Summary
В этой статье подробно описан процесс производства Т-клеток с химерным антигенным рецептором для клинического использования, в частности, с использованием автоматизированного клеточного процессора, способного выполнять вирусную трансдукцию и культивирование Т-клеток. Мы даем рекомендации и описываем подводные камни, которые следует учитывать при разработке процесса и проведении ранней фазы клинического исследования.
Abstract
Химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки представляют собой перспективный иммунотерапевтический подход для лечения различных злокачественных и доброкачественных заболеваний. CAR-T-клетки — это генетически модифицированные Т-клетки, которые экспрессируют химерный белок, который распознает и связывается с мишенью на поверхности клетки, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, дорогостоящими и могут быть сопряжены с риском загрязнения. CliniMACS Prodigy, автоматизированный клеточный процессор, позволяет производить продукты клеточной терапии в клиническом масштабе в закрытой системе, сводя к минимуму риск загрязнения. Обработка происходит в полуавтоматическом режиме под контролем компьютера и таким образом минимизирует участие человека в процессе, что экономит время и снижает вариативность и ошибки.
В этой рукописи и видео описывается процесс трансдукции Т-клеток (TCT) для производства CAR-T-клеток с использованием этого процессора. Процесс ТСТ включает обогащение, активацию, трансдукцию вирусным вектором CD4+/CD8+ Т-клеток, экспансию и сбор CD4+/CD8+ Т-клеток. С помощью Activity Matrix, функциональности, которая позволяет упорядочивать и определять время выполнения этих шагов, процесс TCT может быть полностью настроен. Мы проводим экскурсию по производству CAR-T-клеток в соответствии с действующей надлежащей производственной практикой (cGMP) и обсуждаем необходимые испытания и доклинические эксперименты, которые будут поддерживать заявку на экспериментальное новое лекарственное средство (IND). Мы демонстрируем осуществимость и обсуждаем преимущества и недостатки использования полуавтоматического процесса для клинического производства CAR-T-клеток. Наконец, мы описываем продолжающееся клиническое исследование, инициированное исследователем, которое нацелено на злокачественные новообразования у детей [NCT05480449] в качестве примера того, как этот производственный процесс может быть применен в клинических условиях.
Introduction
Адоптивный перенос Т-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), показал замечательную эффективность в лечении пациентов с рефрактерными В-клеточными злокачественными новообразованиями 1,2,3,4,5. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, отнимают много времени и требуют высококвалифицированных технических специалистов для выполнения узкоспециализированных этапов. Например, традиционный процесс производства аутологичного CAR-T-клеточного продукта включает в себя центрифугирование с градиентом плотности, элютриацию или магнитную сепарацию для обогащения Т-клеток, активацию и трансдукцию вирусным вектором в стерильной колбе и расширение в биореакторе перед сбором и составлением рецептуры. В последнее время появились различные системы, которые нацелены на частичную автоматизацию этого процесса. Например, Miltenyi CliniMACS Prodigy (далее именуемый «процессор») представляет собой автоматизированное устройство для обработки клеток, которое может выполнять многие из этих шагов в автоматическом режиме 6,7,8,9. Подробное обсуждение традиционных и автоматизированных методов производства CAR-T представлено в недавней обзорной статье10.
Процессор основан на функциональности CliniMACS Plus, одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) медицинского устройства для обработки гемопоэтических клеток-предшественников. Процессор включает в себя блок культивирования клеток, который позволяет выполнять автоматизированную промывку, фракционирование и культивирование клеток (рис. 1). Процесс трансдукции Т-клеток (TCT) представляет собой предустановленную программу в процессорном устройстве, которая в значительной степени повторяет ручное производство CAR-T-клеток. TCT позволяет настраивать обработку ячеек с помощью графического пользовательского интерфейса («Матрица активности», рис. 2). Поскольку процессор автоматизирует множество шагов и консолидирует функциональность нескольких устройств в одной машине, он требует от технологов меньшего обучения и специализированных навыков поиска и устранения неисправностей. Поскольку все этапы выполняются в закрытом комплекте одноразовых трубок, процессор может эксплуатироваться на объектах с менее строгой инфраструктурой обработки воздуха, чем это считается приемлемым для открытого производственного процесса. Например, мы эксплуатируем процессор на предприятии, сертифицированном по классу ISO 8 (сопоставимо с классом C ЕС).
