Summary
이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.
Abstract
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 다양한 악성 및 비악성 질환 치료를 위한 유망한 면역 치료 접근법을 나타냅니다. CAR-T 세포는 세포 표면 표적을 인식하고 결합하여 표적 세포를 죽이는 키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 T 세포입니다. 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 오염 위험이 있을 수 있습니다. 자동화된 세포 프로세서인 CliniMACS Prodigy를 사용하면 폐쇄형 시스템에서 임상 규모로 세포 치료제를 제조할 수 있어 오염 위험을 최소화할 수 있습니다. 처리는 컴퓨터의 제어 하에 반자동으로 이루어지므로 프로세스에 대한 사람의 개입을 최소화하여 시간을 절약하고 변동성과 오류를 줄입니다.
이 원고와 비디오는 이 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하기 위한 T 세포 형질도입(TCT) 공정에 대해 설명합니다. TCT 과정에는 CD4+/CD8+ T 세포 농축, 활성화, 바이러스 벡터를 사용한 transduction, 확장 및 수확이 포함됩니다. 이러한 단계의 순서와 타이밍을 허용하는 기능인 활동 매트릭스를 사용하여 TCT 프로세스를 광범위하게 사용자 지정할 수 있습니다. 당사는 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 CAR-T 세포 제조에 대한 실무를 제공하고 임상시험용 신약(IND) 신청을 지원하는 필수 방출 테스트 및 전임상 실험에 대해 논의합니다. 임상 CAR-T 세포 제조를 위한 반자동 공정 사용의 타당성을 입증하고 장단점에 대해 논의합니다. 마지막으로, 소아 B세포 악성종양[NCT05480449]을 표적으로 하는 연구자 주도 임상시험을 이 제조 공정이 임상 환경에서 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 예시로 설명합니다.
Introduction
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 입양 이식은 난치성 B 세포 악성 종양 1,2,3,4,5 환자를 치료하는 데 놀라운 효능을 보여주었습니다. 그러나 CAR-T 세포의 전통적인 제조 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 고도로 전문화된 단계를 수행하기 위해 고도로 훈련된 기술자가 필요합니다. 예를 들어, 자가 CAR-T 세포 제품의 기존 제조 공정에는 밀도 구배 원심분리, T 세포를 농축하기 위한 용출 또는 자기 분리, 멸균 플라스크에서 바이러스 벡터를 사용한 활성화 및 형질도입, 수확 및 제형 전에 바이오리액터에서의 팽창이 포함됩니다. 최근 이 프로세스를 부분적으로 자동화하는 것을 목표로 하는 다양한 시스템이 등장했습니다. 예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하, "프로세서"라 칭함)는 자동화된 방식으로 이러한 단계들 중 많은 것을 수행할 수 있는 자동화된 세포 처리 장치이다(6,7,8,9). 전통적이고 자동화된 CAR-T 제조 방법에 대한 심층적인 논의는 최근 리뷰 기사10에 제시되어 있습니다.
이 프로세서는 조혈 전구 세포 처리를 위한 미국 식품의약국(FDA) 승인 의료 기기인 CliniMACS Plus의 기능을 기반으로 합니다. 이 프로세서에는 세포의 자동 세척, 분획 및 배양이 가능한 세포 배양 장치가 포함되어 있습니다(그림 1). T 세포 형질도입(TCT) 공정은 수동 CAR-T 세포 제조를 대부분 복제하는 프로세서 장치 내의 사전 설정 프로그램입니다. TCT를 사용하면 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 사용자 정의 가능한 셀 처리가 가능합니다("활동 매트릭스", 그림 2). 프로세서는 많은 단계를 자동화하고 여러 장치의 기능을 하나의 기계로 통합하기 때문에 기술자의 교육과 전문 문제 해결 기술이 덜 필요합니다. 모든 단계가 폐쇄된 일회용 튜빙 세트 내에서 수행되기 때문에 프로세서는 개방형 제조 공정에 허용되는 것으로 간주되는 것보다 덜 엄격한 공기 처리 인프라가 있는 시설에서 작동할 수 있습니다. 예를 들어, ISO 클래스 8(EU 등급 C에 필적) 인증을 받은 시설에서 프로세서를 작동하고 있습니다.
그림 1: T 세포 형질 도입 시스템을 사용한 CAR-T 세포 제조. 튜브 세트가 설치된 프로세서가 표시됩니다. 튜빙 세트를 사용하면 멸균 용접을 통해 처리 완충액, 배양 배지 및 렌티바이러스 벡터가 포함된 백과 같은 다른 구성 요소를 연결할 수 있습니다. 백혈구 채취 산물이 Application bag에 추가되면 T Cell Selection Beads로 라벨링하고 Separation column을 통과한 다음 Reapplication bag으로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 선택된 세포는 배양용 기기의 배양 장치로 보내지고 활성화 시약으로 활성화됩니다(재료 표 참조). 최종 생성물은 Target cell bag에 수집됩니다. 공정 전반에 걸쳐 품질 관리를 위해 샘플을 무균으로 제거할 수 있습니다. 원 안의 회색 숫자는 튜빙 세트를 통해 액체 경로를 지시하는 프로세서의 번호가 매겨진 밸브를 나타냅니다. 11의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 활동 매트릭스. T 세포 선택 및 활성화 후 CAR-T 세포 제조 공정의 나머지 부분은 완전히 맞춤화할 수 있습니다. 활동을 추가하거나 삭제할 수 있으며 적절한 날짜와 시간에 예약할 수 있으며 활동 이후의 문화권 볼륨(Volume)을 지정할 수 있습니다. 예를 들어, 형질도입 활성은 1일차 오전 10:00에 시작하도록 구성되었고, 활동 종료 시 배양 부피는 100mL로 설정되었습니다. 활동 매트릭스는 재배 기간 동안 편집할 수 있습니다. 프로세스 상태는 처리 장치의 통합 화면에서 모니터링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 원고의 목적은 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 규제 기관이 임상시험용 신약(IND) 신청을 승인하는 데 필요할 수 있는 공정 중 및 제품 출시 테스트에 대한 지침을 추가로 제공하는 것입니다. 제시된 프로토콜은 공급업체가 권장하는 접근 방식에 가깝고 현재 단일 센터 연구자 주도 I/II 상 임상 시험에서 평가되고 있는 IND 28617의 기본 프로토콜입니다. 이 임상시험은 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 또는 B 계통 림프구성 림프종(B-Lly) 환자를 위한 인간화 CD19 지향 자가 CAR-T 세포를 제조하기 위해 이 프로세서를 사용하는 것의 안전성과 효능을 결정하는 것을 목표로 합니다[NCT05480449]. 이 임상시험은 2022년 9월에 시작되었으며 B-ALL 또는 B-Lly에 0-29세 환자 최대 89명을 등록할 계획입니다. 우리는 원고에 시험의 일부 제조 결과를보고합니다.
