Summary
यह लेख नैदानिक उपयोग के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं के लिए विनिर्माण प्रक्रिया का विवरण देता है, विशेष रूप से एक स्वचालित सेल प्रोसेसर का उपयोग करके जो वायरल ट्रांसडक्शन और टी कोशिकाओं की खेती करने में सक्षम है। हम सिफारिशें प्रदान करते हैं और उन नुकसानों का वर्णन करते हैं जिन्हें प्रारंभिक चरण के नैदानिक परीक्षण की प्रक्रिया विकास और कार्यान्वयन के दौरान माना जाना चाहिए।
Abstract
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाएं विभिन्न घातक और गैर-घातक रोगों के उपचार के लिए एक आशाजनक इम्यूनोथेराप्यूटिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती हैं। सीएआर-टी कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाएं हैं जो एक चिमेरिक प्रोटीन को व्यक्त करती हैं जो सेल सतह लक्ष्य को पहचानती है और बांधती है, जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य सेल की हत्या होती है। पारंपरिक सीएआर-टी सेल विनिर्माण विधियां श्रम-गहन, महंगी हैं, और संदूषण का खतरा उठा सकती हैं। क्लिनीएमएसीएस प्रोडिजी, एक स्वचालित सेल प्रोसेसर, एक बंद प्रणाली में नैदानिक पैमाने पर सेल थेरेपी उत्पादों के निर्माण की अनुमति देता है, संदूषण के जोखिम को कम करता है। प्रसंस्करण एक कंप्यूटर के नियंत्रण में अर्ध-स्वचालित रूप से होता है और इस प्रकार प्रक्रिया में मानव भागीदारी को कम करता है, जो समय बचाता है और परिवर्तनशीलता और त्रुटियों को कम करता है।
यह पांडुलिपि और वीडियो इस प्रोसेसर का उपयोग करके सीएआर-टी कोशिकाओं के निर्माण के लिए टी सेल ट्रांसडक्शन (टीसीटी) प्रक्रिया का वर्णन करता है। टीसीटी प्रक्रिया में सीडी 4 + / सीडी 8 + टी सेल संवर्धन, सक्रियण, वायरल वेक्टर के साथ पारगमन, विस्तार और फसल शामिल है। गतिविधि मैट्रिक्स का उपयोग करते हुए, एक कार्यक्षमता जो इन चरणों के आदेश और समय की अनुमति देती है, टीसीटी प्रक्रिया को बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया जा सकता है। हम वर्तमान अच्छे विनिर्माण अभ्यास (सीजीएमपी) के अनुपालन में सीएआर-टी सेल विनिर्माण का वॉक-थ्रू प्रदान करते हैं और आवश्यक रिलीज परीक्षण और प्रीक्लिनिकल प्रयोगों पर चर्चा करते हैं जो एक जांच नई दवा (आईएनडी) आवेदन का समर्थन करेंगे। हम व्यवहार्यता का प्रदर्शन करते हैं और नैदानिक सीएआर-टी सेल विनिर्माण के लिए अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग करने के फायदे और नुकसान पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम एक चल रहे अन्वेषक-शुरू किए गए नैदानिक परीक्षण का वर्णन करते हैं जो बाल चिकित्सा बी-सेल दुर्भावनाओं को लक्षित करता है [NCT05480449] एक उदाहरण के रूप में कि इस विनिर्माण प्रक्रिया को नैदानिक सेटिंग में कैसे लागू किया जा सकता है।
Introduction
एक चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण ने दुर्दम्य बी-सेल विकृतियों 1,2,3,4,5 के रोगियों के इलाज में उल्लेखनीय प्रभावकारिता दिखाई है। हालांकि, सीएआर-टी कोशिकाओं के लिए पारंपरिक विनिर्माण विधियां श्रम-गहन, समय लेने वाली हैं, और अत्यधिक विशिष्ट चरणों को पूरा करने के लिए अत्यधिक प्रशिक्षित तकनीशियनों की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एक ऑटोलॉगस सीएआर-टी सेल उत्पाद की पारंपरिक विनिर्माण प्रक्रिया में टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन, एल्यूट्रिएशन या चुंबकीय पृथक्करण, एक बाँझ फ्लास्क में वायरल वेक्टर के साथ सक्रियण और पारगमन और फसल और सूत्रीकरण से पहले बायोरिएक्टर में विस्तार शामिल है। विभिन्न प्रणालियां हाल ही में उभरी हैं जिनका उद्देश्य इस प्रक्रिया को आंशिक रूप से स्वचालित करना है। उदाहरण के लिए, Miltenyi CliniMACS Prodigy (इसके बाद "प्रोसेसर" के रूप में संदर्भित) एक स्वचालित सेल प्रोसेसिंग डिवाइस है जो इनमें से कई चरणों को स्वचालित फैशन 6,7,8,9 में कर सकता है। पारंपरिक और स्वचालित सीएआर-टी विनिर्माण विधियों की गहन चर्चा हाल ही में समीक्षा लेख10 में प्रस्तुत की गई है।
प्रोसेसर हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं के प्रसंस्करण के लिए एक अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) -अनुमोदित चिकित्सा उपकरण क्लिनीएमएसीएस प्लस की कार्यक्षमता पर बनाता है। प्रोसेसर में एक सेल खेती इकाई शामिल है जो कोशिकाओं की स्वचालित धुलाई, विभाजन और खेती की अनुमति देती है (चित्रा 1)। टी सेल ट्रांसडक्शन (टीसीटी) प्रक्रिया प्रोसेसर डिवाइस के भीतर एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम है जो बड़े पैमाने पर मैनुअल सीएआर-टी सेल निर्माण को दोहराता है। टीसीटी एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस ("गतिविधि मैट्रिक्स," चित्रा 2) का उपयोग करके अनुकूलन योग्य सेल प्रसंस्करण की अनुमति देता है। क्योंकि प्रोसेसर कई चरणों को स्वचालित करता है और एक मशीन में कई उपकरणों की कार्यक्षमता को समेकित करता है, इसके लिए प्रौद्योगिकीविदों से कम प्रशिक्षण और विशेष समस्या निवारण कौशल की आवश्यकता होती है। चूंकि सभी चरण एक बंद, एकल-उपयोग ट्यूबिंग सेट के भीतर किए जाते हैं, प्रोसेसर को खुली विनिर्माण प्रक्रिया के लिए स्वीकार्य माने जाने की तुलना में कम कठोर एयर-हैंडलिंग बुनियादी ढांचे वाली सुविधाओं में संचालित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम आईएसओ कक्षा 8 (ईयू ग्रेड सी के बराबर) के रूप में प्रमाणित सुविधा में प्रोसेसर का संचालन कर रहे हैं।
चित्रा 1: टी सेल ट्रांसडक्शन सिस्टम का उपयोग करके सीएआर-टी सेल विनिर्माण। ट्यूबिंग सेट स्थापित प्रोसेसर दिखाया गया है। ट्यूबिंग सेट बाँझ वेल्डिंग के माध्यम से प्रसंस्करण बफर, कल्चर माध्यम और लेंटिवायरल वेक्टर युक्त बैग जैसे अन्य घटकों को जोड़ने की अनुमति देता है। एक बार जब ल्यूकाफेरेसिस उत्पाद को एप्लिकेशन बैग में जोड़ा जाता है, तो इसे टी सेल चयन मोतियों के साथ लेबल किया जा सकता है, पृथक्करण कॉलम के माध्यम से पारित किया जा सकता है, और फिर पुन: आवेदन बैग में स्थानांतरित किया जा सकता है। चयनित कोशिकाओं को तब संस्कृति के लिए उपकरण की खेती इकाई में निर्देशित किया जाता है और सक्रियण अभिकर्मक के साथ सक्रिय किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)। अंतिम उत्पाद लक्ष्य सेल बैग में एकत्र किया जाता है। प्रक्रिया के दौरान, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने निकालना संभव है। सर्कल के अंदर ग्रे नंबर प्रोसेसर पर क्रमांकित वाल्व का प्रतिनिधित्व करते हैं जो टयूबिंग सेट के माध्यम से तरल पथ को निर्देशित करते हैं। 11 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: गतिविधि मैट्रिक्स। टी सेल चयन और सक्रियण के बाद, सीएआर-टी सेल विनिर्माण प्रक्रिया का शेष पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है। गतिविधियों को जोड़ा या हटाया जा सकता है और उचित दिन और समय के लिए शेड्यूल किया जा सकता है, और गतिविधि के बाद संस्कृति वॉल्यूम निर्दिष्ट किया जा सकता है (वॉल्यूम)। उदाहरण के लिए, ट्रांसडक्शन गतिविधि को दिन 1 पर सुबह 10:00 बजे शुरू करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था, और गतिविधि के अंत में संस्कृति की मात्रा 100 एमएल के रूप में सेट की गई थी। गतिविधि मैट्रिक्स को खेती की अवधि के दौरान संपादित किया जा सकता है। प्रसंस्करण उपकरण की एकीकृत स्क्रीन पर प्रक्रिया की स्थिति की निगरानी की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इस पांडुलिपि का उद्देश्य प्रोसेसर का उपयोग करके सीएआर-टी कोशिकाओं के निर्माण का एक विस्तृत वॉक-थ्रू प्रदान करना है और इसके अतिरिक्त इन-प्रोसेस और उत्पाद रिलीज परीक्षण पर मार्गदर्शन प्रदान करना है जो नियामकों द्वारा एक जांच नई दवा (आईएनडी) आवेदन को मंजूरी देने के लिए आवश्यक होगा। