flacons de réactif de sélection pour refléter la méthode de sélection CD4+/CD8+.
- Installez l’ensemble de tubes en suivant les instructions à l’écran. Assurez-vous que toutes les connexions Luer sont bien serrées et qu’il n’y a pas de défauts dans le jeu de tuyaux.
- Suivez les instructions à l’écran pour lancer les tests d’intégrité supérieurs et inférieurs automatisés.
REMARQUE : Un test d’intégrité peut échouer en raison d’un jeu de tubes défectueux, d’un jeu de tubes mal installé ou d’un défaut de la pompe péristaltique de la machine. Nous vous recommandons fortement d’avoir au moins un jeu de tubes supplémentaires à portée de main pour les cycles de production. Nous recommandons également qu’un deuxième technologue vérifie l’installation correcte de l’ensemble de tuyaux. - Suivez les instructions à l’écran pour fixer le milieu et traiter les sacs tampons.
- Commencez l’amorçage automatique de l’ensemble de tubes.
REMARQUE : Le processus TCT doit se poursuivre dans les 3 heures suivant l’amorçage. Assurez-vous que le matériel de départ des lymphocytes T sera prêt.
4. Enrichissement des lymphocytes T
- Lorsque l’écran Transfer cell product (Transférer le produit de la cellule de transfert) s’affiche, commencez à décongeler le produit de la cellule T cryoconservée.
REMARQUE : Le volume acceptable de lymphocytes T pouvant être ajoutés à l’ensemble de tubulures varie de 50 à 280 ml. Le nombre maximal de cellules cibles (somme des CD4+ et des CD8+) est de 3 × 109, et le nombre maximal de TNC est de 2 × 1010. - Transférer les cellules décongelées dans un sac de transfert de 150 ml. Soudure stérile du sac de transfert au sac d’application de l’ensemble de tubes.
- Prélevez un échantillon du sac d’application à l’aide de la pochette de contrôle qualité et effectuez une numération cellulaire.
- Raccordez les flacons de réactifs CD4 et CD8.
- Lancez le processus de sélection (enrichissement des lymphocytes T).
- Après l’enrichissement, prélever un échantillon des cellules sélectionnées CD4+/CD8+ de la pochette de contrôle qualité du sac de réapplication pour la numération cellulaire, la cytométrie en flux et l’analyse de la taille des cellules.
REMARQUE : Le résultat du comptage des cellules est nécessaire pour passer à l’étape suivante.
5. Alternative : Commencer avec les cellules sélectionnées CD4+/CD8+
- Préparez le support comme décrit à l’étape 3.2. Aucun tampon de traitement n’est nécessaire.
- Allumez le processeur et sélectionnez Culture de lymphocytes T avec installation TS (3) sur l’écran Configuration du processus . Suivez les instructions et les invites à l’écran.
- En suivant les instructions à l’écran, amorcez l’ensemble de tubes avec du milieu au lieu du tampon de traitement.
- Lorsque l’écran « Préparer le produit cellulaire de culture-Connect » s’affiche, commencez à décongeler les lymphocytes T CD4+/CD8+ sélectionnés.
NOTA : Le nombre minimal de lymphocytes T (somme des lymphocytes T CD4+ et CD8+) pour le processus est de 1,0 × 108. - Transférer les cellules dans un sac de transfert de 150 mL et diluer avec un moyen jusqu’à un volume final de 50 mL.
- Souder stérilement la suspension cellulaire au sac de réapplication de l’instrument.
- Prélever un échantillon des cellules sélectionnées pour CD4+/CD8+ de la pochette de contrôle qualité du sac de réapplication pour l’analyse de la numération et de la taille des cellules.
6. Mise en place de la culture et programmation de la matrice d’activité
- Entrez la concentration cellulaire et le nombre de départ souhaité (1-2 × 10,8 lymphocytes T).
REMARQUE : L’instrument pompera automatiquement le volume approprié du sac de réapplication dans la chambre de culture et ajustera le volume final à 70 ml. - Fixez un flacon de réactif d’activation conformément aux instructions à l’écran.
- Entrez 5 % pour la concentration de CO2 et 39 °C pour la température de la chambre de culture.
REMARQUE : Le fabricant recommande d’entrer 39 °C ou une valeur spécifiquement calibrée pour l’instrument. - Configurez la matrice d’activité. Utilisez le protocole d’alimentation amélioré comme point de départ et modifiez les étapes individuelles du protocole en fonction des spécifications définies par l’utilisateur (Figure 2).
- S’assurer que l’heure de l’activité de transduction est de 24 h après l’ensemencement (jour 1).