Рисунок 1: Производство CAR-T-клеток с использованием системы трансдукции Т-клеток. На рисунке показан процессор с установленным комплектом трубок. Комплект трубок позволяет соединять другие компоненты, такие как мешки, содержащие буфер для обработки, питательную среду и лентивирусный вектор, с помощью стерильной сварки. После того, как продукт для лейкафереза добавлен в пакет для нанесения, он может быть помечен гранулами для отбора Т-клеток, пропущен через колонку разделения, а затем перенесен в пакет для повторного нанесения. Затем отобранные клетки направляются в блок культивирования прибора для культивирования и активируются активационным реагентом (см. Таблицу материалов). Конечный продукт собирается в ячейковый мешок Target. На протяжении всего процесса возможен отбор образцов для контроля качества асептическим методом. Серые цифры внутри кругов обозначают пронумерованные клапаны на процессоре, которые направляют путь жидкости через комплект трубок. Воспроизведено с разрешения 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Матрица активности. После выбора и активации Т-клеток оставшаяся часть процесса производства CAR-T-клеток полностью настраивается. Действия могут быть добавлены или удалены и запланированы на соответствующий день и время, а также может быть указан объем культуры после действия (Volume). Например, упражнение «Трансдукция» было настроено на начало в 10:00 утра в 1-й день, а объем культивирования в конце упражнения был установлен равным 100 мл. Матрицу активности можно редактировать в течение всего периода выращивания. Состояние процесса можно отслеживать на встроенном экране обрабатывающего устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Цель данной рукописи состоит в том, чтобы предоставить подробное описание производства CAR-T-клеток с использованием процессора, а также дать рекомендации по тестированию в процессе и выпуску продукта, которые, вероятно, потребуются регулирующим органам для одобрения заявки на исследуемый новый лекарственный препарат (IND). Представленный протокол близок к рекомендованному поставщиком подходу и является базовым протоколом для IND 28617, который в настоящее время оценивается в рамках одноцентрового клинического исследования I/II фазы, инициированного исследователем. Данное исследование направлено на определение безопасности и эффективности использования данного процессора для производства гуманизированных CD19-направленных аутологичных CAR-T-клеток у пациентов с В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (B-ALL) или лимфобластной лимфомой линии B (B-Lly) [NCT05480449]. Исследование началось в сентябре 2022 года, и в нем планируется принять участие до 89 пациентов в возрасте от 0 до 29 лет с B-ALL или B-Lly. В рукописи мы приводим некоторые производственные результаты испытаний.
Мы хотели бы отметить, что, несмотря на то, что рукопись представлена в виде протокола с пошаговыми инструкциями, ее следует рассматривать как отправную точку для других людей, чтобы начать оптимизировать свой собственный процесс производства CAR-T-клеток. Неполный перечень возможных вариаций представленного протокола включает: использование в качестве исходного материала свежих вместо криоконсервированных Т-клеток; использование другого метода обогащения Т-клеток или его полное исключение; использование различных сред и цитокиновых коктейлей, таких как IL7/IL15 вместо IL2; варьирование концентрации АВ в сыворотке крови человека или ее полное исключение; время трансдукции; использование «многоударных» трансдукций; различное перемешивание, объемы культивирования и график кормления; использование различных методов генетического переноса, включая электропорацию нуклеиновых кислот или лентивирусных векторов; использование другого буфера для конечной рецептуры и/или криопротектора; и инфузия CAR-T-клеток в свежем виде вместо криоконсервации для инфузии в более позднее время. Эти вариации могут оказывать существенное влияние на клеточный состав и эффективность терапевтического препарата.