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विक्रेता के अनुशंसित दृष्टिकोण के करीब रहता है और आईएनडी 28617 के लिए अंतर्निहित प्रोटोकॉल है, जिसका वर्तमान में एकल-केंद्र अन्वेषक-शुरू किए गए चरण I / II नैदानिक परीक्षण में मूल्यांकन किया जा रहा है। इस परीक्षण का उद्देश्य बी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (बी-एएलएल) या बी-वंश लिम्फोब्लास्टिक लिम्फोमा (बी-एलएलवाई) के रोगियों के लिए मानवकृत सीडी 19-निर्देशित ऑटोलॉगस सीएआर-टी कोशिकाओं के निर्माण के लिए इस प्रोसेसर का उपयोग करने की सुरक्षा और प्रभावकारिता निर्धारित करना NCT05480449 है। परीक्षण सितंबर 2022 में शुरू हुआ और बी-एएलएल या बी-एलएलवाई के साथ 0-29 वर्ष की आयु के 89 रोगियों को भर्ती करने की योजना है। हम पांडुलिपि में परीक्षण से कुछ विनिर्माण परिणामों की रिपोर्ट करते हैं।
हम यह बताना चाहते हैं कि यद्यपि पांडुलिपि को पालन करने के चरणों के साथ एक प्रोटोकॉल के रूप में प्रस्तुत किया गया है, लेकिन इसे दूसरों के लिए अपनी सीएआर-टी सेल विनिर्माण प्रक्रिया को अनुकूलित करना शुरू करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु माना जाना चाहिए। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संभावित विविधताओं की एक गैर-व्यापक सूची में शामिल हैं: शुरुआती सामग्री के रूप में क्रायोसंरक्षित टी कोशिकाओं के बजाय ताजा का उपयोग करना; टी सेल संवर्धन की एक अलग विधि का उपयोग करना या इसे पूरी तरह से छोड़ना; आईएल 2 के बजाय आईएल 7 / आईएल 15 जैसे विभिन्न मीडिया और साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग करना; मानव एबी सीरम की एकाग्रता को बदलना या इसे पूरी तरह से छोड़ना; पारगमन का समय; "मल्टी-हिट" ट्रांसडक्शन का उपयोग करना; अलग-अलग आंदोलन, संस्कृति की मात्रा, और भोजन अनुसूची; न्यूक्लिक एसिड या गैर-लेंटिवायरल वैक्टर के इलेक्ट्रोपोरेशन सहित आनुवंशिक हस्तांतरण के विभिन्न तरीकों का उपयोग करना; एक अलग अंतिम फॉर्मूलेशन बफर और / या क्रायोप्रोटेक्टेंट का उपयोग करना; और बाद में जलसेक के लिए क्रायोप्रिजर्वकरने के बजाय सीएआर-टी कोशिकाओं को ताजा करना। इन विविधताओं का चिकित्सीय उत्पाद की सेलुलर संरचना और शक्ति पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है।
| समग्र प्रक्रिया चरण | प्रक्रिया दिवस | तकनीकी विवरण | |||
| सेल संवर्धन। | दिन 0 | CD4+/CD8+T कक्षों का चयन | |||
| कक्ष सक्रियण | टी सेल कल्चर सीडिंग और सक्रियण। | ||||
| सेल ट्रांसडक्शन | दिन 1 | लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन (100 एमएल कल्चर वॉल्यूम) | |||
| सेल विस्तार (सेल फॉर्मूलेशन के बाद) | दिन 2 | -- | |||
| दिन 3 | कल्चर वॉश (1 चक्र); शेकर सक्रिय; संस्कृति की मात्रा 200 एमएल तक बढ़ जाती है | ||||
| दिन 4 | -- | ||||
| दिन 5 | फ़ीड (50 एमएल); संस्कृति की मात्रा 250 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचती है | ||||
| दिन 6 | इन-प्रोसेस नमूना; मीडिया एक्सचेंज (-125 एमएल / + 125 एमएल) | ||||
| दिन 7 | मीडिया एक्सचेंज (-150 एमएल / + 150 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| दिन 8 | इन-प्रोसेस नमूना; मीडिया एक्सचेंज (-150 एमएल / + 150 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| दिन 9 | मीडिया एक्सचेंज (-180 एमएल / + 180 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| 10वां दिन | इन-प्रोसेस नमूना; मीडिया एक्सचेंज (-180 एमएल / + 180 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| दिन 11 | मीडिया एक्सचेंज (-180 एमएल / + 180 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| दिन 12 | मीडिया एक्सचेंज (-180 एमएल / + 180 एमएल) या हार्वेस्ट | ||||
| दिन 13 | उपज | ||||
तालिका 1: प्रक्रिया समयरेखा और अवलोकन। यह तालिका वर्तमान नैदानिक परीक्षण में नियोजित टीसीटी प्रक्रिया चरणों को सारांशित करती है [NCT05480449]। यह प्रक्रिया सीडी 4 + / सीडी 8 + चयन, कल्चर सीडिंग और दिन 0 पर सक्रियण द्वारा टी सेल संवर्धन के साथ शुरू होती है, इसके बाद दिन 1 पर पारगमन होता है। कोशिकाएं 48 घंटे तक आराम करती हैं, इसके बाद एक कल्चर वॉश, कल्चर वॉल्यूम में 200 एमएल की वृद्धि होती है, और एक हिलाने वाले तंत्र का उपयोग करके आंदोलन होता है। 6 वें दिन, पहला इन-प्रोसेस नमूना लिया जाता है। सीएआर-टी कोशिकाओं की कम से कम तीन पूर्ण खुराक (5 × 10 6 सीएआर-टी कोशिकाओं / किग्रा के लिए पर्याप्त कोशिकाएं उपलब्ध होने के बाद कोशिकाओं की कटाई की जाती है यदि रोगी <50 किलोग्राम है, अन्यथा 2.5 × 108 सीएआर-टी कोशिकाएं) और गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण (~ 2 × 106 सीएआर-टी कोशिकाएं); या एक बार संस्कृति कुल 4-5 x 109 कोशिकाओं तक पहुंच जाती है। संक्षेप: टीसीटी = टी सेल ट्रांसडक्शन; सीएआर-टी = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाएं; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग।
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Protocol
सभी शोध अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदन के साथ संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे, और सभी विषयों ने परीक्षण के संदर्भ में एकत्र किए गए डेटा के प्रकाशन के लिए सूचित सहमति प्रदान की है।
नोट: प्रोटोकॉल का पहला खंड सीएआर-टी विनिर्माण प्रक्रिया का एक उच्च-स्तरीय अवलोकन प्रदान करता है। शेष अनुभाग चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल TCT सॉफ़्टवेयर संस्करण 1.4 का उपयोग कर वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो इस लेखन का वर्तमान संस्करण है। TCT सॉफ़्टवेयर के अन्य संस्करणों का उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस भिन्न हो सकता है।
1. प्रक्रिया समयरेखा और अवलोकन (तालिका 1)
- प्रीफ्लाइट चेक के साथ सोमवार (दिन -1) को प्रक्रिया के लिए तैयार रहें। सुनिश्चित करें कि प्रोसेसर और अन्य उपकरण अपेक्षा के अनुसार चल रहे हैं और सभी अभिकर्मक और उपभोग्य वस्तुएं उपलब्ध हैं और पूरे विनिर्माण रन के लिए अद्यतित हैं।
- दिन 0 पर, मशीन पर ट्यूबिंग सेट स्थापित करें। पहले एक सूखे स्नान में क्रायोसंरक्षित टी कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें उपकरण पर स्थापित टयूबिंग सेट से बाँझ वेल्डिंग द्वारा कनेक्ट करें।