- Assurez-vous que l’heure de l’activité de lavage de culture est 48 h après la transduction (jour 3).
- Réglez le temps d’activation de l’agitateur ( agitateur de type 2) sur 30 min après le début du lavage de culture.
- Supprimez toutes les activités d’échange de sacs moyens et d’échange de sacs poubelles .
- Appuyez sur OK sur l’écran pour commencer la culture.
- Cryoconservez les cellules sélectionnées CD4+/CD8+ restantes dans le sac d’application pour une utilisation ultérieure, au besoin.
7. Jour 1 : Transduction des lymphocytes T
- Calculez le volume du vecteur lentiviral à utiliser en fonction de la MMŒ souhaitée.
- Récupérez le sachet de réactif de 20 mL contenant 10 mL de milieu de culture qui a été conservé à 4 ºC pendant la nuit (étape 3.2). Décongeler le flacon vectoriel et transférer le volume calculé en 7.1 dans la poche de réactif de 20 mL.
REMARQUE : Nous recommandons de congeler tout vecteur restant pour la conservation ou pour la recherche et le développement. - Modifiez la matrice d’activité pour définir le temps de transduction à 2 min dans le futur. Lorsque vous y êtes invité, appuyez sur OK pour démarrer l’activité Transduction.
- Soudez de manière stérile le sac vectoriel à l’ensemble de tubes en suivant les instructions à l’écran.
- Modifiez la matrice d’activité en fonction de l’heure à laquelle l’activité de transduction a été démarrée.
REMARQUE : Nous suggérons de commencer la transduction dans les 20 à 24 heures suivant l’ensemencement pour vous assurer que les activités pratiques sont effectuées pendant les heures de travail normales.- Assurez-vous que l’heure du lavage de culture est de 48 h après la transduction (jour 3).
- Réglez l’heure d’activation de l’agitateur ( agitateur de type 2) sur 30 min après le lavage de culture (jour 3).
- Assurez-vous que l’heure de l’échange avec les médias est dans l’après-midi (13 h) du jour 6.
8. Jour 6 : Premier échantillon en cours de fabrication
- Appuyez sur le bouton Échantillon et suivez les instructions à l’écran pour obtenir un échantillon de contrôle qualité à partir de la culture active.
- Effectuez des analyses de numération cellulaire, de cytométrie en flux et de taille cellulaire. Envoyez 1 mL de l’échantillon pour une coloration de Gram.
REMARQUE : La numération cellulaire doit être répétée environ tous les deux jours pour surveiller la croissance de la culture. - Préparez encore 2 L de milieu de culture (voir étape 3.2).
- Ajoutez une activité d’échange de sac moyen à la matrice d’activité, programmée pour commencer 2 minutes dans le futur. Ajustez l’activité Media Exchange pour qu’elle démarre 20 minutes dans le futur. Suivez les instructions à l’écran.
REMARQUE : L’échange de milieux est le remplacement du milieu de culture dans la chambre de culture. L’échange de sacs de milieu est le remplacement du sac de milieu de culture accroché à l’instrument.
9. Jour de récolte (entre le 7e et le 13e jour) : Récolte et cryoconservation
- Appuyez sur le bouton Échantillon et suivez les instructions à l’écran pour obtenir un échantillon de contrôle qualité à partir de la culture active.
- Séparez l’échantillon de CQ en trois aliquotes de 1 ml chacune. Utilisez 1 mL pour la cytométrie en flux, la numération cellulaire et les analyses de taille cellulaire. Utiliser 1 mL pour les mycoplasmes, le nombre de copies du vecteur, le lentivirus compétent pour la réplication et les endotoxines. Envoyez le dernier 1 mL pour la coloration de Gram.
- Préparer le tampon de formulation finale (une solution cristalloïde isotonique stérile complétée par 4 % d’AHS dans un sac de 2 L, voir le tableau des matériaux). Conservez 100 mL de ce tampon pour préparer la solution cryoprotectrice à une étape ultérieure.
- Modifiez la matrice d’activité pour définir l’heure de fin de la culture à 2 min dans le futur et supprimez toutes les autres activités restantes. Suivez les instructions à l’écran pour fixer le tampon de formulation finale à l’ensemble de tubes et commencer la récolte.
REMARQUE : Le processeur transfère automatiquement les cellules dans le sac de cellules cibles. Le volume sera de 100 ml. - Prélevez un échantillon de 0,5 ml dans le sachet de contrôle qualité du sac à cellules cible et effectuez une numération cellulaire.
- Fermez le sac de cellules Target et retirez-le de l’ensemble de tuyaux. Divisez le produit CAR-T en doses appropriées et conservez-les dans un congélateur à débit contrôlé. Stocker les cellules dans la phase vapeur du réservoir de stockage d’azote liquide à ≤ -150 ºC.