원고는 따라야 할 단계가 포함된 프로토콜로 제시되었지만, 다른 사람들이 자신의 CAR-T 세포 제조 공정을 최적화하기 위한 출발점으로 간주되어야 한다는 점을 지적하고 싶습니다. 제시된 프로토콜에 대한 가능한 변이의 비포괄적 인 목록은 다음을 포함합니다 : 동결 보존 된 T 세포 대신 신선한 T 세포를 시작 물질로 사용; 다른 T 세포 농축 방법을 사용하거나 완전히 생략하는 단계; IL2 대신 IL7/IL15와 같은 다른 배지 및 사이토카인 칵테일을 사용합니다. 인간 AB 혈청의 농도를 변화시키거나 완전히 생략하는 것; 형질도입 시기; "multi-hit" transductions를 사용하여; 다양한 교반, 배양량 및 먹이 일정; 핵산 또는 비-렌티바이러스 벡터의 전기천공법을 포함하는 다양한 유전자 전달 방법을 사용하는 단계; 상이한 최종 제형 완충액 및/또는 동결 보호제를 사용하는 단계; 나중에 주입하기 위해 냉동 보관하는 대신 CAR-T 세포를 신선하게 주입합니다. 이러한 변화는 치료 제품의 세포 조성 및 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
| 전체 프로세스 단계 | 프로세스 데이 | 제품 상세 정보 | |||
| 세포 농축 | 0일차 | CD4+/CD8+ T 세포 선택 | |||
| 세포 활성화 | T 세포 배양 파종 및 활성화 | ||||
| 세포 형질도입(Cell Transduction) | 1일차 | 렌티바이러스 transduction(배양 용량 100mL) | |||
| 세포 확장(세포 제형 후) | 2일차 | -- | |||
| 3일차 | 배양 세척(1 사이클); 셰이커가 활성화되었습니다. 배양 부피가 200mL로 증가 | ||||
| 4일차 | -- | ||||
| 5일차 | 사료 (50 mL); 배양 용량이 최종 용량 250mL에 도달 | ||||
| 6일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-125 mL / +125 mL) | ||||
| 7일째 | 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확 | ||||
| 8일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확 | ||||
| 9일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 10일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 11일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 12일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 13일째 | 수확 | ||||
표 1: 프로세스 타임라인 및 개요. 이 표는 현재 임상 시험에서 사용되는 TCT 프로세스 단계를 요약한 것입니다[NCT05480449]. 이 과정은 CD4+/CD8+ 선택에 의한 T 세포 농축, 배양 파종 및 0일차에 활성화로 시작되며, 1일차에 형질도입이 이어집니다. 세포를 48시간 동안 휴지시킨 후 배양 세척, 배양량을 200mL로 늘리고 진탕 메커니즘을 사용하여 교반합니다. 6일째에 첫 번째 공정 중 샘플을 채취합니다. 최소 3회 용량의 CAR-T 세포(환자가 <50kg인 경우 5 × 10 6 CAR-T 세포/kg, 그렇지 않으면 2.5 × 108 CAR-T 세포) 및 품질 관리 테스트(~2 × 106 CAR-T 세포)에 충분한 세포가 확보되면 세포를 채취합니다. 또는 배양이 총 4-5 x 109 세포에 도달하면. 약어: TCT = T 세포 형질도입; CAR-T = 키메라 항원 수용체 T 세포; MACS = 자기 활성화 세포 분류.
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Protocol
모든 연구는 병원의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 기관 지침에 따라 수행되었으며, 모든 피험자는 임상시험의 맥락에서 수집된 데이터의 출판에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
참고: 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 CAR-T 제조 공정에 대한 높은 수준의 개요를 제공합니다. 나머지 섹션에서는 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 TCT 소프트웨어 버전 1.4를 사용하는 워크플로를 설명하며, 이는 이 문서 작성 시점의 현재 버전입니다. 다른 버전의 TCT 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 다를 수 있습니다.
1. 프로세스 타임라인 및 개요(표 1)
- 월요일(-1일차)에 비행 전 점검으로 절차를 준비합니다. 프로세서 및 기타 장비가 예상대로 작동하고 모든 시약 및 소모품을 전체 제조 실행에 사용할 수 있고 최신 상태인지 확인합니다.
- 0일째에 기계에 튜빙 세트를 설치합니다. 이전에 냉동 보존된 T 세포를 건식 수조에서 해동하고 멸균 용접을 통해 기기에 설치된 튜브 세트에 연결합니다.
참고: 이 프로토콜은 자가 T 세포가 성분채집술을 통해 수집되고, 동결 보존되고, 제조 시작까지 보관되었다고 가정합니다. 갓 채취한 T 세포를 사용할 수 있지만, 이는 성분채집술 수집과 CAR-T 세포 제조를 조율해야 하기 때문에 물류 부담을 증가시킵니다. 박테리아 오염의 위험을 최소화하기 위해 수조 대신 건식 해동 공정을 사용하는 것이 좋습니다. - CD4 및 CD8 시약으로 T 세포를 라벨링하고( 재료 표 참조) 자기 선택으로 농축합니다.
참고: T 세포 농축을 생략하거나 프로세서에 세포를 로드하기 전에 수행할 수 있습니다. 의정서의 섹션 5를 참조하십시오. - CD4+/CD8+ 세포를 농축한 후 세포 수를 위해 샘플을 채취합니다. 5% 인간 AB 혈청 및 재조합 인간 IL2(25ng/mL)가 보충된 배지 70mL(재료 표 참조)의 초기 부피에 1-2 × 108개의 세포로 배양물을 파종합니다.
- 활성화 시약 바이알(항-CD3 및 항-CD28 항체에 접합된 콜로이드 고분자 나노매트릭스, 재료 표 참조)을 추가하여 T 세포를 활성화하고 5%CO2 분위기에서 37ºC에서 24시간 동안 교반 없이 배양물을 배양합니다. 원하는 경우 남은 CD4+/CD8+ 세포를 백업으로 냉동 보존합니다.
알림: 제조 실패의 경우 남은 CD4+/CD8+ 선택된 셀을 출발 물질로 사용할 수 있습니다. 고장이 오염 또는 작업자 오류와 같은 순전히 기술적인 것이고 충분한 셀이 남아 있는 경우 남은 셀을 사용하여 추가 제조 실행을 수행하는 것을 고려할 수 있습니다. 출발 물질의 품질이 우려되는 경우 새로운 성분채집 절차가 보장될 수 있습니다. 그러나 이것은 궁극적으로 임상적 결정입니다. 두 경우 모두 제조 실패는 조사해야 하는 중요한 사건이며 의뢰자와 규제 기관에 알려야 합니다. - 활성화 24시간 후, 적절한 감염 다중성(MOI)에서 렌티바이러스 벡터로 T 세포를 transduction합니다.