नोट: यह प्रोटोकॉल मानता है कि ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं को एफेरेसिस, क्रायोप्रिजर्व्ड के माध्यम से एकत्र किया गया था, और विनिर्माण की शुरुआत तक संग्रहीत किया गया था। जबकि ताजा एकत्र टी कोशिकाओं का उपयोग करना संभव है, इससे तार्किक बोझ बढ़ जाता है क्योंकि इसके लिए सीएआर-टी सेल विनिर्माण के साथ एफेरेसिस संग्रह के समन्वय की आवश्यकता होती है। हम बैक्टीरिया संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए पानी के स्नान के बजाय सूखी-पिघलने की प्रक्रिया का उपयोग करने की दृढ़ता से सलाह देते हैं। - सीडी 4 और सीडी 8 अभिकर्मकों के साथ टी कोशिकाओं को लेबल करें ( सामग्री की तालिका देखें) और चुंबकीय चयन द्वारा समृद्ध।
नोट: प्रोसेसर पर कोशिकाओं को लोड करने से पहले टी सेल संवर्धन को छोड़ना या इसे करना संभव है। प्रोटोकॉल का अनुभाग 5 देखें। - सीडी 4 + / सीडी 8 + कोशिकाओं के संवर्धन के बाद, सेल गिनती के लिए एक नमूना लें। 70 एमएल मध्यम की प्रारंभिक मात्रा में 1-2 × 108 कोशिकाओं के साथ कल्चर को बीज दें ( सामग्री की तालिका देखें) 5% मानव एबी सीरम और पुनः संयोजक मानव आईएल 2 (25 एनजी / एमएल) के साथ पूरक।
- टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए सक्रियण अभिकर्मक (एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित एक कोलाइडल पॉलीमेरिक नैनोमैट्रिक्स; सामग्री की तालिका देखें) की एक शीशी जोड़ें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए आंदोलन के बिना संस्कृति को इनक्यूबेट करें। क्रायो किसी भी बचे हुए सीडी 4 + / सीडी 8 + कोशिकाओं को बैकअप के रूप में संरक्षित करता है, यदि वांछित हो।
नोट: विनिर्माण विफलता के मामले में, बचे हुए सीडी 4 + / सीडी 8 + चयनित कोशिकाओं को प्रारंभिक सामग्री के रूप में उपयोग किया जा सकता है। यदि विफलता विशुद्ध रूप से तकनीकी है, जैसे कि संदूषण या ऑपरेटर त्रुटि, और पर्याप्त कोशिकाएं बनी रहती हैं, तो अतिरिक्त विनिर्माण रन करने के लिए बचे हुए कोशिकाओं का उपयोग करने पर विचार किया जा सकता है। यदि प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता चिंता का विषय है, तो एक नई एफेरेसिस प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है; हालांकि, यह अंततः एक नैदानिक निर्णय है। किसी भी मामले में, एक विनिर्माण विफलता एक महत्वपूर्ण घटना है जिसकी जांच की जानी चाहिए, और प्रायोजक और संभवतः नियामकों को सूचित किया जाना चाहिए। - सक्रियण के 24 घंटे के बाद, संक्रमण की उचित बहुलता (एमओआई) पर लेंटिवायरल वेक्टर के साथ टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें।
नोट: नैदानिक उत्पादों का निर्माण शुरू करने से पहले लेंटिवायरल वेक्टर टिटर निर्धारित करना और एक उपयुक्त एमओआई स्थापित करना महत्वपूर्ण है। वेक्टर टिटर को एक छोटे पैमाने पर प्रयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए जिसमें मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं को वेक्टर की विभिन्न सांद्रता पर ट्रांसड्यूस किया जाता है। उपयुक्त एमओआई के लिए विचारों में वेक्टर की लागत, वांछित पारगमन दक्षता और एक स्वीकार्य वेक्टर कॉपी संख्या शामिल है। यह प्रोटोकॉल वेक्टर की लागत को कम करने के लिए 30-50% के एमओआई का उपयोग करता है और औसत वेक्टर कॉपी संख्या को प्रति ट्रांसड्यूस सेल 8 प्रतियों से नीचे रखता है। - तीसरे दिन, कल्चर वॉश गतिविधि को ट्रिगर करें, और निम्न-स्तरीय आंदोलन शुरू करें। संस्कृति की मात्रा 200 एमएल तक बढ़ाएं।
- दिन 5 पर, संस्कृति में 50 एमएल माध्यम जोड़ें, संस्कृति की मात्रा 250 एमएल तक बढ़ जाए।
- खेती के 6 वें दिन, संस्कृति से एक नमूना लें, और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीएआर-टी कोशिकाओं की गणना करें। इस माप का उपयोग उस दर का अनुमान लगाने के लिए करें जिस पर संस्कृति बढ़ रही है और फसल के इष्टतम समय की पहचान करें।
नोट: प्रत्येक इन-प्रोसेस सैंपलिंग परीक्षण के लिए 3 एमएल उत्पन्न करता है और कुल 7 एमएल कल्चर वॉल्यूम को हटा देता है। - दिन 7 से 13 तक, यदि संस्कृति समाप्त नहीं हुई है, तो वैकल्पिक दिनों में दो अतिरिक्त इन-प्रोसेस नमूने लें, और बढ़ती संस्कृति को खिलाने के लिए दैनिक मीडिया एक्सचेंज करें। उत्पाद की कटाई तब करें जब कुल न्यूक्लियेटेड सेल (टीएनसी) गिनती 5 × 109 तक पहुंच जाती है और / या जब खुराक और रिलीज परीक्षण की आवश्यक संख्या के लिए पर्याप्त कोशिकाएं उपलब्ध होती हैं।
- फसल के दिन, सक्रिय रूप से बढ़ती संस्कृति से एक इन-प्रोसेस नमूना लें। माइकोप्लाज्मा, एंडोटॉक्सिन, प्रतिकृति-सक्षम लेंटीवायरस (आरसीएल) परीक्षण, वेक्टर कॉपी नंबर (वीसीएन) परीक्षण, सेल काउंट, सेल आकार विश्लेषण, फ्लो साइटोमेट्री और ग्राम दाग के लिए इस नमूने का उपयोग करें।
- अंतिम फसल कार्यक्रम शुरू करें, जो संस्कृति माध्यम को हटाने और अंतिम फॉर्मूलेशन बफर के साथ एक सेल वॉश को ट्रिगर करता है (4% मानव सीरम एल्ब्यूमिन के साथ पूरक एक बाँझ आइसोटोनिक क्रिस्टलॉइड समाधान; सामग्री की तालिका देखें)। फसल पूरी होने के बाद, लक्ष्य सेल बैग अंतिम फॉर्मूलेशन बफर में 100 एमएल सेल उत्पाद रखेगा। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को 10% (वी / वी) की एकाग्रता में जोड़ें, उत्पाद को अलग-अलग खुराक में एलिकोट करें, और एक नियंत्रित-दर फ्रीजर का उपयोग करके क्रायोप्रिजर्व करें।
2. दिन -1: तैयारी और उड़ान पूर्व जांच
- सत्यापित करें कि सीओ2 गैस का स्तर और संपीड़ित हवा प्रत्येक लाइन पर कम से कम 20 पीएसआई के इनलेट दबाव का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हैं।
- प्रोसेसर चालू करें और पुष्टि करें कि स्टार्टअप पर कोई त्रुटि याँ नहीं हैं। यदि आवश्यक हो, तो घड़ी को सही समय पर सेट करें। प्रोसेसर को बंद करें।
- सुनिश्चित करें कि सेल गिनती, मात्रा, और कुल सीडी 4 + और टी सेल शुरुआती सामग्री की कुल सीडी 8 + गिनती ज्ञात है।
- सुनिश्चित करें कि पूरे विनिर्माण रन के लिए वायरल वेक्टर, अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों की पर्याप्त मात्रा है।
- रात भर पिघलने के लिए रेफ्रिजरेटर में मानव एबी सीरम की एक बोतल रखें।
3. दिन 0: ट्यूबिंग सेट स्थापना
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन/एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (पीबीएस/ईडीटीए) बफर में 3 लीटर प्रोसेसिंग बफर (0.5% (डब्ल्यू/वी) ह्यूमन सीरम एल्बुमिन (एचएसए) तैयार करें।
- 2 लीटर कल्चर माध्यम तैयार करें (2 लीटर माध्यम को 100 मिलीलीटर मानव एबी सीरम के साथ 5% की अंतिम एकाग्रता के लिए पूरक किया जाता है और पुनः संयोजक मानव आईएल 2 की दो शीशियों को 25 μg / शीशी पर पूरक किया जाता है; इन अभिकर्मकों के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)। 10 एमएल कल्चर माध्यम को 20 एमएल अभिकर्मक बैग में स्थानांतरित करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- उपकरण चालू करें और टच स्क्रीन इंटरफ़ेस से टी सेल ट्रांसडक्शन प्रक्रिया (टीसीटी) का चयन करें। TCT प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए चलाएँ क्लिक करें; उपकरण को ऑन-स्क्रीन निर्देशों और संकेतों का उपयोग करके प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करने दें।
- पैरामीटर इनपुट स्क्रीन पर, ऑपरेटर के आद्याक्षर, टयूबिंग सेट लॉट नंबर और संकेत दिए जाने पर इसकी समाप्ति तिथि दर्ज करें।
- प्रक्रिया सेटअप स्क्रीन चार अलग-अलग प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करता है। पूर्ण प्रक्रिया चुनें (1).