REMARQUE : La formulation finale et l’aliquote des doses sont spécifiques au protocole. Nous donnons ici un exemple dans lequel trois doses égales de cellules CAR-T et de flacons de QC sont cryoconservées. Voir la section 10 pour plus de détails. - Téléchargez les données de processus de l’instrument, retirez et éliminez le jeu de tubulures, puis effectuez un arrêt.
10. Cryoconservation des cellules CAR-T
REMARQUE : Ce protocole suppose que les cellules CAR-T sont cryoconservées après la fabrication et stockées jusqu’à ce que le patient soit prêt pour la perfusion. Bien qu’il soit possible d’infuser des cellules CAR-T fraîchement fabriquées, cela augmente la charge logistique car cela nécessite de coordonner la fabrication des cellules CAR-T avec la perfusion de cellules CAR-T. Cela peut être problématique en cas de défaillance de fabrication. Surtout si le protocole clinique nécessite une chimiothérapie lymphodéplétive avant la perfusion de CAR-T, nous suggérons fortement la cryoconservation, car un échec de fabrication peut exposer le patient au risque d’une chimiothérapie inutile. Les organismes de réglementation peuvent exiger des investigateurs qu’ils démontrent que le produit passe tous les tests de libération avant la perfusion, ce qui peut être difficile à réaliser sans cryoconservation.
- À partir des 100 mL restants de produit récolté, déterminer et retirer le volume requis pour respecter les doses CAR-T désirées et les flacons de contrôle de la qualité (CQ) pour effectuer des tests de libération supplémentaires (p. ex., viabilité), de rétention et un échantillon de stérilité.
REMARQUE : Il est essentiel d’élaborer une stratégie entièrement définie pour l’aliquotage du produit final. Nous suggérons de fabriquer plusieurs doses du produit pour permettre des réinjections, étant donné qu’il y a suffisamment de matériel disponible. Un volume de produit de 10 à 20 ml dans un sac permet une décongélation rapide et une perfusion facile par poussée de seringue. Il est recommandé de remplir chaque produit à la dose de cellules CAR-T souhaitée (par exemple, 5 × 106 cellules CAR-T par kg ou 2,5 × 108 cellules CAR-T) car cela évitera d’avoir à calculer la dose le jour de la perfusion. Il est également recommandé de cryoconserver au moins quatre flacons de contrôle qualité et de tenir compte de la possibilité qu’il puisse y avoir des restes de matériel ; Nous vous suggérons de conserver ce matériel car il peut être utile à des fins de recherche et de développement. - Centrifugez les cellules pour réduire le volume.
- Amener le(s) produit(s) à la moitié du volume final souhaité en utilisant la portion de tampon de formulation finale mise de côté à l’étape 9.3.
- Préparez 2 cryoprotecteurs en créant une solution de DMSO à 20 % dans le tampon de formulation finale.
REMARQUE : La formulation du cryoprotecteur et la concentration de DMSO peuvent être modifiées. - Ajouter 2 fois le cryoprotecteur aux cellules à volume égal pour obtenir une concentration finale de DMSO de 10 %.
REMARQUE : La durée d’exposition du produit au cryoprotecteur doit être réduite au minimum. - Remplissez les sacs de dose et les flacons de contrôle qualité. Envoyer 1 mL pour la stérilité.
REMARQUE : Les organismes de réglementation exigent généralement un test de stérilité de 14 jours effectué sur le produit final. Cependant, des tests de stérilité rapide sont en train d’émerger ; À l’heure actuelle, la méthode officinale de 14 jours est la plus courante. - Cryoconservez les produits à l’aide d’un congélateur à débit contrôlé.
REMARQUE : Le programme de congélation à débit contrôlé doit être validé pour produire une vitesse de refroidissement de ~ -1 ºC/min à ~ -45 ºC, avec compensation du point eutectique. - Conservez le produit en phase vapeur dans un congélateur à ultra-basse température à l’azote liquide à ≤ -150 °C.
11. Examen de l’exécution de la procédure
REMARQUE : Tout au long du processus STC, plusieurs échantillons de CQ sont prélevés dans la culture active. Le tableau 2 fournit une grille qui peut aider le lecteur à organiser les résultats à titre de référence et à calculer les mesures de performance de la procédure. Les termes ci-dessous, composés d’une lettre et d’un chiffre (p. ex., « B4 »), font référence aux cellules de la grille de ce tableau. Les valeurs suivantes sont utilisées dans les calculs de performance : B3 = pré-enrichissement total des cellules nucléées (TNC) ; B4 = TNC post-enrichissement ; E2 = Somme des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en pourcentage du nombre total de cellules du produit d’aphérèse initial ; E4 = La somme des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en pourcentage du nombre total de cellules après l’enrichissement ; G2 = cellules CD19+ en pourcentage du nombre total de cellules du produit initial ; G4 = cellules CD19+ en pourcentage du nombre total de cellules après enrichissement en CD4+/CD8+ ; B10 = TNC de la culture active le jour de la récolte.