| Общий этап процесса | Процессуальный день | Технические детали | |||
| Обогащение клеток | День 0 | Выбор CD4+/CD8+ Т-клеток | |||
| Активация клеток | Посев и активация культуры Т-клеток | ||||
| Клеточная трансдукция | День 1 | Лентивирусная трансдукция (объем культивирования 100 мл) | |||
| Клеточная экспансия (с последующей клеточной формулировкой) | День 2 | -- | |||
| День 3 | Культуральная промывка (1 цикл); Шейкер активирован; Объем культуры увеличивается до 200 мл | ||||
| День 4 | -- | ||||
| День 5 | Корм (50 мл); Объем культуры достигает конечного объема 250 мл | ||||
| День 6 | Образец в процессе обработки; Обмен средами (-125 мл / +125 мл) | ||||
| День 7 | Обмен средами (-150 мл / +150 мл) или Harvest | ||||
| День 8 | Образец в процессе обработки; Обмен средами (-150 мл / +150 мл) или Harvest | ||||
| День 9 | Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest | ||||
| День 10 | Образец в процессе обработки; Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest | ||||
| День 11 | Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest | ||||
| День 12 | Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest | ||||
| День 13 | Урожай | ||||
Таблица 1: График и обзор процесса. В этой таблице обобщены этапы процесса TCT, используемые в текущем клиническом исследовании [NCT05480449]. Процесс начинается с обогащения Т-клеток путем отбора CD4+/CD8+, посева культуры и активации на 0-й день, за которым следует трансдукция в 1-й день. Клетки отдыхают в течение 48 ч с последующей промывкой культуры, увеличением объема культуры до 200 мл и перемешиванием с помощью встряхивающего механизма. На 6-й день отбирается первая проба в процессе производства. Забор клеток осуществляется при наличии достаточного количества клеток для получения по крайней мере трех полных доз CAR-T-клеток (5 × 10 6 CAR-T-клеток/кг, если пациент весит <50 кг, в противном случае 2,5 × 108 CAR-T-клеток) и контроля качества (~2 × 106 CAR-T-клеток); или после того, как культура достигнет в общей сложности 4-5 х 109 клеток. Сокращения: TCT = трансдукция Т-клеток; CAR-T = химерный антигенный рецептор Т-клеток; MACS = магнитно-активируемая сортировка клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования были проведены в соответствии с институциональными рекомендациями с одобрения Институционального наблюдательного совета больницы (IRB), и все субъекты предоставили информированное согласие на публикацию данных, собранных в контексте исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В первом разделе Протокола представлен общий обзор процесса производства CAR-T. В остальных разделах приведены пошаговые инструкции. Протокол описывает рабочий процесс с использованием программного обеспечения TCT версии 1.4, которая является текущей версией на момент написания этой статьи. Пользовательский интерфейс других версий программного обеспечения TCT может отличаться.
1. График и обзор процесса (табл. 1)
- Подготовьтесь к процедуре в понедельник (День -1) с предполетным проверком. Убедитесь, что процессор и другое оборудование работают должным образом, а все реагенты и расходные материалы доступны и актуальны в течение всего производственного цикла.
- На день 0 установите комплект трубок на машину. Предварительно криоконсервированные Т-клетки разморозить в сухой ванне и соединить их стерильной сваркой с комплектом трубок, установленным на приборе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что аутологичные Т-клетки были собраны с помощью афереза, криоконсервированы и сохранены до начала производства. Несмотря на то, что можно использовать свежесобранные Т-клетки, это увеличивает логистическую нагрузку, поскольку требует координации сбора афереза с производством CAR-T-клеток. Мы настоятельно рекомендуем использовать процесс сухого оттаивания вместо водяной бани, чтобы свести к минимуму риск бактериального загрязнения. - Помечают Т-клетки реагентами CD4 и CD8 (см. таблицу материалов) и обогащают магнитной селекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащение Т-клетками можно пропустить или выполнить до загрузки ячеек в процессор. См. раздел 5 Протокола. - После обогащения CD4+/CD8+ клеток берут образец для подсчета клеток. Засевают культуру с 1-2 × 108 клеток в исходном объеме 70 мл среды (см. таблицу материалов) с добавлением 5% АБ сыворотки человека и рекомбинантного человеческого IL2 (25 нг/мл).