नोट: अन्य उपलब्ध प्रक्रियाओं में CD4+/CD8+ चयनित T कक्षों से प्रारंभ करना (नीचे अनुभाग 5 देखें) और पहले निरस्त किए गए विनिर्माण रन को पुनरारंभ करना शामिल है. - संकेत मिलने पर, सीडी 4 + / सीडी 8 + चयन विधि को प्रतिबिंबित करने के लिए चयन अभिकर्मक की दो शीशियों का चयन करें।
- ऑन-स्क्रीन निर्देशों के अनुसार ट्यूबिंग सेट स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि सभी ल्यूर कनेक्शन तंग हैं और ट्यूबिंग सेट में कोई दोष नहीं है।
- स्वचालित ऊपरी और निचले अखंडता परीक्षण शुरू करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
नोट: एक अखंडता परीक्षण एक दोषपूर्ण टयूबिंग सेट, एक गलत तरीके से स्थापित ट्यूबिंग सेट, या मशीन के पेरिस्टालिक पंप में दोष के कारण विफल हो सकता है। हम दृढ़ता से उत्पादन चलाने के लिए हाथ पर कम से कम एक अतिरिक्त टयूबिंग सेट रखने की सलाह देते हैं। हम यह भी अनुशंसा करते हैं कि एक दूसरा टेक्नोलॉजिस्ट ट्यूबिंग सेट की सही स्थापना को सत्यापित करे। - माध्यम संलग्न करने और बफर बैग को संसाधित करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
- ट्यूबिंग सेट की स्वचालित प्राइमिंग शुरू करें।
नोट: टीसीटी प्रक्रिया प्राइमिंग के बाद 3 घंटे के भीतर जारी रहनी चाहिए। सुनिश्चित करें कि टी सेल शुरू सामग्री तैयार होगी।
4. टी सेल संवर्धन
- जब ट्रांसफर सेल उत्पाद स्क्रीन दिखाई देती है, तो क्रायोप्रिजर्व्ड टी सेल उत्पाद को पिघलाना शुरू करें।
नोट: टी कोशिकाओं की स्वीकार्य मात्रा जिसे ट्यूबिंग सेट में जोड़ा जा सकता है, 50 से 280 एमएल तक होती है। लक्ष्य की अधिकतम संख्या (CD4+ और CD8+) कक्षों का योग 3 × 109 है, और अधिकतम TNC गणना 2 × 1010 है। - पिघली हुई कोशिकाओं को 150 एमएल ट्रांसफर बैग में स्थानांतरित करें। बाँझ स्थानांतरण बैग को ट्यूबिंग सेट के एप्लिकेशन बैग में वेल्ड करें।
- क्यूसी पाउच का उपयोग करके एप्लिकेशन बैग से एक नमूना निकालें और एक सेल गिनती करें।
- CD4 और CD8 अभिकर्मक शीशियों को कनेक्ट करें।
- चयन (टी सेल संवर्धन) प्रक्रिया शुरू करें।
- संवर्धन के बाद, सेल गिनती, फ्लो साइटोमेट्री और सेल आकार विश्लेषण के लिए रीएप्लिकेशन बैग के क्यूसी पाउच से सीडी 4 + / सीडी 8 + चयनित कोशिकाओं का एक नमूना निकालें।
नोट: अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए सेल गिनती परिणाम की आवश्यकता है।
5. वैकल्पिक: CD4+/CD8+ चयनित कक्षों से प्रारंभ
- चरण 3.2 में वर्णित माध्यम तैयार करें। कोई प्रसंस्करण बफर की आवश्यकता नहीं है।
- प्रोसेसर चालू करें और प्रक्रिया सेटअप स्क्रीन पर टीएस स्थापना (3) के साथ टी सेल खेती का चयन करें। स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों और संकेतों का पालन करें.
- ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करते हुए, बफर को संसाधित करने के बजाय माध्यम के साथ ट्यूबिंग सेट को प्राइम करें।
- जब "खेती तैयार करें-कनेक्ट सेल उत्पाद" स्क्रीन दिखाई देती है, तो सीडी 4 + / सीडी 8 + चयनित टी कोशिकाओं को पिघलाना शुरू करें।
नोट: प्रक्रिया के लिए टी कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या (सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का योग) 1.0 × 108 है। - कोशिकाओं को 150 एमएल ट्रांसफर बैग में स्थानांतरित करें और 50 एमएल की अंतिम मात्रा के साथ मध्यम से पतला करें।
- बाँझ सेल निलंबन को उपकरण के पुन: आवेदन बैग में वेल्ड करें।
- सेल गिनती और सेल आकार विश्लेषण के लिए रीएप्लिकेशन बैग के क्यूसी पाउच से CD4+/CD8+ चयनित कक्षों का एक नमूना निकालें।
6. गतिविधि मैट्रिक्स की संस्कृति सेटअप और प्रोग्रामिंग
- सेल एकाग्रता और वांछित प्रारंभिक संख्या दर्ज करें (1-2 × 108 टी कोशिकाएं)।
नोट: उपकरण स्वचालित रूप से रीएप्लिकेशन बैग से उचित मात्रा को संस्कृति कक्ष में पंप करेगा और अंतिम मात्रा को 70 एमएल तक समायोजित करेगा। - ऑन-स्क्रीन निर्देशों के अनुसार सक्रियण अभिकर्मक की एक शीशी संलग्न करें।
- सीओ2 एकाग्रता के लिए 5% और संस्कृति कक्ष तापमान के लिए 39 डिग्री सेल्सियस दर्ज करें।
नोट: निर्माता 39 डिग्री सेल्सियस या उपकरण के लिए विशेष रूप से कैलिब्रेटेड मान दर्ज करने की सिफारिश करता है। - गतिविधि मैट्रिक्स सेट करें। एन्हांस्ड फीडिंग प्रोटोकॉल को एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग करें और प्रोटोकॉल के भीतर व्यक्तिगत चरणों को उपयोगकर्ता-परिभाषित विनिर्देशों (चित्रा 2) में संशोधित करें।
- सुनिश्चित करें कि सीडिंग (दिन 1) के बाद पारगमन गतिविधि का समय 24 घंटे है।
- सुनिश्चित करें कि कल्चर वॉश गतिविधि का समय पारगमन (दिन 3) के बाद 48 घंटे है।
- कल्चर वॉश की शुरुआत के बाद सक्रिय शेकर ( शेकर टाइप 2) का समय 30 मिनट तक सेट करें।
- किसी भी मीडियम बैग एक्सचेंज और वेस्ट बैग एक्सचेंज गतिविधियों को हटाएँ।
- साधना शुरू करने के लिए स्क्रीन पर ओके टच करें।
- यदि आवश्यक हो, तो भविष्य में उपयोग के लिए एप्लिकेशन बैग में किसी भी बचे हुए सीडी 4 + / सीडी 8 + चयनित कोशिकाओं को क्रायोसंरक्षित करें।
7. दिन 1: टी सेल ट्रांसडक्शन
- वांछित एमओआई के आधार पर उपयोग करने के लिए लेंटिवायरल वेक्टर की मात्रा की गणना करें।
- 10 एमएल कल्चर माध्यम युक्त 20 एमएल अभिकर्मक बैग को पुनः प्राप्त करें जिसे रात भर 4 ºC पर संग्रहीत किया गया था (चरण 3.2)। वेक्टर शीशी को पिघलाएं और 7.1 में गणना की गई मात्रा को 20 एमएल अभिकर्मक बैग में स्थानांतरित करें।
नोट: हम प्रतिधारण या अनुसंधान और विकास के लिए किसी भी बचे हुए वेक्टर को फ्रीज करने की सलाह देते हैं। - भविष्य में पारगमन के समय को 2 मिनट तक सेट करने के लिए गतिविधि मैट्रिक्स को संशोधित करें। संकेत दिए जाने पर, पारगमन गतिविधि शुरू करने के लिए ठीक स्पर्श करें।
- ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करते हुए वेक्टर बैग को ट्यूबिंग सेट पर बाँझ वेल्ड करें।
- पारगमन गतिविधि प्रारंभ होने के वास्तविक समय के आधार पर गतिविधि मैट्रिक्स को संशोधित करें।
नोट: हम सुझाव देते हैं कि सामान्य कामकाजी घंटों के दौरान हाथों पर गतिविधियों को सुनिश्चित करने के लिए सीडिंग के बाद 20-24 घंटे के भीतर पारगमन शुरू करें।- सुनिश्चित करें कि कल्चर वॉश का समय ट्रांसडक्शन (दिन 3) के बाद 48 घंटे है।
- कल्चर वॉश (दिन 3) के बाद सक्रिय शेकर ( शेकर टाइप 2) का समय 30 मिनट तक सेट करें।
- सुनिश्चित करें कि मीडिया एक्सचेंज का समय दिन 6 की दोपहर (1 बजे) में है।
8. दिन 6: पहला इन-प्रोसेस नमूना
- नमूना बटन स्पर्श करें और सक्रिय संस्कृति से QC नमूना प्राप्त करने के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें.
- सेल काउंट, फ्लो साइटोमेट्री और सेल आकार विश्लेषण करें। ग्राम दाग के लिए नमूने का 1 एमएल भेजें।
नोट: संस्कृति विकास की निगरानी के लिए सेल गणना लगभग हर दूसरे दिन दोहराई जानी चाहिए। - संस्कृति माध्यम का एक और 2 एल तैयार करें (चरण 3.2 देखें)।
- गतिविधि मैट्रिक्स में एक मध्यम बैग विनिमय गतिविधि जोड़ें, जिसे भविष्य में 2 मिनट शुरू करने के लिए निर्धारित किया गया है। भविष्य में 20 मिनट प्रारंभ करने के लिए मीडिया एक्सचेंज गतिविधि समायोजित करें। स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें.
नोट: मीडिया एक्सचेंज खेती कक्ष में संस्कृति माध्यम का प्रतिस्थापन है। मीडियम बैग एक्सचेंज इंस्ट्रूमेंट पर टंगे कल्चर मीडियम बैग का प्रतिस्थापन है।
9. फसल का दिन (7 से 13 दिन तक कहीं भी): फसल और क्रायोप्रिजर्वेशन
- नमूना बटन स्पर्श करें और सक्रिय संस्कृति से QC नमूना प्राप्त करने के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें.