Tableau 2 : Grille de performance des procédures. Nous fournissons cette grille pour vous aider à organiser les résultats des tests en cours de processus nécessaires au calcul des statistiques de performance de la procédure. Les lignes représentent des échantillons analysés à différents moments de la procédure et sont étiquetées avec les chiffres de 1 à 11. Les rangs 6 à 9 peuvent être utilisés pour saisir les résultats d’échantillons prélevés après le jour 6 de la culture, mais avant le jour de la récolte. Les colonnes représentent les paramètres mesurés et sont étiquetées avec les lettres A-H. Les champs grisés ne s’appliquent pas. Certains champs supplémentaires peuvent ne pas s’appliquer selon que l’enrichissement en CD4+/CD8+ est effectué ou non dans le cadre de la procédure et selon la durée de la culture. Nous vous suggérons d’écrire « S.O. » dans ces champs. Abréviations : TNC = nombre total de cellules nucléées ; QC = contrôle de la qualité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
- Calculer la récupération des cellules CD4+/CD8+ après la sélection en divisant le nombre total de lymphocytes T CD4+ plus CD8+ après l’enrichissement par le nombre total de lymphocytes T CD4+ plus CD8+ avant l’enrichissement à l’aide de l’équation (1).
Récupération des lymphocytes T CD4+/CD8+ =
(1) - Calculer l’épuisement des cellules CD19+ après l’enrichissement en divisant le nombre total de cellules CD19+ après l’enrichissement en CD4+/CD8+ par le nombre total de cellules CD19+ avant l’enrichissement. Comme on s’attend à ce que ce nombre soit très petit, inscrivez le logarithme de cette fraction comme indiqué dans l’équation (2) :
Log d’épuisement des cellules CD19 = log10
(2) - Calculer la croissance totale du pli en divisant le nombre total de cellules en culture active à la récolte par le nombre de cellules ensemencées à l’aide de l’équation (3) :
Croissance totale du pli =
(3) - Calculer la croissance journalière moyenne en prenant la racine de la croissance totale des plis par rapport au jour de la récolte à l’aide de l’équation (4) :
Croissance quotidienne moyenne = jour de récolte √ (croissance totale des plis) (4)
(1)
(2)
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Representative Results
Les résultats des trois premiers essais de fabrication de CAR-T de l’essai NCT05480449 sont présentés ci-dessous dans le tableau 3. Le matériel de départ, le vecteur, les cytokines de culture et les concentrations sériques AB ont été maintenus constants pour chaque essai. Les produits ont été récoltés le jour 7 ou 8. La croissance cellulaire quotidienne moyenne était de 46 % (augmentation du nombre total de cellules), ce qui indique que le processus TCT était efficace pour favoriser l’expansion cellulaire. Ces résultats suggèrent que le processeur peut produire des produits de cellules CAR-T cohérents et reproductibles.
Les résultats finaux des tests du produit, résumés dans le tableau 4, démontrent que les cellules CAR-T ont satisfait aux normes de contrôle de la qualité. La viabilité cellulaire se situait entre 88 % et 94 %, et la pureté des lymphocytes T CD3 était de 89 à 93 %. Il est important de noter que les endotoxines, les mycoplasmes, la stérilité, les lentivirus compétents pour la réplication et les cellules leucémiques résiduelles n’étaient pas détectables. Ces résultats confirment que le procédé TCT produit des cellules CAR-T de haute qualité qui répondent aux normes réglementaires pour une utilisation clinique.
Trois panels de cytométrie en flux ont été développés pour cette procédure (Figure 3). Il s’agit notamment du panel CD4/CD8 pour tester le pourcentage de lymphocytes T CD4+ et CD8+ avant et après l’enrichissement, du panel CAR-T CD19 pour tester l’efficacité de la transduction, et du panel CD3/CD19 pour déterminer la viabilité et la teneur en cellules leucémiques résiduelles (CD19+) dans le produit final. Les résultats de ces panels confirment la réussite de la fabrication des cellules CAR-T et l’absence de cellules leucémiques résiduelles dans le produit final.
Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que le procédé TCT peut produire des produits de cellules CAR-T cohérents et de haute qualité adaptés à un usage clinique.