- Добавляют флакон с активационным реагентом (коллоидная полимерная наноматрица, конъюгированная с антителами к CD3 и CD28; см. таблицу материалов) для активации Т-клеток и инкубируют культуру без перемешивания в течение 24 ч при 37 ºC в атмосфере 5%CO2 . При необходимости законсервируйте все оставшиеся клетки CD4+/CD8+ в качестве резерва.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае производственного сбоя в качестве исходного материала могут быть использованы оставшиеся отобранные CD4+/CD8+ клетки. Если неисправность является чисто технической, например, загрязнением или ошибкой оператора, и осталось достаточное количество ячеек, то можно рассмотреть возможность использования оставшихся ячеек для выполнения дополнительного производственного цикла. Если качество исходного материала вызывает беспокойство, то может потребоваться новая процедура афереза; Однако, в конечном счете, это клиническое решение. В любом случае, производственный сбой является значительным событием, которое должно быть расследовано, и спонсор и, возможно, регулирующие органы должны быть проинформированы. - Через 24 ч после активации трансдуцируют Т-клетки лентивирусным вектором при соответствующей кратности инфекции (MOI).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом производства клинических препаратов крайне важно определить титр лентивирусного вектора и установить соответствующий MOI. Титр вектора должен быть определен путем проведения мелкомасштабного эксперимента, в котором первичные Т-клетки человека трансдуцируются при различных концентрациях вектора. При выборе соответствующего MOI необходимо учитывать стоимость вектора, требуемую эффективность трансдукции и допустимое число копий вектора. Этот протокол использует MOI 30-50%, чтобы минимизировать стоимость вектора и поддерживать среднее количество копий вектора ниже 8 копий на трансдуцируемую ячейку. - На 3-й день активируйте упражнение «Культурная промывка» и начните низкоуровневое перемешивание. Увеличьте объем культуры до 200 мл.
- На 5-й день добавьте в культуру 50 мл среды, увеличив объем культуры до 250 мл.
- На 6-й день культивирования берут образец из культуры и подсчитывают CAR-T-клетки методом проточной цитометрии. Используйте это измерение, чтобы оценить скорость, с которой растет культура, и определить оптимальное время сбора урожая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый отбор проб в процессе дает 3 мл для тестирования и удаляет в общей сложности 7 мл объема культуры. - С 7-го по 13-й день, если культивирование не было прекращено, возьмите до двух дополнительных проб в процессе обработки через день и выполняйте ежедневный обмен средами для кормления растущей культуры. Собирайте продукт, когда общее количество ядросодержащих клеток (TNC) достигнет 5 × 109 и/или когда будет доступно достаточное количество клеток для необходимого количества доз и тестирования на высвобождение.
- В день сбора урожая возьмите в процессе работы пробу с активно растущей культуры. Используйте этот образец для тестирования на микоплазму, эндотоксин, репликационно-компетентный лентивирус (RCL), определение числа векторных копий (VCN), подсчет клеток, анализ размера клеток, проточную цитометрию и окрашивание по Граму.
- Инициировать программу окончательного сбора, которая запускает удаление питательной среды и промывание клеток буфером для окончательной рецептуры (стерильный изотонический кристаллоидный раствор с добавлением 4% сывороточного альбумина человека; см. таблицу материалов). После того, как сбор урожая завершен, целевой клеточный мешок будет содержать 100 мл клеточного продукта в буфере для окончательной рецептуры. Добавьте диметилсульфоксид (ДМСО) до концентрации 10% (v/v), аликвотируйте продукт в индивидуальные дозы и криоконсервируйте с помощью морозильной камеры с контролируемой скоростью.
2. День -1: Подготовка и предполетный контроль
- Убедитесь, что уровень газаCO2 и сжатого воздуха достаточен для создания давления на входе не менее 20 фунтов на квадратный дюйм в каждой линии.
- Включите процессор и убедитесь в отсутствии ошибок при запуске. При необходимости установите часы на правильное время. Выключите процессор.