- क्यूसी नमूने को 1 एमएल के तीन एलिकोट में अलग करें। फ्लो साइटोमेट्री, सेल काउंट और सेल आकार विश्लेषण के लिए 1 एमएल का उपयोग करें। माइकोप्लाज्मा, वेक्टर कॉपी नंबर, प्रतिकृति-सक्षम लेंटिवायरस और एंडोटॉक्सिन परीक्षण के लिए 1 एमएल का उपयोग करें। ग्राम दाग के लिए अंतिम 1 एमएल भेजें।
- अंतिम फॉर्मूलेशन बफर तैयार करें (2 एल बैग में 4% एचएसए के साथ पूरक एक बाँझ आइसोटोनिक क्रिस्टलॉइड समाधान, सामग्री की तालिका देखें)। बाद के चरण में क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान तैयार करने के लिए इस बफर के 100 एमएल को बचाएं।
- भविष्य में संस्कृति के अंत का समय 2 मिनट तक सेट करने के लिए गतिविधि मैट्रिक्स को संशोधित करें और अन्य सभी शेष गतिविधियों को हटा दें। टयूबिंग सेट में अंतिम फॉर्मूलेशन बफर संलग्न करने और फसल शुरू करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
नोट: प्रोसेसर स्वचालित रूप से लक्ष्य सेल बैग में कक्षों को स्थानांतरित करेगा। मात्रा 100 एमएल होगी। - लक्ष्य सेल बैग क्यूसी पाउच से 0.5 एमएल नमूना लें और सेल गिनती करें।
- लक्ष्य सेल बैग को सील करें और इसे ट्यूबिंग सेट से हटा दें। सीएआर-टी उत्पाद को उचित खुराक में विभाजित करें और उन्हें नियंत्रित-दर फ्रीजर में क्रायोप्रिजर्व करें। तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक के वाष्प चरण में कोशिकाओं को ≤ -150 ºC पर स्टोर करें।
नोट: अंतिम सूत्रीकरण और खुराक का एलिकोटिंग प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट हैं। हम यहां एक उदाहरण प्रदान करते हैं जिसमें सीएआर-टी कोशिकाओं और क्यूसी शीशियों की तीन समान खुराक क्रायोप्रिजर्व हैं। विवरण के लिए अनुभाग 10 देखें। - उपकरण से प्रक्रिया डेटा डाउनलोड करें, ट्यूबिंग सेट को निकालें और निपटाएं, और शटडाउन करें।
10. सीएआर-टी कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन।
नोट: यह प्रोटोकॉल मानता है कि सीएआर-टी कोशिकाओं को निर्माण के बाद क्रायोसंरक्षित किया जाता है और तब तक संग्रहीत किया जाता है जब तक कि रोगी जलसेक के लिए तैयार न हो। हालांकि ताजा निर्मित सीएआर-टी कोशिकाओं को शामिल करना संभव है, लेकिन इससे लॉजिस्टिक बोझ बढ़ जाता है क्योंकि इसके लिए सीएआर-टी सेल इन्फ्यूजन के साथ सीएआर-टी सेल विनिर्माण के समन्वय की आवश्यकता होती है। विनिर्माण विफलता के मामले में यह समस्याग्रस्त हो सकता है। विशेष रूप से यदि नैदानिक प्रोटोकॉल को सीएआर-टी जलसेक से पहले लिम्फोडेजिंग कीमोथेरेपी की आवश्यकता होती है, तो हम दृढ़ता से क्रायोप्रिजर्विंग का सुझाव देते हैं, क्योंकि विनिर्माण विफलता रोगी को अनावश्यक कीमोथेरेपी के जोखिम में उजागर कर सकती है। नियामकों को जांचकर्ताओं को यह प्रदर्शित करने की आवश्यकता हो सकती है कि उत्पाद जलसेक से पहले सभी रिलीज परीक्षण ों को पारित करता है, जो क्रायोप्रिजर्वेशन के बिना प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है।
- काटे गए उत्पाद के अंतिम 100 एमएल से, अतिरिक्त रिलीज परीक्षण (जैसे, व्यवहार्यता), प्रतिधारण और बाँझपन नमूना करने के लिए वांछित सीएआर-टी खुराक और गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) शीशियों को पूरा करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करें और निकालें।
नोट: अंतिम उत्पाद को अलिकोट करने के लिए पूरी तरह से परिभाषित रणनीति विकसित करना महत्वपूर्ण है। हम उत्पाद की कई खुराक बनाने का सुझाव देते हैं ताकि रीइन्फ्यूजन की अनुमति मिल सके, यह देखते हुए कि पर्याप्त सामग्री उपलब्ध है। एक बैग में 10-20 एमएल की उत्पाद मात्रा सिरिंज पुश द्वारा तेजी से पिघलने और आसान जलसेक की अनुमति देती है। प्रत्येक उत्पाद को वांछित सीएआर-टी सेल खुराक (जैसे, 5 × 106 सीएआर-टी सेल प्रति किलोग्राम या 2.5 × 108 सीएआर-टी कोशिकाओं) में भरने की सिफारिश की जाती है क्योंकि इससे जलसेक के दिन खुराक गणना की आवश्यकता से बचा जा सकेगा। इसके अलावा सिफारिश की जाती है कि कम से कम चार क्यूसी शीशियों को क्रायोरिजर्व करें और इस संभावना के लिए लेखांकन करें कि बची हुई सामग्री हो सकती है; हम इस सामग्री को सहेजने का सुझाव देते हैं क्योंकि यह अनुसंधान और विकास उद्देश्यों के लिए उपयोगी हो सकता है। - मात्रा को कम करने के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- चरण 9.3 में रखे गए अंतिम फॉर्मूलेशन बफर के हिस्से का उपयोग करके उत्पाद को वांछित अंतिम मात्रा के आधे हिस्से तक लाएं।
- अंतिम फॉर्मूलेशन बफर में 20% डीएमएसओ समाधान बनाकर 2एक्स क्रायोप्रोटेक्टेंट तैयार करें।
नोट: क्रायोप्रोटेक्टेंट फॉर्मूलेशन और डीएमएसओ एकाग्रता को संशोधित किया जा सकता है। - 10% की अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता के लिए समान मात्रा में कोशिकाओं में 2x क्रायोप्रोटेक्टेंट जोड़ें।
नोट: क्रायोप्रोटेक्टेंट के लिए उत्पाद के जोखिम की अवधि को कम से कम किया जाना चाहिए। - खुराक बैग और क्यूसी शीशियों को भरें। बाँझपन के लिए 1 एमएल भेजें।
नोट: नियामकों को आमतौर पर अंतिम उत्पाद पर किए गए 14-दिवसीय बाँझपन परख की आवश्यकता होती है। हालांकि, तेजी से बाँझपन परख उभर रहे हैं; इस समय, 14-दिवसीय विधि सबसे आम है। - एक नियंत्रित-दर फ्रीजर का उपयोग करके क्रायोप्रिजर्व उत्पादों।
नोट: नियंत्रित-दर फ्रीजर कार्यक्रम को ~ -1 ºC / min से ~ -45 ºC की शीतलन दर का उत्पादन करने के लिए मान्य किया जाना चाहिए, जिसमें यूटेकटिक बिंदु के लिए मुआवजा है। - उत्पाद को ≤ -150 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन अल्ट्रालो फ्रीजर के वाष्प चरण में स्टोर करें।
11. प्रक्रिया प्रदर्शन की परीक्षा
नोट: टीसीटी प्रक्रिया के दौरान, सक्रिय संस्कृति से कई क्यूसी नमूने तैयार किए जाते हैं। तालिका 2 एक ग्रिड प्रदान करती है जो पाठक को संदर्भ के लिए परिणामों को व्यवस्थित करने और प्रक्रिया प्रदर्शन मैट्रिक्स की गणना करने में मदद कर सकती है। नीचे दिए गए शब्द जिसमें एक अक्षर और एक संख्या (जैसे, "बी 4") शामिल हैं, इस तालिका के ग्रिड में कोशिकाओं को संदर्भित करते हैं। प्रदर्शन गणना में निम्नलिखित मूल्यों का उपयोग किया जाता है: बी 3 = कुल न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं (टीएनसी) पूर्व-संवर्धन; बी 4 = टीएनसी पोस्ट-संवर्धन; ई 2 = प्रारंभिक एफेरेसिस उत्पाद की कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का योग; ई 4 = संवर्धन के बाद कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का योग; प्रारंभिक उत्पाद की कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में जी 2 = सीडी 1 9 + कोशिकाएं; सीडी 4 + / सीडी 8 + संवर्धन के बाद कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में जी 4 = सीडी 1 9 + कोशिकाएं; बी 10 = फसल के दिन सक्रिय संस्कृति का टीएनसी।
तालिका 2: प्रक्रिया प्रदर्शन ग्रिड। हम प्रक्रिया प्रदर्शन आंकड़ों की गणना करने के लिए आवश्यक इन-प्रोसेस टेस्ट रिल्ट को व्यवस्थित करने में मदद करने के लिए इस ग्रिड को प्रदान करते हैं। पंक्तियाँ प्रक्रिया के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर विश्लेषण किए गए नमूनों का प्रतिनिधित्व करती हैं और उन्हें संख्या 1-11 के साथ लेबल किया जाता है। पंक्तियों 6-9 का उपयोग खेती के 6 वें दिन के बाद लेकिन फसल के दिन से पहले लिए गए नमूनों से परिणामों को कैप्चर करने के लिए किया जा सकता है। कॉलम मापा मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं और उन्हें ए-एच अक्षरों के साथ लेबल किया जाता है। छायांकित ग्रे फ़ील्ड लागू नहीं होते हैं. कुछ अतिरिक्त क्षेत्र इस बात पर निर्भर नहीं हो सकते हैं कि सीडी 4 + / सीडी 8 + संवर्धन प्रक्रिया के हिस्से के रूप में किया जाता है या नहीं और खेती की लंबाई है। हम उन क्षेत्रों में "एन / ए" लिखने का सुझाव देते हैं। संक्षेप: टीएनसी = कुल न्यूक्लियेटेड सेल गिनती; क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