Figure 3 : Essais de cytométrie en flux. La stratégie de déclenchement utilisée pour l’analyse par cytométrie en flux est décrite pour chaque panneau. Les portes sont dessinées sous forme de boîtes noires ou d’ellipses et étiquetées, et des flèches bleues indiquent la direction de la barrière. (A) Panneau CD4/CD8. Les lymphocytes B sont définis comme le sous-ensemble CD19+ et les lymphocytes T comme le sous-ensemble CD3+ de la porte lymphatique. Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ sont des sous-ensembles de la grille des lymphocytes T. (B) Panneau CAR-T CD19. Les lymphocytes T CAR+ sont définis comme le sous-ensemble CD19-CAR+ des lymphocytes T CD3+. De plus, les sous-ensembles de CD4+ et de CD8+ qui sont des CD19 CAR+ sont énumérés. (C) Panneau CD3/CD19. Ce panneau est identique au panneau CD4/CD8, sauf qu’il omet les marqueurs CD4 et CD8. Abréviations : SSC-A = zone de dispersion latérale ; lymphe = lymphocyte ; CD19-CAR = récepteur de l’antigène chimérique spécifique de CD19 ; 7AAD = 7-aminoactinomycine D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Courir # | Matériel de départ | Vecteur | Culture Cytokines | AB Sérum % | Final TNC | Nombre total de cellules CAR-T récoltées | Croissance totale du pli | Croissance quotidienne moyenne | Jour de la récolte | ||
| 1 | Patient Lymphocytes T, aphérèse, Cryoconservé |
huCART19 | IL2 | 5% | 2.75x109 | 2.24x108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Patient Lymphocytes T, aphérèse, Cryoconservé |
huCART19 | IL2 | 5% | 4.15x109 | 1.14x108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Patient Lymphocytes T, aphérèse, Cryoconservé |
huCART19 | IL2 | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
Tableau 3 : Paramètres et caractéristiques de croissance de trois cycles de fabrication de CAR-T à l’échelle clinique. Des détails sur les conditions de culture, la croissance et le jour de récolte pour les trois premiers cycles de fabrication de patients à l’aide du processeur pour le NCT05480449 essai clinique sont présentés. huCART19, vecteur lentiviral CAR humanisé dirigé contre le CD19. Il convient de noter que l’efficacité et la viabilité de la transduction de ces produits sont indiquées dans le tableau 4. Abréviations : cellules CAR-T = cellules T à récepteur antigénique chimérique ; TNC = nombre total de cellules nucléées.
| Tests de mise en production | ||||||||||
| Test | Viabilité cellulaire | CD3 % | Endotoxine | Myco-plasma | Efficacité de la transduction | Cellules leucémiques résiduelles | Jour de stérilité 14 | Séquence d’ADN vectorielle par cellule | Séquence d’ADN vectoriel par cellule transduite | Lentivirus compétent pour la réplication |
| Spécification | ≥ 70 % | ≥ 80 % | ≤ 3,5 UE/mL |
Négatif | ≥ 2 % | < 1 % | Pas de croissance | Résultat du rapport | 0.04-8 Copies/ Cellule transduite |
< 50 copies/μg d’ADN |
| Résultats | ||||||||||
| Exécution 1 | 90 | 89 | <0,4 | Négatif | 36 % | Non Détecté |
Non Croissance |
1.04 | 2.89 | Non Détecté |
| Exécution 2 | 88 | 93 | <0,4 | Négatif | 39 % | Non Détecté |
Non Croissance |
1.16 | 2.97 | Non Détecté |
| Exécution 3 | 94 | 91 | <0,4 | Négatif | 18 % | Non Détecté |
Non Croissance |
0.43 | 2.39 | Non Détecté |
Tableau 4 : Tests du produit final et spécifications de mise en production. Les spécifications indiquées dans ce tableau concernent l’essai clinique NCT05480449 (IND 28617). La viabilité post-décongélation, le CD3%, l’efficacité de transduction et le contenu en cellules leucémiques résiduelles ont été mesurés par cytométrie en flux. L’endotoxine a été mesurée à l’aide d’un test chromogène à base de lysat d’amébocyte limulus homologué par la FDA. Les tests de stérilité ont été effectués à l’aide d’une méthode conforme à l’USP<71>. Le mycoplasme, le nombre de séquences d’ADN vectoriel par cellule et le lentivirus compétent pour la réplication ont été mesurés à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). Le nombre de séquences d’ADN vectoriel par cellule transduite a été calculé en divisant le nombre de séquences d’ADN vectoriel par l’efficacité de transduction. Abréviations : EU = unité d’endotoxine ; IND = nouveau médicament expérimental ; FDA = Food and Drug Administration (Food and Drug Administration).