참고: 임상 제품 제조를 시작하기 전에 렌티바이러스 벡터 역가를 측정하고 적절한 MOI를 설정하는 것이 중요합니다. 벡터 역가는 인간 일차 T 세포가 벡터의 다양한 농도에서 형질도입되는 소규모 실험을 수행하여 결정해야 합니다. 적절한 MOI에 대한 고려 사항에는 벡터의 비용, 원하는 transduction 효율 및 허용 가능한 벡터 복제 수가 포함됩니다. 이 프로토콜은 30-50%의 MOI를 사용하여 벡터 비용을 최소화하고 평균 벡터 복제 수를 transduction cell당 8 copy 미만으로 유지합니다. - 3일차에 Culture Wash 활동을 트리거하고 낮은 수준의 교반을 시작합니다. 배양량을 200mL로 늘립니다.
- 5일차에 배양액 50mL를 배양액에 추가하여 배양량을 250mL로 늘립니다.
- 배양 6일차에 배양물에서 검체를 채취하여 유세포 분석으로 CAR-T 세포를 계수합니다. 이 측정값을 사용하여 배양액이 성장하는 속도를 추정하고 최적의 수확 시기를 식별할 수 있습니다.
참고: 각 공정 중 샘플링은 테스트를 위해 3mL를 수득하고 총 7mL의 배양 부피를 제거합니다. - 7일차부터 13일차까지 배양액이 종료되지 않은 경우 격일로 최대 2개의 추가 공정 중 샘플을 채취하고 매일 배지 교환을 수행하여 성장하는 배양액을 공급합니다. 총 유핵 세포(TNC) 수가 5 × 109 에 도달하거나 필요한 투여 횟수 및 방출 검사에 충분한 세포를 사용할 수 있을 때 제품을 수확합니다.
- 수확 당일에는 활발하게 자라는 배양액에서 공정 중 샘플을 채취합니다. 이 샘플은 마이코플라스마, 내독소, 복제 가능 렌티바이러스(RCL) 검사, 벡터 복제 수(VCN) 검사, 세포 수, 세포 크기 분석, 유세포 분석 및 그람 염색에 사용할 수 있습니다.
- 배양 배지의 제거와 최종 제형 완충액(4% 인간 혈청 알부민이 보충된 멸균 등장성 결정질 용액, 재료 표 참조)으로 세포 세척을 트리거하는 최종 수확 프로그램을 시작합니다. 수확이 완료된 후 표적 세포 백은 최종 제형 완충액에 100mL의 세포 생성물을 보관합니다. 디메틸설폭사이드(DMSO)를 10%(v/v) 농도로 첨가하고, 생성물을 개별 용량으로 분주하고, 속도 조절 냉동고를 사용하여 냉동 보존합니다.
2. 1일차: 준비 및 비행 전 점검
- CO2 가스 수준과 압축 공기가 각 라인에서 최소 20psi의 입구 압력을 생성하기에 충분한지 확인합니다.
- 프로세서를 켜고 시작 시 오류가 없는지 확인합니다. 필요한 경우 시계를 정확한 시간으로 설정하십시오. 프로세서를 종료합니다.
- T 세포 출발 물질의 세포 수, 부피 및 총 CD4+ 및 총 CD8+ 수를 알고 있는지 확인하십시오.
- 전체 제조 실행에 충분한 양의 바이러스 벡터, 시약 및 소모품이 있는지 확인합니다.
- 인간 AB 세럼 한 병을 냉장고에 넣어 밤새 해동합니다.
3. 0일차: 튜빙 세트 설치
- 3L의 처리 완충액(인산염 완충 식염수/에틸렌디아민테트라아세트산(PBS/EDTA) 완충액에 인간 혈청 알부민(HSA) 0.5%(w/v))를 준비합니다.
- 배양 배지 2L(최종 농도가 5%인 인간 AB 혈청 100mL가 보충된 배지 2L와 25μg/바이알에서 재조합 인간 IL2 바이알 2개, 이 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조)를 준비합니다. 10mL 배양 배지를 20mL 시약 백에 옮기고 4ºC에서 밤새 보관합니다.
- 기기를 켜고 터치 스크린 인터페이스에서 T 세포 형질 도입 과정 (TCT)을 선택합니다. Run(실행 )을 클릭하여 TCT 프로세스를 시작합니다. 기기가 화면의 지시와 프롬프트를 사용하여 절차를 통해 사용자를 안내하도록 합니다.
- 매개변수 입력 화면에서 작업자의 이니셜, 튜빙 세트 로트 번호 및 프롬프트가 표시되면 만료 날짜를 입력합니다.
- 프로세스 설정 화면에는 네 가지 프로세스가 표시됩니다. 전체 프로세스(1)를 선택합니다.
참고: 사용 가능한 다른 프로세스에는 CD4+/CD8+ 선택된 T 세포(아래 섹션 5 참조)에서 시작하고 이전에 중단된 제조 실행을 다시 시작하는 것이 포함됩니다. - 메시지가 표시되면 CD4+/CD8+ 선택 방법을 반영하기 위해 선택 시약의 두 바이알 을 선택합니다.
- 화면의 지시에 따라 튜빙 세트를 설치하십시오. 모든 루어 연결이 단단히 조여져 있고 튜빙 세트에 결함이 없는지 확인하십시오.
- 화면의 지시에 따라 자동화된 상위 및 하위 무결성 테스트를 시작합니다.
알림: 결함 있는 튜빙 세트, 잘못 설치된 튜빙 세트 또는 기계 연동 펌프의 결함으로 인해 무결성 테스트가 실패할 수 있습니다. 생산 실행을 위해 최소 하나의 추가 튜빙 세트를 보유하는 것이 좋습니다. 또한 두 번째 기술자가 튜빙 세트가 올바르게 설치되었는지 확인하는 것이 좋습니다. - 배지를 부착하고 버퍼 백을 처리하기 위해 화면의 지시를 따릅니다.
- 튜빙 세트의 자동 프라이밍을 시작합니다.
알림: TCT 공정은 프라이밍 후 3시간 이내에 계속되어야 합니다. T 세포 출발 물질이 준비되었는지 확인하십시오.
4. T 세포 농축
- Transfer cell product 화면이 나타나면 동결 보존된 T 세포 산물을 해동하기 시작합니다.
참고: 튜빙 세트에 추가할 수 있는 T 세포의 허용 가능한 부피는 50 - 280mL입니다. 표적 세포의 최대 개수(CD4+와 CD8+의 합)는 3 × 109개이고, 최대 TNC 개수는 2 × 1010개입니다. - 해동된 세포를 150mL 전사 백에 옮깁니다. 이송 백을 튜빙 세트의 적용 백에 멸균 용접합니다.
- QC 파우치를 사용하여 Application bag에서 샘플을 꺼내고 세포 계수를 수행합니다.
- CD4 및 CD8 시약 바이알을 연결합니다.
- 선택(T 세포 농축) 과정을 시작합니다.