- समीकरण (1) का उपयोग करके संवर्धन से पहले CD4+ प्लस CD8+ T कोशिकाओं की कुल संख्या को CD4+ प्लस CD8+ T कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित करके चयन के बाद CD4+/CD8+ कोशिकाओं की वसूली की गणना करें।
CD4+/CD8+ T सेल पुनर्प्राप्ति =
(1) - संवर्धन से पहले CD4+/CD8+ संवर्धन के बाद CD19+ कोशिकाओं की कुल संख्या को CD19+ संवर्द्धन के बाद कुल संख्या से विभाजित करके संवर्धन के बाद CD19+ कोशिकाओं की कमी की गणना कीजिए। चूंकि यह संख्या बहुत कम होने की उम्मीद है, इसलिए समीकरण (2) में दिखाए गए अनुसार इस अंश के लघुगणक की रिपोर्ट करें:
लॉग CD19 सेल की कमी = लॉग10
(2) - समीकरण (3) का उपयोग करके बीज ति कोशिकाओं की संख्या से फसल के समय सक्रिय संस्कृति में कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित करके कुल गुना वृद्धि की गणना करें:
कुल गुना वृद्धि =
(3) - समीकरण (4) का उपयोग करके फसल के दिन के संबंध में कुल गुना वृद्धि की जड़ लेकर औसत दैनिक वृद्धि की गणना करें:
औसत दैनिक वृद्धि = फसल √ का दिन (कुल गुना वृद्धि) (4)
(1)
(2)
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Representative Results
NCT05480449 परीक्षण के प्रारंभिक तीन सीएआर-टी विनिर्माण रन के परिणाम तालिका 3 में नीचे प्रस्तुत किए गए हैं। प्रारंभिक सामग्री, वेक्टर, कल्चर साइटोकिन्स और एबी सीरम सांद्रता को प्रत्येक रन के लिए सुसंगत रखा गया था। उत्पादों को 7 या 8 वें दिन काटा गया था। औसत दैनिक सेल वृद्धि 46% (कुल सेल गिनती में वृद्धि) थी, यह दर्शाता है कि टीसीटी प्रक्रिया सेल विस्तार को बढ़ावा देने में प्रभावी थी। इन परिणामों से पता चलता है कि प्रोसेसर सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सीएआर-टी सेल उत्पादों का उत्पादन कर सकता है।
तालिका 4 में सारांशित अंतिम उत्पाद परीक्षण के परिणाम दर्शाते हैं कि सीएआर-टी कोशिकाओं ने गुणवत्ता नियंत्रण मानकों को पारित किया है। सेल वाइबिलिटी 88% और 94% के बीच थी, और सीडी 3 टी सेल शुद्धता 89-93% थी। महत्वपूर्ण रूप से, एंडोटॉक्सिन, माइकोप्लाज्मा, बाँझपन, प्रतिकृति-सक्षम लेंटिवायरस और अवशिष्ट ल्यूकेमिक कोशिकाओं का पता लगाने योग्य नहीं थे। ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि टीसीटी प्रक्रिया उच्च गुणवत्ता वाले सीएआर-टी कोशिकाओं का उत्पादन करती है जो नैदानिक उपयोग के लिए नियामक मानकों को पूरा करती हैं।
इस प्रक्रिया के लिए तीन फ्लो साइटोमेट्री पैनल विकसित किए गए थे (चित्रा 3)। इनमें सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए परीक्षण करने के लिए सीडी 4 / सीडी 8 पैनल, पारगमन दक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए सीडी 1 9 सीएआर-टी पैनल, और अंतिम उत्पाद में व्यवहार्यता और अवशिष्ट ल्यूकेमिक (सीडी 1 9 +) कोशिकाओं की व्यवहार्यता और सामग्री निर्धारित करने के लिए सीडी 3 / सीडी 1 9 पैनल शामिल हैं। इन पैनलों के परिणाम सीएआर-टी कोशिकाओं के सफल निर्माण और अंतिम उत्पाद में अवशिष्ट ल्यूकेमिक कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करते हैं।
कुल मिलाकर, परिणाम बताते हैं कि टीसीटी प्रक्रिया नैदानिक उपयोग के लिए उपयुक्त सुसंगत और उच्च गुणवत्ता वाले सीएआर-टी सेल उत्पादों का उत्पादन कर सकती है।
चित्रा 3: फ्लो साइटोमेट्री परख। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति को प्रत्येक पैनल के लिए दर्शाया गया है। गेट्स को काले बक्से या दीर्घवृत्त के रूप में खींचा जाता है और लेबल किया जाता है, और नीले तीर गेटिंग की दिशा को इंगित करते हैं। (ए) सीडी 4 / सीडी 8 पैनल। बी कोशिकाओं को सीडी 19 + उपसमूह के रूप में और टी कोशिकाओं को लिम्फ गेट के सीडी 3 + उप-समूह के रूप में परिभाषित किया गया है। सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाएं टी सेल गेट के उपसमुच्चय हैं। (बी) सीडी 19 सीएआर-टी पैनल। CAR+ T कोशिकाओं को CD3+ T कोशिकाओं के CD19-CAR+ उपसमुच्चय के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके अलावा, CD4+ और CD8+ उपसमुच्चय जो CD19 CAR+ हैं, की गणना की जाती है। (सी) सीडी 3 / सीडी 19 पैनल। यह पैनल CD4/CD8 पैनल के समान है, सिवाय इसके कि यह CD4 और CD8 मार्करों को छोड़ देता है. संक्षेप: एसएससी-ए = साइड स्कैटर क्षेत्र; लसीका = लिम्फोसाइट; सीडी 19-सीएआर = सीडी 19-विशिष्ट चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर; 7AAD = 7-aminoactinomycin D. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| चलाना # | प्रारंभिक सामग्री | वायुपथ | संस्कृति साइटोकिन्स; | एबी सीरम % | अंतिम टीएनसी | कुल सीएआर-टी कोशिकाओं की कटाई | कुल गुना वृद्धि | औसत दैनिक वृद्धि | फसल दिवस | ||
| 1 | रोगी टी सेल, एफेरेसिस, क्रायोसंरक्षित |
huCART19 | IL2 | 5% | 2.75x109 | 2.24x108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | रोगी टी सेल, एफेरेसिस, क्रायोसंरक्षित |
huCART19 | IL2 | 5% | 4.15x109 | 1.14x108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | रोगी टी सेल, एफेरेसिस, क्रायोसंरक्षित |
huCART19 | IL2 | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
तालिका 3: तीन नैदानिक पैमाने पर सीएआर-टी विनिर्माण रन के पैरामीटर और विकास विशेषताएं। NCT05480449 नैदानिक परीक्षण के लिए प्रोसेसर का उपयोग करके पहले तीन रोगी निर्माण रन के लिए संस्कृति की स्थिति, विकास और फसल के दिन के बारे में विवरण दिखाया गया है। - एचयूकार्ट 19, मानवकृत सीडी 19-निर्देशित सीएआर लेंटिवायरल वेक्टर। ध्यान दें कि इन उत्पादों के लिए पारगमन दक्षता और व्यवहार्यता तालिका 4 में दिखाई गई है। संक्षेप: सीएआर-टी कोशिकाएं = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाएं; टीएनसी = कुल न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं।
| रिलीज परीक्षण | ||||||||||
| जाँच | सेल व्यवहार्यता | CD3 % | एंडोटॉक्सिन | माइको-प्लाज्मा | पारगमन दक्षता | अवशिष्ट ल्यूकेमिक कोशिकाएं | बाँझपन दिवस 14 | वेक्टर डीएनए अनुक्रम प्रति सेल | वेक्टर डीएनए अनुक्रम प्रति ट्रांसड्यूस्ड सेल | प्रतिकृति सक्षम लेंटीवायरस |
| विस्तृत जानकारी | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3.5 EU / mL |
नेगटिव | ≥ 2% | < 1% | कोई वृद्धि नहीं | रिपोर्ट परिणाम | 0.04-8 प्रतियां/ट्रांसड्यूस्ड सेल। |
< 50 प्रतियां/ μजी डीएनए |
| परिणाम | ||||||||||
| चलाएँ 1 | 90 | 89 | <0.4 | नेगटिव | 36 % | नहीं पाया |
नहीं वृद्धि |
1.04 | 2.89 | नहीं पाया |
| चलाएँ 2 | 88 | 93 | <0.4 | नेगटिव | 39 % | नहीं पाया |
नहीं वृद्धि |
1.16 | 2.97 | नहीं पाया |
| 3 चलाएँ | 94 | 91 | <0.4 | नेगटिव | 18 % | नहीं पाया |
नहीं वृद्धि |
0.43 | 2.39 | नहीं पाया |
तालिका 4: अंतिम उत्पाद परीक्षण और रिलीज विनिर्देश। इस तालिका में दिखाए गए विनिर्देश NCT05480449 नैदानिक परीक्षण (आईएनडी 28617) के लिए हैं। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पोस्ट-पिघलाव व्यवहार्यता, सीडी 3%, पारगमन दक्षता और अवशिष्ट ल्यूकेमिक सेल सामग्री को मापा गया था। एंडोटॉक्सिन को एफडीए-लाइसेंस प्राप्त लिम्यूलस एमेबोसाइट लाइसेट-आधारित क्रोमोजेनिक परीक्षण का उपयोग करके मापा गया था। बाँझपन परीक्षण एक यूएसपी <71> अनुरूप विधि का उपयोग करके किया गया था। माइकोप्लाज्मा, वेक्टर डीएनए अनुक्रम संख्या प्रति सेल और प्रतिकृति-सक्षम लेंटीवायरस को मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके मापा गया था। प्रति ट्रांसड्यूस्ड सेल वेक्टर डीएनए अनुक्रम संख्या की गणना वेक्टर डीएनए अनुक्रम संख्या को पारगमन दक्षता द्वारा विभाजित करके की गई थी। संक्षेप: ईयू = एंडोटॉक्सिन इकाई; आईएनडी = जांच नई दवा; एफडीए = खाद्य और औषधि प्रशासन।