Figure supplémentaire S1 : Essais précliniques de cellules CAR-T fabriquées à l’aide du procédé TCT. Des souris immunodéficientes (NSG) ont reçu une injection de cellules leucémiques de xénogreffe dérivées de patients le jour 0 et ont ensuite été traitées avec des cellules CAR-T dirigées CD19 fabriquées sur le processeur (« fabrication semi-automatique »), des cellules CAR-T dirigées CD19 de fabrication traditionnelle (« fabrication standard ») ou une solution saline le jour 7. (A, B) Survie des souris traitées avec des cellules CAR-T de fabrication semi-automatique à deux niveaux de dose (0,5 × 10, 6 ou 2 × 10,6 cellules CAR-T) par rapport à la solution saline (p < 0,0001 pour les deux niveaux de dose). (C) Comparaison des cellules CAR-T semi-automatiques avec les cellules CAR-T de fabrication standard à un niveau de dose connu pour être non curatif pour les cellules standard (0,5 × 106 cellules CAR-T). La survie était significativement meilleure chez les souris traitées avec des cellules CAR-T du processeur (p = 0,001). (D) Comparaison des cellules CAR-T semi-automatiques avec les cellules CAR-T de fabrication standard à un niveau de dose connu pour être curatif pour les cellules CAR-T CD19 standard. La survie n’était pas significativement différente (p = 0,4). (E) Comparaison des cellules CAR-T du processeur aux deux niveaux de dose. Un effet de dose significatif a été observé avec une meilleure survie chez les souris traitées avec 2 × 106 cellules huCART19 (p = 0,007). Chaque groupe contenait 5 souris. Abréviations : NSG = ndiabète obèse severe immunodéficience combinée gamma ; TCT = transduction des lymphocytes T ; CAR-T = lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Comparaison de la croissance et de la transduction lentivirale de lymphocytes T humains cultivés dans un milieu complété par différents lots de sérum AB humain. (A) Expansion de lymphocytes T humains non transduits (UTD) ou transduits avec le vecteur lentiviral CAR-T CD19 (CAR19) dans des cultures complétées par trois lots différents de sérum AB humain (7J, 22A ou 21J). Les taux de croissance de l’un des lots (22A) étaient nettement supérieurs à ceux des deux autres. (B) Pourcentage moyen (3 répétitions) de cellules CAR19+ dans les sous-populations CD3+ et CD3+/CD4+ ou CD3+/CD8+ de lymphocytes T expansés ex vivo provenant de donneurs sains. Il convient de noter que les différences dans les taux de croissance ne semblaient pas influencer la capacité des cellules à absorber le lentivirus, telle que déterminée par l’analyse par cytométrie en flux des cellules des cultures élargies. L’efficacité de transduction des lymphocytes T et des sous-populations de CD4+ et de CD8+ était constante d’une culture à l’autre. Les barres d’erreur représentent les écarts-types de 3 cultures répétées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La thérapie cellulaire CAR-T est apparue comme une approche thérapeutique prometteuse pour les cellules B et d’autres tumeurs malignes. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T présentent plusieurs limites, telles qu’un coût élevé, une production à forte intensité de main-d’œuvre et des étapes ouvertes qui augmentent le risque de contamination. Récemment, plusieurs plates-formes semi-automatisées, dont Miltenyi CliniMACS Prodigy (le « processeur »), ont vu le jour pour remédier à ces limitations. Le processus de transduction des lymphocytes T (TCT), intégré dans le processeur décrit dans ce manuscrit, englobe l’enrichissement, l’activation, la transduction virale, l’expansion de la culture et la récolte des lymphocytes T dans un système fermé. Les plates-formes de traitement cellulaire automatisées concurrentes sont moins largement utilisées à l’heure actuelle, mais peuvent avoir une meilleure surveillance en cours de processus des paramètres de culture, un coût d’équipement ou de matériau favorable, ou un encombrement plus petit, ce qui peut permettre une utilisation dans une enceinte de sécurité biologique au lieu d’un espace dédié à la salle blanche. Il est important de choisir une plate-forme parfaitement adaptée à une application et à un environnement donnés.