- 농축 후 세포 수, 유세포 분석 및 세포 크기 분석을 위해 재도포 백의 QC 파우치에서 CD4+/CD8+ 선택된 세포의 샘플을 제거합니다.
참고: 다음 단계로 진행하려면 셀 수 결과가 필요합니다.
5. 대안: CD4+/CD8+ 선택된 세포로 시작
- 3.2단계에 설명된 대로 배지를 준비합니다. 처리 버퍼가 필요하지 않습니다.
- 프로세서를 켜고 공정 설정 화면에서 TS 설치로 T 세포 배양(3)을 선택합니다. 화면의 지시와 지시를 따릅니다.
- 화면의 지시에 따라 처리 버퍼 대신 매체로 튜빙 세트를 프라이밍합니다.
- "배양-연결 세포 산물 준비" 화면이 나타나면 CD4+/CD8+ 선택한 T 세포를 해동하기 시작합니다.
참고: 이 공정의 최소 T 세포 수(CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합)는 1.0 × 108입니다. - 세포를 150mL 전사 백으로 옮기고 배지로 희석하여 최종 부피 50mL로 합니다.
- 셀 현탁액을 기기의 재도포 백에 멸균 용접합니다.
- 세포 수 및 세포 크기 분석을 위해 재도포 백의 QC 파우치에서 CD4+/CD8+ 선택된 세포의 샘플을 꺼냅니다.
6. 활동 매트릭스의 문화 설정 및 프로그래밍
- 세포 농도와 원하는 시작 번호(1-2 × 108 T 세포)를 입력합니다.
참고: 기기는 재도포 백에서 배양 챔버로 적절한 용량을 자동으로 펌핑하고 최종 용량을 70mL로 조정합니다. - 화면의 지시에 따라 활성화 시약의 바이알을 부착합니다.
- CO2 농도의 경우 5%를 입력하고 배양 챔버 온도의 경우 39°C를 입력합니다.
알림: 제조업체는 39°C 또는 기기에 대해 특별히 보정된 값을 입력할 것을 권장합니다. - 활동 매트릭스를 설정합니다. 향상된 급지 프로토콜을 시작점으로 사용하고 프로토콜 내의 개별 단계를 사용자 정의 사양으로 수정합니다(그림 2).
- Transduction 활동 시간이 시드 후 24시간(1일차)인지 확인합니다.
- Culture Wash 활동 시간은 Transduction 48시간(3일차) 후인지 확인합니다.
- Activate Shaker( Shaker type 2)의 시간을 Culture Wash 시작 후 30분으로 설정합니다.
- 중형 봉투 교환 및 폐기물 봉투 교환 활동을 삭제합니다.
- 화면에서 확인을 터치하여 재배를 시작합니다.
- 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 남은 CD4+/CD8+ 선택 세포를 Application bag에 냉동 보존합니다.
7. 1일차: T 세포 형질 도입
- 원하는 MOI를 기반으로 사용할 렌티바이러스 벡터의 부피를 계산합니다.
- 4ºC에서 밤새 보관한 10mL 배양 배지가 들어 있는 20mL 시약 백을 회수합니다(단계 3.2). 벡터 바이알을 해동하고 7.1에서 계산된 부피를 20mL 시약 백에 옮깁니다.
참고: 보존 또는 연구 개발을 위해 남은 벡터를 고정하는 것이 좋습니다. - 활동 매트릭스를 수정하여 변환 시간을 2분 후로 설정합니다. 메시지가 표시되면 확인을 터치하여 Transduction 활동을 시작합니다.
- 화면의 지시에 따라 벡터 백을 튜브 세트에 멸균 용접합니다.
- 변환 활동이 시작된 실제 시간을 기준으로 활동 매트릭스를 수정합니다.
참고: 파종 후 20-24시간 이내에 형질도입을 시작하여 정상 근무 시간 동안 실습 활동이 수행되도록 하는 것이 좋습니다.- 배양 세척 시간은 형질도입 후 48시간(3일차)인지 확인합니다.
- 셰이커 활성화(셰이커 유형 2)의 시간을 배양 세척(3일차) 후 30분으로 설정합니다.
- 미디어 교환 시간이 6일차 오후(오후 1시)인지 확인합니다.
8. 6일차: 첫 번째 공정 중 샘플
- Sample 버튼을 터치하고 화면의 지시에 따라 활성 배양물에서 QC 샘플을 얻습니다.
- 세포 수, 유세포 분석 및 세포 크기 분석을 수행합니다. 그램 염색을 위해 샘플 1mL를 보냅니다.
참고: 배양 성장을 모니터링하기 위해 세포 수를 거의 이틀에 한 번씩 반복해야 합니다. - 배양액 2L를 더 준비합니다(3.2단계 참조).
- 활동 매트릭스에 2분 후에 시작하도록 지정된 중형 가방 교환 활동을 추가합니다. 20분 후에 시작하도록 Media Exchange 활동을 조정합니다. 화면의 지시를 따릅니다.
참고: 배지 교환은 배양실에서 배양 배지 를 대체하는 것입니다. 미디엄 백 교환 은 악기에 매달린 배양 배지 백을 대체하는 것입니다.
9. 수확일(7일에서 13일까지): 수확 및 냉동 보존
- Sample 버튼을 터치하고 화면의 지시에 따라 활성 배양물에서 QC 샘플을 얻습니다.
- QC 샘플을 각각 1mL씩 3개의 부분 표본으로 분리합니다. 유세포 분석, 세포 수 및 세포 크기 분석에 1mL를 사용합니다. 마이코플라스마, 벡터 복제 수, 복제 가능 렌티바이러스 및 내독소 검사에 1mL를 사용합니다. 그램 염색을 위해 마지막 1mL를 보냅니다.
- 최종 제형 완충액을 준비합니다(2L 백에 4% HSA가 보충된 멸균 등장성 결정질 용액, 재료 표 참조). 이 완충액 100mL를 저장하여 이후 단계에서 동결 보호제 용액을 준비합니다.
- 작업 매트릭스를 수정하여 문화권 종료 시간을 2분 후로 설정하고 나머지 다른 모든 활동을 삭제합니다. 화면의 지시에 따라 최종 배합 완충액을 튜빙 세트에 부착하고 수확을 시작합니다.
알림: 프로세서는 자동으로 셀을 대상 셀 백으로 전송합니다. 부피는 100mL입니다. - Target cell bag QC 파우치에서 0.5mL 샘플을 채취하여 세포 계수를 수행합니다.
- 대상 셀 백을 밀봉하고 튜빙 세트에서 제거합니다. CAR-T 제품을 적절한 용량으로 나누어 제어된 냉동고에서 냉동 보존합니다. -150ºC에서 액체 질소 저장 탱크의 증기 상태에 셀을 ≤ 보관하십시오.