- Убедитесь, что известно количество, объем и общее количество CD4+ и общее количество CD8+ исходного материала Т-клеток.
- Обеспечьте наличие достаточного количества вирусного вектора, реагентов и расходных материалов для всего производственного цикла.
- Поместите флакон с сывороткой AB человека в холодильник, чтобы он оттаял на ночь.
3. День 0: Установка комплекта трубок
- Приготовьте 3 л технологического буфера (0,5 % (по массе) сывороточного альбумина человека (HSA) в буфере фосфатно-солевого раствора / этилендиаминтетрауксусной кислоты (PBS/EDTA)).
- Приготовьте 2 л питательной среды (2 л среды с добавлением 100 мл сыворотки крови человека до конечной концентрации 5% и двух флаконов рекомбинантного человеческого IL2 по 25 мкг/флакон; см. таблицу материалов для получения дополнительной информации об этих реагентах). Переложите 10 мл питательной среды в пакет с реагентами объемом 20 мл и храните при температуре 4 ºC в течение ночи.
- Включите прибор и выберите процесс трансдукции Т-клеток (TCT) в интерфейсе сенсорного экрана. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать процесс TCT; Позвольте прибору провести пользователя через процедуру, используя инструкции и подсказки на экране.
- На экране Parameter Input (Ввод параметров ) введите инициалы оператора, номер партии комплекта трубок и срок годности при появлении соответствующего запроса.
- На экране «Настройка процесса» представлены четыре различных процесса. Выберите Полный процесс (1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие доступные процессы включают в себя начало с CD4+/CD8+ выбранных Т-клеток (см. раздел 5 ниже) и перезапуск ранее прерванного производственного цикла. - При появлении запроса выберите два флакона селекционного реагента в соответствии с методом отбора CD4+/CD8+.
- Установите комплект трубок в соответствии с инструкциями на экране. Убедитесь, что все соединения Люэра герметичны и что в комплекте трубок нет дефектов.
- Следуйте инструкциям на экране, чтобы запустить автоматические проверки верхней и нижней целостности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка целостности может завершиться неудачей из-за неисправного комплекта трубок, неправильно установленного комплекта трубок или дефекта перистальтического насоса машины. Мы настоятельно рекомендуем иметь под рукой по крайней мере один дополнительный комплект трубок для производственных циклов. Мы также рекомендуем, чтобы второй технолог проверил правильность установки комплекта трубок. - Следуйте инструкциям на экране по присоединению среды и буферных мешков для обработки.
- Начните автоматическую заливку комплекта трубок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс TCT должен продолжаться в течение 3 часов после заливки. Убедитесь, что исходный материал Т-клеток готов.
4. Обогащение Т-клеток
- Когда появится экран Перенос клеточного продукта, начните размораживание криоконсервированного Т-клеточного продукта .
ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимый объем Т-клеток, которые можно добавить в набор трубок, составляет от 50 до 280 мл. Максимальное количество клеток-мишеней (сумма CD4+ и CD8+) составляет 3 × 109, а максимальное количество TNC — 2 × 1010. - Переложите размороженные клетки в трансферный пакет объемом 150 мл. Стерильно приварите пакет для переноса к пакету для нанесения комплекта трубок.
- Извлеките образец из пакета для нанесения с помощью пакета для контроля качества и выполните подсчет клеток.
- Подсоедините флаконы с реагентами CD4 и CD8.
- Запустите процесс отбора (обогащения Т-клетками).
- После обогащения извлеките образец отобранных CD4+/CD8+ клеток из пакета для контроля качества пакета для повторного нанесения для подсчета клеток, проточной цитометрии и анализа размера клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результат подсчета ячеек необходим для перехода к следующему шагу.
5. Альтернатива: Начиная с выбранных клеток CD4+/CD8+
- Подготовьте среду, как описано в шаге 3.2. Буфер обработки не требуется.
- Включите процессор и выберите Культивирование Т-клеток с установкой TS (3) на экране Process Setup . Следуйте инструкциям и подсказкам на экране.
- Следуя инструкциям на экране, заправьте набор трубок средой вместо буфера для обработки.