पूरक चित्रा एस 1: टीसीटी प्रक्रिया का उपयोग करके निर्मित सीएआर-टी कोशिकाओं का प्रीक्लिनिकल परीक्षण। इम्यूनोडेफिशिएंसी (एनएसजी) चूहों को 0 वें दिन रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट ल्यूकेमिया कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था और बाद में प्रोसेसर ("सेमी-ऑटोमैटिक मैन्युफैक्चरिंग"), पारंपरिक रूप से निर्मित सीडी 19-निर्देशित सीएआर-टी कोशिकाओं ("मानक विनिर्माण"), या 7 वें दिन खारा पर निर्मित सीडी 19-निर्देशित सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया था। (ए, बी) खारा (दोनों खुराक स्तरों के लिए पी < 0.0001) की तुलना में दो खुराक स्तरों (0.5 × 10 6 या 2 × 106 सीएआर-टी कोशिकाओं) पर अर्ध-स्वचालित विनिर्माण सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए चूहों का अस्तित्व। (ग) मानक कोशिकाओं (05 × 106 सीएआर-टी कोशिकाओं) के लिए गैर-उपचारात्मक माने जाने वाले खुराक स्तर पर मानक विनिर्माण सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ अर्ध-स्वचालित की तुलना। प्रोसेसर (पी = 0.001) से सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए चूहों में उत्तरजीविता काफी बेहतर थी। (घ) मानक सीडी19 सीएआर-टी कोशिकाओं के लिए उपचारात्मक माने जाने वाले खुराक स्तर पर मानक विनिर्माण सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ अर्ध-स्वचालित की तुलना। उत्तरजीविता काफी अलग नहीं थी (पी = 0.4)। (ई) दो खुराक स्तरों पर प्रोसेसर से सीएआर-टी कोशिकाओं की तुलना। 2 × 106 huCART19 कोशिकाओं (p = 0.007) के साथ इलाज किए गए चूहों में बेहतर अस्तित्व के साथ एक महत्वपूर्ण खुराक प्रभाव देखा गया था। प्रत्येक समूह में 5 चूहे थे। संक्षेप: एनएसजी = एनऑन-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह एकसंयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी जीअम्मा; टीसीटी = टी सेल ट्रांसडक्शन; सीएआर-टी = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2: मानव एबी सीरम के विभिन्न लॉट के साथ पूरक माध्यम में संवर्धित मानव टी कोशिकाओं के विकास और लेंटिवायरल पारगमन की तुलना। (ए) मानव एबी सीरम (7 जे, 22 ए, या 21 जे) के तीन अलग-अलग लॉट के साथ पूरक संस्कृतियों में सीडी 19 सीएआर-टी लेंटिवायरल वेक्टर (सीएआर 19) के साथ मानव टी कोशिकाओं का विस्तार (यूटीडी) या ट्रांसड्यूस किया गया। लॉट (22 ए) में से एक के लिए विकास दर दो अन्य की तुलना में काफी अधिक थी। (बी) स्वस्थ दाताओं से प्राप्त पूर्व विवो-विस्तारित टी कोशिकाओं की सीडी 3 + और सीडी 3 + / सीडी 4 + या सीडी 3 + / सीडी 8 + उप-आबादी में सीएआर 19 + कोशिकाओं का औसत प्रतिशत (3 प्रतिकृतियां)। ध्यान दें कि विकास दर में अंतर विस्तारित संस्कृतियों से कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा निर्धारित लेंटिवायरस लेने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को प्रभावित नहीं करता है। टी कोशिकाओं और सीडी 4 + और सीडी 8 + उप-आबादी की पारगमन दक्षता संस्कृति से संस्कृति तक सुसंगत थी। त्रुटि पट्टियाँ 3 दोहराई जाने वाली संस्कृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
सीएआर-टी सेल थेरेपी बी-सेल और अन्य विकृतियों के लिए एक आशाजनक उपचार दृष्टिकोण के रूप में उभरा है। हालांकि, पारंपरिक सीएआर-टी सेल विनिर्माण विधियों में कई सीमाएं हैं, जैसे कि उच्च लागत, श्रम-गहन उत्पादन, और खुले कदम जो संदूषण के जोखिम को बढ़ाते हैं। हाल ही में, इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए मिल्टेनी क्लिनीएमएसीएस प्रोडिजी ("प्रोसेसर") सहित कई अर्ध-स्वचालित प्लेटफॉर्म उभरे हैं। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोसेसर में एकीकृत टी सेल ट्रांसडक्शन (टीसीटी) प्रक्रिया में टी सेल संवर्धन, सक्रियण, वायरल पारगमन, संस्कृति विस्तार और एक बंद प्रणाली में फसल शामिल है। प्रतिस्पर्धी स्वचालित सेल प्रोसेसर प्लेटफ़ॉर्म इस समय कम व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, लेकिन संस्कृति मापदंडों, अनुकूल उपकरण या सामग्री लागत, या एक छोटे पदचिह्न की बेहतर प्रक्रिया निगरानी हो सकती है, जो एक समर्पित क्लीनरूम स्पेस के बजाय जैव सुरक्षा कैबिनेट में उपयोग की अनुमति दे सकती है। एक ऐसा मंच चुनना महत्वपूर्ण है जो किसी दिए गए एप्लिकेशन और वातावरण के लिए बेहतर रूप से अनुकूल हो।
सीएआर-टी सेल थेरेपी जैसे सेल और जीन थेरेपी की एक महत्वपूर्ण सीमा वाणिज्यिक उत्पादों की उच्च लागत है, जो जीवन रक्षक चिकित्सा तक पहुंच को सीमित करती है। यह विशेष रूप से संसाधन-गरीब सेटिंग्स और गैर-प्रथम-दुनिया के देशों में मामला है। हमने पाया है कि एक अकादमिक अस्पताल की स्थापना में अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया को तैनात करते समय एक तुलनीय वाणिज्यिक उत्पाद की तुलना में नाटकीय रूप से कम लागत पर सीएआर-टी कोशिकाओं का निर्माण करना संभव है, जिसमें स्टेम सेल प्रयोगशाला के संदर्भ में मौजूदा गुड मैन्युफैक्चरिंग प्रैक्टिस (सीजीएमपी) -अनुरूप क्लीनरूम सुविधाएं हैं और एक नैदानिक प्रयोगशाला का समर्थन है जो कुछ इन-प्रोसेस और रिलीज परीक्षण कर सकता है। इन परिस्थितियों में, हम पाते हैं कि विनिर्माण के लिए सामग्री और श्रम सहित विनिर्माण चलाने की सीमांत लागत और सभी इन-प्रोसेस और रिलीज परीक्षण (लेकिन उपकरण और सुविधाओं सहित नहीं) लगभग $ 30,000 है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोसेसर की उपकरण पूंजी लागत एकल वाणिज्यिक सीएआर-टी सेल उत्पाद की लागत से कम है।
मैनुअल से स्वचालित विधि पर स्विच करने के साथ संभावित चिंताओं में से एक लचीलापन कम है। टीसीटी प्रक्रिया, जबकि मजबूत गार्डरेल के साथ प्रोग्राम की गई है, अभी भी बड़े पैमाने पर अनुकूलन योग्य है। प्रक्रिया कई शुरुआती बिंदु प्रदान करती है, जिसमें टी सेल संवर्धन के साथ एक पूर्ण प्रक्रिया, संवर्धन के बिना एक पूर्ण प्रक्रिया (उदाहरण के लिए, सीडी 4 + / सीडी 8 + पूर्व-समृद्ध कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए, ऊपर प्रोटोकॉल का अनुभाग 5 देखें), और एक निरस्त प्रक्रिया को फिर से शुरू करना शामिल है। इसके अतिरिक्त, गतिविधि मैट्रिक्स सुविधा पूरी खेती प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए अनुमति देती है। तेजी से सीएआर-टी विनिर्माण में बढ़ती रुचि के साथ, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यदि वांछित हो तो पारगमन के कुछ घंटों बाद फसल शुरू करने के लिए गतिविधि मैट्रिक्स को कॉन्फ़िगर करना संभव है। तेजी से प्रक्रिया में विनिर्माण समय में कमी और एंटी-ल्यूकेमिकगतिविधि के नुकसान से बचने और अधिक शक्तिशाली उत्पाद का संभावित दोहरा लाभ है। इसके अलावा, टीसीटी का एक संस्करण इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके गैर-वायरल वैक्टर के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो सिस्टम के लचीलेपन को और बढ़ाता है।
सीएआर-टी कोशिकाओं के लिए इष्टतम फसल का समय विभिन्न कारकों पर निर्भर करता है, जिसमें वांछित लक्ष्य खुराक, आवश्यक खुराक की संख्या और अधिकतम सेल घनत्व शामिल है जो संस्कृति पोत सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना समर्थन कर सकता है। निर्माता 250 एमएल की मात्रा में 5 बिलियन कोशिकाओं से अधिक नहीं होने की सिफारिश करता है। वांछित लक्ष्य खुराक का निर्धारण एक पशु मॉडल में प्रीक्लिनिकल डेटा पर आधारित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, हमने एनओडी स्सिड गामा नॉकआउट (एनएसजी) चूहों का उपयोग रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकेमिक जेनोग्राफ्ट्स के साथ इंजेक्शन दिया और सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ इलाज किया ताकि यह अनुमान लगाया जा सके कि एक प्रभावी खुराक लगभग 2 से 5 मिलियन सीएआर-टी कोशिकाओं प्रति किलोग्राम (पूरक चित्रा एस 1) के बीच होगी। सीएआर-टी कोशिकाओं की कटाई के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने में सेल के आकार की निगरानी भी उपयोगी हो सकती है। इन कारकों पर सावधानीपूर्वक विचार करके, शोधकर्ता यह सुनिश्चित करने के लिए सीएआर-टी कोशिकाओं के फसल समय को अनुकूलित कर सकते हैं कि अंतिम उत्पाद उच्च गुणवत्ता और प्रभावकारिता का है।