참고: 용량의 최종 제형 및 분취는 프로토콜에 따라 다릅니다. 여기서는 CAR-T 세포와 QC 바이알을 3회 동일한 용량으로 동결 보존하는 예를 제공합니다. 자세한 내용은 섹션 10을 참조하십시오. - 기기에서 프로세스 데이터를 다운로드하고, 튜빙 세트를 제거 및 폐기하고, 셧다운을 수행합니다.
10. CAR-T 세포의 동결 보존
참고: 이 프로토콜은 CAR-T 세포가 제조 후 냉동 보존되어 환자가 주입할 준비가 될 때까지 보관한다고 가정합니다. 갓 제조된 CAR-T 세포를 주입하는 것은 가능하지만, CAR-T 세포 제조와 CAR-T 세포 주입을 조율해야 하기 때문에 물류 부담이 가중됩니다. 이는 제조 실패의 경우 문제가 될 수 있습니다. 특히 임상 프로토콜에 따라 CAR-T 주입 전에 림프절 고갈 화학요법이 필요한 경우, 제조 실패로 인해 환자가 불필요한 화학요법의 위험에 노출될 수 있으므로 냉동 보존을 강력히 권장합니다. 규제 기관은 조사관에게 주입 전에 제품이 모든 방출 테스트를 통과했음을 입증하도록 요구할 수 있으며, 이는 냉동 보존 없이는 달성하기 어려울 수 있습니다.
- 수확된 제품의 최종 100mL에서 추가 방출 테스트(예: 생존율), 머무름 및 멸균 샘플을 수행하기 위해 원하는 CAR-T 용량 및 품질 관리(QC) 바이알을 충족하는 데 필요한 부피를 결정하고 제거합니다.
참고: 최종 제품을 분취하기 위해 완전히 정의된 전략을 개발하는 것이 중요합니다. 충분한 재료를 사용할 수 있는 경우 재주입을 허용하기 위해 여러 용량의 제품을 제조하는 것이 좋습니다. 백에 담긴 제품 용량이 10-20mL이므로 주사기 푸시를 통해 빠르게 해동하고 쉽게 주입할 수 있습니다. 각 제품을 원하는 CAR-T 세포 용량(예: kg당 5 × 106 CAR-T 세포 또는 2.5 ×10 8 CAR-T 세포)으로 채우는 것이 좋으며, 이렇게 하면 주입 당일에 용량을 계산할 필요가 없습니다. 또한 최소 4개의 QC 바이알을 냉동 보존하고 남은 물질이 있을 수 있는 가능성을 고려하는 것이 좋습니다. 이 자료는 연구 및 개발 목적으로 유용할 수 있으므로 저장하는 것이 좋습니다. - 세포를 원심분리하여 부피를 줄입니다.
- 단계 9.3에서 따로 보관된 최종 제형 완충액의 부분을 사용하여 원하는 최종 부피의 절반으로 생성물(들)을 올립니다.
- 최종 제형 완충액에서 20% DMSO 용액을 생성하여 2x 동결 보호제를 준비합니다.
참고: 동결 보호제 제형 및 DMSO 농도를 수정할 수 있습니다. - 최종 DMSO 농도 10%를 위해 동일한 부피의 세포에 2x 동결 보호제를 추가합니다.
알림: 동결 보호제에 대한 제품의 노출 기간을 최소화해야 합니다. - 투여 백과 QC 바이알을 채웁니다. 멸균을 위해 1mL를 보냅니다.
참고: 규제 기관은 일반적으로 최종 제품에 대해 14일 무균 분석을 수행할 것을 요구합니다. 그러나 신속한 멸균 분석이 등장하고 있습니다. 이때 compendial 14 일 방법이 가장 일반적입니다. - 속도 조절 냉동고를 사용하여 제품을 냉동 보존합니다.
알림: 제어 속도 냉동고 프로그램은 공융점에 대한 보상과 함께 ~ -1ºC/min에서 ~ -45ºC의 냉각 속도를 생성하도록 검증되어야 합니다. - ≤ -150°C의 액체 질소 초저온 냉동고의 증기상 보관.
11. 시술 수행 심사
참고: TCT 공정 전반에 걸쳐 활성 배양물에서 여러 QC 샘플을 채취합니다. 표 2 는 독자가 참조를 위해 결과를 구성하고 프로시저 성능 메트릭을 계산하는 데 도움이 되는 그리드를 제공합니다. 문자와 숫자로 구성된 아래 용어(예: "B4")는 이 표의 그리드에 있는 셀을 나타냅니다. 다음 값이 성능 계산에 사용됩니다: B3 = 총 유핵 세포(TNC) 사전 농축; B4 = TNC 농축 후; E2 = CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합(초기 성분채집술 산물의 총 세포에 대한 백분율); E4 = 농축 후 전체 세포의 백분율로 나타낸 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합; G2 = CD19+ 세포(초기 생성물의 총 세포에 대한 백분율); G4 = CD4+/CD8+ 농축 후 전체 세포의 백분율로 나타낸 CD19+ 세포; B10 = 수확 당일 활성 배양액의 TNC.
표 2: 프로시저 성능 그리드. 절차 성능 통계를 계산하는 데 필요한 공정 내 테스트 조건을 구성하는 데 도움이 되도록 이 그리드를 제공합니다. 행은 절차 중 다양한 시점에서 분석된 샘플을 나타내며 숫자 1-11로 레이블이 지정됩니다. 6-9행은 재배 6일 이후부터 수확일 이전에 채취한 샘플의 결과를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다. 열은 측정된 매개변수를 나타내며 문자 AH로 레이블이 지정됩니다. 회색으로 음영 처리된 필드는 적용되지 않습니다. 일부 추가 필드는 CD4+/CD8+ 농축이 절차의 일부로 수행되는지 여부와 재배 기간에 따라 적용되지 않을 수 있습니다. 해당 필드에 "N/A"를 쓰는 것이 좋습니다. 약어: TNC = 총 유핵 세포 수; QC = 품질 관리. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
- 방정식 (1)을 사용하여 농축 후 CD4+와 CD8+ T 세포의 총 수를 농축 전 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 수로 나누어 선택 후 CD4+/CD8+ 세포의 회수율을 계산합니다.
CD4+/CD8+ T 세포 회수 =
(1) - CD4+/CD8+ 농축 후 CD19+ 세포의 총 수를 농축 전 CD19+ 세포의 총 수로 나누어 농축 후 CD19+ 세포의 고갈을 계산합니다. 이 숫자는 매우 작을 것으로 예상되므로 방정식 (2)와 같이 이 분수의 로그를 보고합니다.
기록 CD19 세포 고갈 = 기록10
(2) - 수확 시 활성 배양에 있는 총 세포 수를 방정식 (3)을 사용하여 파종된 세포 수로 나누어 총 배 성장을 계산합니다.
총 폴드 증가 =
(3) - 방정식 (4)를 사용하여 수확일에 대한 총 배 성장의 근을 취하여 평균 일일 성장을 계산합니다.