L’une des principales limites des thérapies cellulaires et géniques, telles que la thérapie cellulaire CAR-T, est le coût élevé des produits commerciaux, qui limite l’accès à des thérapies qui sauvent des vies. C’est particulièrement le cas dans les pays pauvres en ressources et dans les pays qui ne font pas partie des pays industrialisés. Nous avons constaté qu’il est possible de fabriquer des cellules CAR-T à un coût considérablement inférieur à celui d’un produit commercial comparable lors du déploiement d’un processus semi-automatisé dans le cadre d’un hôpital universitaire qui dispose d’installations de salle blanche conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans le contexte d’un laboratoire de cellules souches et du soutien d’un laboratoire clinique qui peut effectuer certains des tests en cours de fabrication et de libération. Dans ces circonstances, nous constatons que le coût marginal d’exécution d’un cycle de fabrication, y compris les matériaux et la main-d’œuvre pour la fabrication et tous les essais en cours de fabrication et de mise en production (mais non compris l’équipement et les installations) est d’environ 30 000 $. Il convient de noter que le coût en capital de l’équipement du processeur est inférieur au coût d’un seul produit commercial à base de cellules CAR-T.
L’une des préoccupations potentielles liées au passage d’une méthode manuelle à une méthode automatisée est la diminution de la flexibilité. Le processus TCT, bien que programmé avec de solides garde-fous, est toujours largement personnalisable. Le processus offre plusieurs points de départ, y compris un processus complet avec enrichissement des lymphocytes T, un processus complet sans enrichissement (p. ex., pour une utilisation avec des cellules pré-enrichies CD4+/CD8+, voir la section 5 du Protocole ci-dessus) et une reprise d’un processus avorté. De plus, la fonction Matrice d’activité permet de personnaliser l’ensemble du processus de culture. Compte tenu de l’intérêt croissant pour la fabrication rapide de CAR-T, il convient de noter qu’il est possible de configurer la matrice d’activité pour qu’elle commence la récolte dès quelques heures après la transduction, si vous le souhaitez. La procédure rapide présente le double avantage potentiel de réduire le temps de fabrication et d’obtenir un produit plus puissant en évitant la différenciation et la perte d’activité anti-leucémique12. De plus, une variante du TCT a été conçue pour les vecteurs non viraux en utilisant l’électroporation, ce qui augmente encore la flexibilité du système.
Le moment optimal de récolte des cellules CAR-T dépend de divers facteurs, notamment de la dose cible souhaitée, du nombre de doses nécessaires et de la densité cellulaire maximale que le récipient de culture peut supporter sans compromettre la viabilité cellulaire. Le fabricant recommande de ne pas dépasser 5 milliards de cellules dans un volume de 250 ml. La détermination de la dose cible souhaitée doit être basée sur des données précliniques dans un modèle animal. Par exemple, dans cette étude, nous avons utilisé des souris NOD scid gamma knockout (NSG) injectées avec des xénogreffes leucémiques dérivées de patients et traitées avec des cellules CAR-T pour estimer qu’une dose efficace se situerait approximativement entre 2 et 5 millions de cellules CAR-T par kilogramme (figure supplémentaire S1). La surveillance de la taille des cellules peut également être utile pour déterminer le moment optimal pour la récolte des cellules CAR-T. En tenant compte de ces facteurs, les chercheurs peuvent optimiser le temps de récolte des cellules CAR-T pour s’assurer que le produit final est de haute qualité et efficace.
L’élaboration d’un plan d’essai de rejet approprié est un élément essentiel de l’obtention de l’approbation d’une demande d’IND. Nous présentons un ensemble de tests de mise en production, y compris les spécifications de notre IND 28617, et nous pensons que ce sera un bon point de départ pour des produits similaires. Cependant, les opinions des régulateurs évoluent constamment, et des variations du protocole présenté peuvent conduire les régulateurs à exiger des tests différents ou des seuils de spécification différents. Nous vous recommandons fortement de lire attentivement les documents d’orientation réglementaires actuels, tels que les informations sur la chimie, la fabrication et le contrôle (CMC) de la FDA pour les demandes de nouveaux médicaments expérimentaux (IND) de thérapie génique humaine13. Un principe général est que les tests démontrant l’innocuité d’un produit sont évalués plus rigoureusement que les tests démontrant la puissance. En règle générale, les tests tels que la stérilité, l’endotoxine, les mycoplasmes et les lentivirus compétents pour la réplication doivent être validés et leurs critères de performance doivent être connus. En revanche, les tests de puissance sont relativement moins mis en avant dans les essais de phase précoce et peuvent ne pas avoir besoin d’être entièrement validés. Un récent projet de directive de la FDA stipule que « l’expression des transgènes seule en tant que mesure de la puissance peut être suffisante pour soutenir les études IND de phase précoce »14. De plus, les essais utilisés pour la détermination de la dose doivent être validés. Cela peut être problématique pour les nouvelles cibles de CAR pour lesquelles il n’existe peut-être pas d’essais de débit normalisés ou de matériaux de référence. Dans ce cas, la FDA suggère que « le matériau de référence pour un test peut être un lot bien caractérisé du produit de thérapie génique lui-même ». 13 Par exemple, nous avons établi un contrôle positif pour le test d’écoulement CAR CD19 à l’aide de cellules CAR-T provenant des premiers essais d’ingénierie.