एक उपयुक्त रिलीज परीक्षण योजना विकसित करना आईएनडी आवेदन के लिए अनुमोदन प्राप्त करने का एक महत्वपूर्ण घटक है। हम अपने आईएनडी 28617 के लिए विनिर्देशों सहित रिलीज परीक्षणों का एक सेट प्रस्तुत करते हैं, और हमारा मानना है कि यह समान उत्पादों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु होगा। हालांकि, नियामकों की राय लगातार विकसित हो रही है, और प्रस्तुत प्रोटोकॉल की विविधताओं से नियामकों को अलग-अलग परीक्षणों या विभिन्न विनिर्देश थ्रेसहोल्ड की आवश्यकता हो सकती है। हम दृढ़ता से वर्तमान नियामक मार्गदर्शन दस्तावेजों जैसे एफडीए के रसायन विज्ञान, विनिर्माण और नियंत्रण (सीएमसी) मानव जीन थेरेपी जांच नई दवा अनुप्रयोगों (आईएनडी) 13 के लिए जानकारी को बारीकी से पढ़ने की सलाह देते हैं। एक सामान्य सिद्धांत यह है कि किसी उत्पाद की सुरक्षा का प्रदर्शन करने वाले परीक्षणों का मूल्यांकन शक्ति का प्रदर्शन करने वाले परीक्षणों की तुलना में अधिक सख्ती से किया जाता है। आम तौर पर, बाँझपन, एंडोटॉक्सिन, माइकोप्लाज्मा और प्रतिकृति-सक्षम लेंटिवायरस जैसे परीक्षणों को मान्य किया जाना चाहिए, और उनके प्रदर्शन मानदंड ों को जाना जाना चाहिए। इसके विपरीत, प्रारंभिक चरण के परीक्षणों में शक्ति परीक्षणों पर अपेक्षाकृत कम जोर दिया जाता है और इसे पूरी तरह से मान्य करने की आवश्यकता नहीं हो सकती है। हाल ही में एफडीए मसौदा दिशानिर्देश में कहा गया है कि "शक्ति के उपाय के रूप में अकेले ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्रारंभिक चरण के आईएनडी अध्ययनों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हो सकती है"। इसके अलावा, खुराक निर्धारण के लिए उपयोग किए जाने वाले परीक्षणों को मान्य किया जाना चाहिए। यह नए सीएआर लक्ष्यों के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जिसके लिए कोई मानकीकृत प्रवाह परख या संदर्भ सामग्री नहीं हो सकती है। इस मामले के लिए, एफडीए का सुझाव है कि "एक परख के लिए संदर्भ सामग्री जीन थेरेपी उत्पाद का एक अच्छी तरह से विशेषता हो सकती है। उदाहरण के लिए, हमने शुरुआती इंजीनियरिंग रन से सीएआर-टी कोशिकाओं का उपयोग करके सीडी 19 सीएआर प्रवाह परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण स्थापित किया।
सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए विनिर्माण प्रक्रिया को विकसित करना और अनुकूलित करना चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला हो सकता है, जैसा कि हमने अपने काम में अनुभव किया है। हमें कई असफलताओं का सामना करना पड़ा, जिसमें जीवाणु संदूषण के मुद्दे भी शामिल थे। हम कोशिकाओं को पिघलाने के लिए सूखी पिघलने विधि का उपयोग करने की दृढ़ता से वकालत करते हैं, क्योंकि पानी के स्नान से संदूषण का खतरा बढ़ सकता है। खेती के कारण, यहां तक कि एक छोटा इनोकुलम भी स्पष्ट संदूषण का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक अनुपयोगी उत्पाद होता है। इसके अतिरिक्त, हम रिलीज परीक्षण के लिए रसद की योजना बनाने की सलाह देते हैं, जिसमें समय पर और सटीक परीक्षण सुनिश्चित करने के लिए बाहरी पार्टियों के साथ अतिरिक्त सत्यापन और अनुबंध शामिल हो सकते हैं। सीएआर-टी विनिर्माण प्रक्रिया विकसित करते समय एक और महत्वपूर्ण तत्व पारगमन दक्षता का अनुकूलन कर रहा है। एक आईएनडी एप्लिकेशन में वायरल वेक्टर की शक्ति को प्रदर्शित करने के लिए डेटा शामिल होना चाहिए। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए और एक ही समय में एमओआई को अनुकूलित करने के लिए जानकारी प्राप्त करने के लिए, हम दृढ़ता से मानव टी कोशिकाओं पर नैदानिक ग्रेड वायरल वेक्टर के छोटे पैमाने पर अनुमापन करने की सलाह देते हैं। माउस प्रयोगों के लिए नियंत्रण के रूप में पारंपरिक रूप से निर्मित सीएआर-टी कोशिकाओं के उपयोग पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है (जैसा कि पूरक चित्रा एस 1 में दिखाया गया है)। इन कोशिकाओं को प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है और सावधानीपूर्वक योजना की आवश्यकता होती है। विचार करने के लिए एक और कारक मानव एबी सीरम का उपयोग है, जो एक खराब परिभाषित अभिकर्मक है जो सेल विकास और उत्पाद की अन्य विशेषताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। इसे संबोधित करने के लिए, हम एबी सीरम के कई लॉट का परीक्षण करने और सेल विकास पर लॉट-विशिष्ट प्रभावों का आकलन करने के लिए छोटे पैमाने पर प्रयोग करने का सुझाव देते हैं (पूरक चित्रा एस 2)। एक बार एक उपयुक्त लॉट की पहचान हो जाने के बाद, परीक्षण समूह में स्थिरता सुनिश्चित करने और सीरम लॉट में परिवर्तन के कारण रोगी के परिणामों में बैच प्रभाव के जोखिम को कम करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी मात्रा में खरीदा जाना चाहिए।
सारांश में, प्रोसेसर और शामिल टीसीटी प्रक्रिया एक विनिर्माण विधि प्रदान करती है जो वर्तमान सीएआर-टी विनिर्माण प्रक्रियाओं की कई सीमाओं को संबोधित कर सकती है, जिसमें उच्च लागत, श्रम-गहन उत्पादन और खुले हेरफेर कदम शामिल हैं। एक बंद और अर्ध-स्वचालित प्रणाली प्रदान करके, इस प्रोसेसर में सीएआर-टी सेल थेरेपी की उपलब्धता और सामर्थ्य में सुधार करने की क्षमता है। यह तेजी से विनिर्माण और गैर-वायरल वैक्टर को समायोजित कर सकता है, जिससे यह पारंपरिक विनिर्माण विधियों का एक लचीला विकल्प बन जाता है। वांछित लक्ष्य खुराक, अधिकतम सेल घनत्व, और सेल विकास पर मानव एबी सीरम के प्रभाव जैसे कारकों पर सावधानीपूर्वक विचार करके, शोधकर्ता अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता और प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए सीएआर-टी कोशिकाओं के फसल के समय को अनुकूलित कर सकते हैं। यद्यपि प्रक्रिया जटिल और श्रमसाध्य हो सकती है, रिलीज परीक्षण के लिए रसद की योजना बनाना और संदूषण के स्रोतों को समाप्त करना जोखिम को कम करने और सफल सीएआर-टी सेल निर्माण सुनिश्चित करने में मदद कर सकता है। कुल मिलाकर, टीसीटी प्रक्रिया सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए एक आशाजनक एवेन्यू प्रस्तुत करती है, जिसमें वर्तमान सीमाओं को दूर करने और रोगी की पहुंच में सुधार करने की क्षमता है, अंततः कैंसर के रोगियों को लाभ होता है।
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Disclosures
एस.के., एस.जी., और वाई.डब्ल्यू. को मिल्टेनी बायोटेक से अनुसंधान समर्थन प्राप्त हुआ है।
Acknowledgments
लेखक इस काम में कई व्यक्तियों और संगठनों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं। सेल और जीन थेरेपी प्रयोगशाला और पेन ट्रांसलेशनल और कोररिलेटिव स्टडीज लेबोरेटरी ने आईएनडी सबमिशन के लिए प्रक्रिया विकास और तैयारी के साथ मूल्यवान सहायता प्रदान की। मेलिसा वर्गीज और अमांडा डिनोफिया ने इस पांडुलिपि के तहत आईएनडी प्रस्तुतियों के लिए प्रक्रिया विकास और तैयारी में योगदान दिया। इस काम को फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल के सेल और जीन थेरेपी सहयोगी के त्वरण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने तकनीकी और अनुसंधान समर्थन के लिए मिल्टेनी बायोटेक को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्रा 1 कॉपीराइट © 2023 मिल्टेनी बायोटेक बीवी एंड कंपनी केजी द्वारा कवर किया गया है; सभी अधिकार सुरक्षित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
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