평균 일일 증가율 = 수확일 √(총 배수 증가율) (4)
(1)
(2)
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Representative Results
NCT05480449 임상시험의 초기 3회 CAR-T 제조 실행 결과는 아래 표 3에 나와 있습니다. 출발 물질, 벡터, 배양 사이토카인 및 AB 혈청 농도는 각 실행에 대해 일관되게 유지되었습니다. 제품은 7일 또는 8일에 수확되었습니다. 하루 평균 세포 성장율은 46%(총 세포 수 증가)였으며, 이는 TCT 과정이 세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 프로세서가 일관되고 재현 가능한 CAR-T 세포 산물을 생산할 수 있음을 시사합니다.
표 4에 요약된 최종 제품 테스트 결과는 CAR-T 세포가 품질 관리 표준을 통과했음을 보여줍니다. 세포 생존율은 88%에서 94% 사이였고 CD3 T 세포 순도는 89-93%였습니다. 중요한 것은 내독소, 마이코플라스마, 불임, 복제 가능한 렌티바이러스 및 잔류 백혈병 세포가 검출되지 않았다는 것입니다. 이러한 결과는 TCT 공정이 임상 사용을 위한 규제 기준을 충족하는 고품질 CAR-T 세포를 생산한다는 것을 확인시켜줍니다.
이 절차를 위해 3개의 유세포 분석 패널이 개발되었습니다(그림 3). 여기에는 농축 전후에 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 테스트하기 위한 CD4/CD8 패널, 형질 주입 효율을 테스트하기 위한 CD19 CAR-T 패널, 최종 제품에서 잔류 백혈병(CD19+) 세포의 생존율과 함량을 측정하기 위한 CD3/CD19 패널이 포함됩니다. 이 패널의 결과는 CAR-T 세포의 성공적인 제조와 최종 제품에 잔류 백혈병 세포가 없음을 확인합니다.
전반적으로, 이 결과는 TCT 공정이 임상적 사용에 적합한 일관된 고품질 CAR-T 세포 제품을 생산할 수 있음을 시사합니다.
그림 3: 유세포 분석 분석. 유세포 분석 분석에 사용되는 게이팅 전략은 각 패널에 대해 설명되어 있습니다. 게이트는 검은색 상자 또는 타원으로 그려지고 레이블이 지정되며 파란색 화살표는 게이트의 방향을 나타냅니다. (A) CD4/CD8 패널. B 세포는 CD19+ subset으로, T 세포는 림프문의 CD3+ subset으로 정의됩니다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T 세포 게이트의 하위 집합입니다. (B) CD19 CAR-T 패널. CAR+ T 세포는 CD3+ T 세포의 CD19-CAR+ 부분집합으로 정의됩니다. 또한 CD19 CAR+인 CD4+ 및 CD8+ 하위 집합이 열거됩니다. (C) CD3/CD19 패널. 이 패널은 CD4 및 CD8 마커가 생략된 것을 제외하고는 CD4/CD8 패널과 동일합니다. 약어: SSC-A = 측면 산란 영역; 림프 = 림프구; CD19-CAR = CD19 특이적 키메라 항원 수용체; 7AAD = 7-aminoactinomycin D. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 달리다 # | 출발 물질 | 벡터 | 배양 사이토카인 | AB 세럼 % | 최종 TNC | 총 CAR-T 세포 수확 | Total Fold Growth | 평균 일일 성장률 | 추수감사절 | ||
| 1 | 환자 T 세포, 성분채집술, 냉동 보존 |
휴카트19 | 일리노이2 | 5% | 2.75배109 | 2.24배108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | 환자 T 세포, 성분채집술, 냉동 보존 |
휴카트19 | 일리노이2 | 5% | 4.15배109 | 1.14×108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | 환자 T 세포, 성분채집술, 냉동 보존 |
휴카트19 | 일리노이2 | 5% | 4.20x109 | 8.40×107 | 21 | 46% | 8 | ||
표 3: 3가지 임상 규모 CAR-T 제조 실행의 매개변수 및 성장 특성. NCT05480449 임상 시험용 프로세서를 사용한 처음 3개의 환자 제조 실행에 대한 배양 조건, 성장 및 수확일에 대한 세부 정보가 표시됩니다. huCART19, 인간화 CD19 지향 CAR 렌티바이러스 벡터. 이들 산물에 대한 형질도입 효율 및 생존력은 표 4에 나와 있습니다. 약어: CAR-T 세포 = 키메라 항원 수용체 T 세포; TNC = 총 유핵 세포.
| 릴리스 테스트 | ||||||||||
| 시험 | 세포 생존력(Cell Viability) | CD3 % (CD3 %) | 내독소 | 마이코-플라즈마 | 형질전환 효율 | 잔류 백혈병 세포 | 불임일 14 | 세포당 벡터 DNA 염기서열 | Transducted Cell당 벡터 DNA 염기서열 | 복제 능력 있는 렌티바이러스 |
| 사양 | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3.5 EU/mL |
마이너스 | ≥ 2 % | < 1 % | 성장 없음 | 결과 보고 | 0.04-8 사본/형질도입된 세포 |
< 50 copies/μg DNA |
| 결과 | ||||||||||
| 실행 1 | 90 | 89 | <0.4 | 마이너스 | 36 % | 안 감지 |
아니요 성장 |
1.04 | 2.89 | 안 감지 |
| 실행 2 | 88 | 93 | <0.4 | 마이너스 | 39 % | 안 감지 |
아니요 성장 |
1.16 | 2.97 | 안 감지 |
| 실행 3 | 94 | 91 | <0.4 | 마이너스 | 18 % | 안 감지 |
아니요 성장 |
0.43 | 2.39 | 안 감지 |
표 4: 최종 제품 테스트 및 릴리스 사양. 이 표에 표시된 사양은 NCT05480449 임상 시험(IND 28617)에 대한 것입니다. 해동 후 생존율, CD3%, 형질도입 효율 및 잔류 백혈병 세포 함량은 유세포 분석으로 측정하였다. 내독소는 FDA 허가를 받은 limulus amebocyte lysate 기반 발색 검사를 사용하여 측정했습니다. 멸균 테스트는 USP<71> 준수 방법을 사용하여 수행되었습니다. 마이코플라즈마, 세포당 벡터 DNA 서열 수 및 복제 가능한 렌티바이러스는 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)을 사용하여 측정했습니다. 형질도입된 세포 당 벡터 DNA 서열수는 벡터 DNA 서열수를 형질도입 효율로 나누어 계산하였다. 약어: EU = 내독소 단위; IND = 임상시험용 신약; FDA = 미국 식품의약국(FDA).