Le développement et l’optimisation du processus de fabrication de la thérapie cellulaire CAR-T peuvent être difficiles et prendre beaucoup de temps, comme nous en avons fait l’expérience dans notre travail. Nous avons rencontré plusieurs revers, notamment des problèmes de contamination bactérienne. Nous recommandons fortement l’utilisation d’une méthode de décongélation à sec pour la décongélation des cellules, car les bains-marie peuvent augmenter le risque de contamination. En raison de la culture, même un petit inoculum peut entraîner une contamination franche, ce qui donne un produit inutilisable. De plus, nous vous recommandons de planifier la logistique des tests de mise en production, ce qui peut impliquer des validations supplémentaires et des contrats avec des parties externes pour garantir des tests rapides et précis. Un autre élément important lors du développement d’un procédé de fabrication CAR-T est l’optimisation de l’efficacité de la transduction. Une demande d’IND doit inclure des données démontrant la puissance du vecteur viral. Pour répondre à cette exigence et en même temps obtenir des informations permettant d’optimiser le moment d’inertie, nous recommandons fortement d’effectuer un titrage à petite échelle du vecteur viral de qualité clinique sur des lymphocytes T humains. Il est également important d’envisager l’utilisation de cellules CAR-T fabriquées de manière traditionnelle comme contrôle pour les expériences sur les souris (comme le montre la figure supplémentaire S1). L’obtention de ces cellules peut être difficile et nécessiter une planification minutieuse. Un autre facteur à prendre en compte est l’utilisation du sérum AB humain, qui est un réactif mal défini qui peut avoir un effet significatif sur la croissance cellulaire et d’autres caractéristiques du produit. Pour remédier à ce problème, nous suggérons de tester plusieurs lots de sérum AB et de mener des expériences à petite échelle pour évaluer les effets spécifiques du lot sur la croissance cellulaire (figure supplémentaire S2). Une fois qu’un lot approprié est identifié, un volume suffisamment important doit être acheté pour assurer la cohérence dans l’ensemble de la cohorte de l’essai et minimiser le risque d’effets de lot sur les résultats des patients qui sont dus à des changements dans le lot de sérum.
En résumé, le processeur et le processus TCT inclus offrent une méthode de fabrication qui peut répondre à plusieurs limitations des procédures de fabrication CAR-T actuelles, notamment les coûts élevés, la production à forte intensité de main-d’œuvre et les étapes de manipulation ouvertes. En fournissant un système fermé et semi-automatisé, ce processeur a le potentiel d’améliorer la disponibilité et l’abordabilité de la thérapie cellulaire CAR-T. Il peut s’adapter à une fabrication rapide et à des vecteurs non viraux, ce qui en fait une alternative flexible aux méthodes de fabrication traditionnelles. En examinant attentivement des facteurs tels que la dose cible souhaitée, la densité cellulaire maximale et les effets du sérum AB humain sur la croissance cellulaire, les chercheurs peuvent optimiser le temps de récolte des cellules CAR-T pour garantir la qualité et l’efficacité du produit final. Bien que le processus puisse être complexe et laborieux, la planification de la logistique pour les tests de libération et l’élimination des sources de contamination peuvent aider à atténuer les risques et à assurer le succès de la fabrication des cellules CAR-T. Dans l’ensemble, le processus TCT présente une avenue prometteuse pour la thérapie cellulaire CAR-T, avec le potentiel de surmonter les limites actuelles et d’améliorer l’accessibilité des patients, ce qui profitera finalement aux patients atteints de cancer.
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Disclosures
S.K., S.G. et Y.W. ont reçu le soutien de Miltenyi Biotec pour leurs recherches.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner la contribution de plusieurs personnes et organisations à ce travail. Le laboratoire de thérapie cellulaire et génique et le laboratoire d’études translationnelles et corrélatives de Pennsylvanie ont fourni une aide précieuse pour le développement de processus et la préparation des demandes d’IND. Melissa Varghese et Amanda DiNofia ont contribué à l’élaboration du processus et à la préparation des soumissions d’IND qui sous-tendent ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention d’accélération du Cell and Gene Therapy Collaborative de l’hôpital pour enfants de Philadelphie. Les auteurs tiennent également à remercier Miltenyi Biotec pour son soutien technique et de recherche. La figure 1 est couverte par le droit d’auteur © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG ; Tous droits réservés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
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- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
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