보충 그림 S1: TCT 공정을 사용하여 제조된 CAR-T 세포의 전임상 테스트. 면역결핍(NSG) 마우스에 0일째에 환자 유래 이종이식 백혈병 세포를 주입한 후 프로세서에서 제조된 CD19 지향 CAR-T 세포("반자동 제조"), 전통적으로 제조된 CD19 지향 CAR-T 세포("표준 제조") 또는 7일째에 식염수로 처리했습니다. (ᄀ, ᄂ) 반자동 제조 CAR-T 세포로 처리한 마우스의 생존율은 식염수(두 용량 수준 모두 p < 0.0001)와 두 가지 용량 수준(0.5 × 10, 6 또는 2 × 10, 6 CAR-T 세포)에서 두 가지 용량 수준(0.5 10,6 또는 26 CAR-T 세포)과 비교했습니다. (C) 표준 세포(0.5 × 106 CAR-T 세포)에 대해 비치료적인 것으로 알려진 용량 수준에서 반자동 및 표준 제조 CAR-T 세포의 비교. 프로세서에서 CAR-T 세포를 처리한 마우스의 생존율이 유의하게 높았습니다(p=0.001). (D) 표준 CD19 CAR-T 세포에 대해 치료가 가능한 것으로 알려진 용량 수준에서 반자동 및 표준 제조 CAR-T 세포의 비교. 생존율은 유의하게 다르지 않았다(p=0.4). (E) 두 가지 용량 수준에서 프로세서의 CAR-T 세포 비교. 2 × 106 huCART19 세포로 처리한 마우스에서 더 나은 생존율과 함께 유의한 용량 효과가 관찰되었습니다(p=0.007). 각 그룹에는 5마리의 쥐가 포함되었습니다. 약어: NSG = n비만 당뇨병 환자 severe 복합 면역 결핍 gamma; TCT = T 세포 형질도입; CAR-T = 키메라 항원 수용체 T 세포. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 다양한 로트의 인간 AB 혈청이 보충된 배지에서 배양된 인간 T 세포의 성장 및 렌티바이러스 형질도입 비교. (A) 세 가지 다른 로트의 인간 AB 혈청(7J, 22A 또는 21J)이 보충된 배양에서 CD19 CAR-T 렌티바이러스 벡터(CAR19)로 형질도입되지 않은(UTD) 또는 형질도입된 인간 T 세포의 증식. 로트 중 하나(22A)의 성장률은 다른 두 로트보다 훨씬 높았습니다. (B) 건강한 기증자로부터 유래한 체외 확장 T 세포의 CD3+ 및 CD3+/CD4+ 또는 CD3+/CD8+ 하위집단에서 CAR19+ 세포의 평균 백분율(3회 반복). 성장 속도의 차이는 확장된 배양에서 세포의 유세포 분석에 의해 결정된 렌티바이러스를 흡수하는 세포의 능력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. T 세포와 CD4+ 및 CD8+ 하위집단의 형질도입 효율은 배양마다 일관되었습니다. 오차 막대는 3개의 반복 문화권의 표준 편차를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CAR-T 세포 치료제는 B세포 및 기타 악성 종양에 대한 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 높은 비용, 노동 집약적인 생산, 오염 위험을 증가시키는 개방형 단계 등 몇 가지 한계가 있습니다. 최근에는 이러한 한계를 해결하기 위해 Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하 "프로세서")를 비롯한 여러 반자동 플랫폼이 등장했습니다. 이 원고에 설명된 프로세서에 통합된 T 세포 형질도입(TCT) 공정은 폐쇄형 시스템에서의 T 세포 농축, 활성화, 바이러스 형질도입, 배양 확장 및 수확을 포함합니다. 경쟁사의 자동 세포 처리기 플랫폼은 현재 널리 사용되지 않지만 배양 파라미터에 대한 공정 중 모니터링이 더 우수하거나, 유리한 장비 또는 재료 비용이 들거나, 설치 공간이 더 작아 전용 클린룸 공간 대신 생물 안전 작업대에서 사용할 수 있습니다. 주어진 응용 프로그램 및 환경에 가장 적합한 플랫폼을 선택하는 것이 중요합니다.
CAR-T 세포 치료제와 같은 세포 및 유전자 치료제의 중요한 한계는 상용 제품의 높은 비용으로 인해 생명을 구하는 치료에 대한 접근이 제한된다는 것입니다. 이것은 특히 자원이 부족한 환경과 제1세계가 아닌 국가의 경우입니다. 줄기세포 실험실의 맥락에서 기존의 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 클린룸 시설을 갖춘 대학 병원의 환경에 반자동 공정을 배치하고 일부 공정 중 및 방출 테스트를 수행할 수 있는 임상 실험실의 지원을 통해 유사한 상용 제품보다 훨씬 저렴한 비용으로 CAR-T 세포를 제조할 수 있음을 발견했습니다. 이러한 상황에서 제조를 위한 재료 및 인건비와 모든 공정 중 및 릴리스 테스트(장비 및 시설 제외)를 포함하여 제조 실행을 수행하는 데 드는 한계 비용은 약 $30,000입니다. 프로세서의 장비 자본 비용은 단일 상용 CAR-T 셀 제품의 비용보다 저렴하다는 점에 유의해야 합니다.
수동 방식에서 자동 방식으로 전환할 때 발생할 수 있는 문제 중 하나는 유연성 감소입니다. TCT 프로세스는 강력한 가드레일로 프로그래밍되어 있지만 여전히 광범위하게 사용자 정의할 수 있습니다. 이 과정은 T 세포 농축을 통한 전체 공정, 농축이 없는 전체 공정(예: CD4+/CD8+ 사전 농축 세포와 함께 사용, 위 프로토콜의 섹션 5 참조) 및 중단된 공정의 재개를 포함하여 여러 시작점을 제공합니다. 또한 Activity Matrix 기능을 사용하면 전체 재배 과정을 사용자 정의할 수 있습니다. 신속한 CAR-T 제조에 대한 관심이 높아짐에 따라, 원하는 경우 형질도입 후 몇 시간 이내에 채취를 시작하도록 활성 매트릭스를 구성할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 신속한 시술은 항백혈병 활성의 분화 및 손실을 방지함으로써 제조 시간을 단축하고 더 강력한 제품을 만드는 잠재적인 이중 이점을 가지고 있다12. 또한 TCT의 변형은 전기천공법을 사용하여 비바이러스 벡터를 위해 설계되었으며, 이는 시스템의 유연성을 더욱 향상시킵니다.
CAR-T 세포의 최적 수확 시기는 원하는 목표 용량, 필요한 투여 횟수, 세포 생존율을 손상시키지 않으면서 배양 용기가 지원할 수 있는 최대 세포 밀도 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 제조업체는 250mL 부피에서 50억 세포를 초과하지 않을 것을 권장합니다. 원하는 목표 용량을 결정하는 것은 동물 모델의 전임상 데이터를 기반으로 해야 합니다. 예를 들어, 이 연구에서는 환자 유래 백혈병 이종이식을 주입하고 CAR-T 세포로 처리한 NOD scid gamma knockout(NSG) 마우스를 사용하여 유효 투여량이 킬로그램당 약 200만 개에서 500만 개 사이일 것으로 추정했습니다(보충 그림 S1). 세포 크기 모니터링은 CAR-T 세포 수확을 위한 최적의 시간을 결정하는 데에도 유용할 수 있습니다. 이러한 요소를 신중하게 고려함으로써 연구자들은 CAR-T 세포의 수확 시간을 최적화하여 최종 제품의 품질과 효능을 높일 수 있습니다.
적절한 방출 테스트 계획을 개발하는 것은 IND 신청에 대한 승인을 얻는 데 중요한 구성 요소입니다. 당사는 IND 28617에 대한 사양을 포함한 일련의 출시 테스트를 제시하며, 이것이 유사한 제품에 대한 좋은 출발점이 될 것이라고 믿습니다. 그러나 규제 기관의 의견은 지속적으로 진화하고 있으며, 제시된 프로토콜의 변형으로 인해 규제 기관이 다른 테스트 또는 다른 사양 임계값을 요구할 수 있습니다. FDA의 CMC(Chemistry, Manufacturing, and Control) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)13와 같은 최신 규제 지침 문서를 면밀히 읽을 것을 강력히 권장합니다. 일반적인 원칙은 제품의 안전성을 입증하는 테스트가 효능을 입증하는 테스트보다 더 엄격하게 평가된다는 것입니다. 일반적으로 무균성, 내독소, 마이코플라스마 및 복제 가능한 렌티바이러스와 같은 검사를 검증하고 성능 기준을 알아야 합니다. 대조적으로, 효능 테스트는 초기 단계 임상시험에서 상대적으로 덜 강조되며 완전히 검증할 필요가 없을 수도 있습니다. 최근 FDA 가이드라인 초안은 "효능의 척도로서 전이유전자 발현만으로도 초기 단계 IND 연구를 지원하기에 충분할 수 있다"고 명시하고 있습니다14. 또한 용량 측정에 사용되는 테스트를 검증해야 합니다. 이는 표준화된 유동 분석 또는 참조 물질이 없을 수 있는 새로운 CAR 표적에 문제가 될 수 있습니다. 이 경우 FDA는 "분석을 위한 참조 물질은 유전자 치료 제품 자체의 잘 특성화된 로트일 수 있다"고 제안합니다. 13 예를 들어, 초기 엔지니어링 실행에서 CAR-T 세포를 사용하여 CD19 CAR 유동 분석에 대한 양성 대조군을 확립했습니다.
CAR-T 세포 치료제를 위한 제조 공정을 개발하고 최적화하는 것은 우리가 작업에서 경험한 바와 같이 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 우리는 박테리아 오염 문제를 포함하여 몇 가지 난관에 부딪혔습니다. 우리는 수조가 오염 위험을 증가시킬 수 있으므로 세포를 해동할 때 건식 해동 방법을 사용하는 것을 강력히 권장합니다. 재배로 인해 작은 접종물조차도 솔직한 오염으로 이어져 사용할 수 없는 제품이 될 수 있습니다. 또한 시기 적절하고 정확한 테스트를 보장하기 위해 추가 유효성 검사 및 외부 당사자와의 계약이 포함될 수 있는 릴리스 테스트를 위한 물류를 계획하는 것이 좋습니다. CAR-T 제조 공정을 개발할 때 또 다른 중요한 요소는 형질도입 효율을 최적화하는 것입니다. IND 애플리케이션에는 바이러스 벡터의 효능을 입증하는 데이터가 포함되어야 합니다. 이 요건을 충족하고 동시에 MOI를 최적화하기 위한 정보를 얻으려면 인간 T 세포에서 임상 등급 바이러스 벡터의 소규모 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 마우스 실험을 위한 대조군으로 전통적으로 제조된 CAR-T 세포의 사용을 고려하는 것이 중요합니다( 보충 그림 S1 참조). 이러한 세포를 얻는 것은 어려울 수 있으며 신중한 계획이 필요할 수 있습니다. 고려해야 할 또 다른 요소는 인간 AB 혈청의 사용인데, 이는 세포 성장 및 제품의 기타 특성에 상당한 영향을 미칠 수 있는 잘 정의되지 않은 시약입니다. 이 문제를 해결하려면 여러 로트의 AB 혈청을 테스트하고 세포 성장에 대한 로트 특이적 효과를 평가하기 위한 소규모 실험을 수행하는 것이 좋습니다(보충 그림 S2). 적합한 로트가 확인되면 시험 코호트 전반에 걸쳐 일관성을 보장하고 혈청 로트의 변화로 인한 환자 결과의 배치 효과 위험을 최소화하기 위해 충분히 많은 양을 구매해야 합니다.
요약하면, 프로세서와 포함된 TCT 공정은 높은 비용, 노동 집약적인 생산 및 개방 조작 단계를 포함하여 현재 CAR-T 제조 절차의 몇 가지 한계를 해결할 수 있는 제조 방법을 제공합니다. 이 프로세서는 폐쇄형 반자동 시스템을 제공함으로써 CAR-T 세포 치료제의 가용성과 경제성을 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신속한 제조 및 비바이러스 벡터를 수용할 수 있어 기존 제조 방법에 대한 유연한 대안이 될 수 있습니다. 원하는 목표 용량, 최대 세포 밀도 및 인간 AB 혈청이 세포 성장에 미치는 영향과 같은 요인을 신중하게 고려함으로써 연구자들은 CAR-T 세포의 수확 시간을 최적화하여 최종 제품의 품질과 효능을 보장할 수 있습니다. 공정이 복잡하고 힘들 수 있지만, 방출 테스트를 위한 물류를 계획하고 오염원을 제거하면 위험을 완화하고 성공적인 CAR-T 세포 제조를 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, TCT 공정은 CAR-T 세포 치료의 유망한 길을 제시하며, 현재의 한계를 극복하고 환자 접근성을 개선하여 궁극적으로 암 환자에게 혜택을 줄 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
S.K., S.G. 및 Y.W.는 Miltenyi Biotec으로부터 연구 지원을 받았습니다.
Acknowledgments
저자들은 이 작업에 대한 여러 개인과 조직의 기여에 감사를 표하고자 합니다. 세포 및 유전자 치료 실험실(Cell and Gene Therapy Laboratory)과 펜실베이니아 중개 및 상관 연구 실험실(Penn Translational and Correlative Studies Laboratory)은 공정 개발 및 IND 제출 준비에 귀중한 지원을 제공했습니다. 멜리사 바르게세(Melissa Varghese)와 아만다 디노피아(Amanda DiNofia)는 이 원고의 기초가 되는 IND 제출을 위한 프로세스 개발 및 준비에 기여했습니다. 이 연구는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 유전자 치료 협력 단체의 가속 보조금의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 기술 및 연구 지원에 대해 Miltenyi Biotec에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 copyright © 2023 Miltenyi Biotec BV & Co. KG의 적용을 받습니다. 판권 소유.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
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- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
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