- Когда появится экран «Подготовка клеточного продукта культивирования-Подключение», начните размораживание выбранных CD4+/CD8+ Т-клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество Т-клеток (сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток) для процесса составляет 1,0 × 108. - Переложите клетки в пакет для переноса объемом 150 мл и разбавьте средой до конечного объема 50 мл.
- Стерильно приварите клеточную суспензию к мешку для повторного нанесения инструмента.
- Извлеките образец отобранных клеток CD4+/CD8+ из пакета для контроля качества пакета для повторного нанесения для анализа количества клеток и размера клеток.
6. Культурная настройка и программирование Матрицы активности
- Введите концентрацию клеток и желаемое начальное число (1-2 × 108 Т-клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор автоматически перекачивает соответствующий объем из мешка для повторного нанесения в камеру для культивирования и регулирует конечный объем до 70 мл. - Приложите флакон с активационным реагентом в соответствии с инструкциями на экране.
- Введите 5% для концентрации CO2 и 39 °C для температуры в камере культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель рекомендует вводить 39 °C или значение, специально откалиброванное для прибора. - Настройте матрицу действий. Используйте расширенный протокол кормления в качестве отправной точки и измените отдельные шаги в протоколе в соответствии с пользовательскими спецификациями (рис. 2).
- Убедитесь, что время активности трансдукции составляет 24 часа после посева (день 1).
- Убедитесь, что время бактериологической промывки составляет 48 ч после трансдукции (день 3).
- Установите время активации шейкера (шейкер типа 2) на 30 минут после начала промывки культуры.
- Удалите все действия по обмену средних мешков и мешков для мусора .
- Нажмите OK на экране, чтобы начать выращивание.
- Криоконсервируйте все оставшиеся выбранные клетки CD4+/CD8+ в пакете для нанесения для использования в будущем, если это необходимо.
7. День 1: Трансдукция Т-клеток
- Рассчитайте объем лентивирусного вектора для использования на основе желаемого MOI.
- Извлеките пакет с реагентами объемом 20 мл, содержащий 10 мл питательной среды, которая хранилась при температуре 4 ºC в течение ночи (шаг 3.2). Разморозьте флакон с вектором и перенесите объем, рассчитанный в 7.1, в пакет с реагентом объемом 20 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем заморозить любой оставшийся вектор для хранения или для исследований и разработок. - Измените матрицу активности, чтобы установить время трансдукции на 2 минуты в будущем. При появлении запроса нажмите кнопку ОК , чтобы начать действие «Трансдукция».
- Стерильно приварите векторный пакет к набору трубок, следуя инструкциям на экране.
- Измените матрицу действий на основе фактического времени начала действия Трансдукция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем начинать трансдукцию в течение 20-24 часов после посева, чтобы обеспечить выполнение практических действий в обычное рабочее время.- Убедитесь, что время бактериологического промывки составляет 48 ч после трансдукции (день 3).
- Установите время активации шейкера (шейкер типа 2) на 30 минут после промывки культуры (день 3).
- Убедитесь, что время Media Exchange приходится на вторую половину дня (13:00) 6-го дня.
8. День 6: Первая проба в процессе производства
- Нажмите кнопку «Образец » и следуйте инструкциям на экране, чтобы получить образец контроля качества из активной культуры.
- Выполняйте подсчет клеток, анализ проточной цитометрии и размера клеток. Отправьте 1 мл образца для окрашивания по Граму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток следует повторять примерно через день для мониторинга роста культуры. - Приготовьте еще 2 л питательной среды (см. шаг 3.2).
- Добавьте в матрицу заданий задание « Обмен средним мешком », которое должно начаться через 2 минуты в будущем. Настройте действие Media Exchange так, чтобы оно начиналось через 20 минут в будущем. Следуйте инструкциям на экране.
ПРИМЕЧАНИЕ: Media Exchange - это замена питательной среды в камере культивирования. Замена среднего мешка - это замена мешка с питательной средой, подвешенного на инструменте.
9. День сбора урожая (с 7 по 13 день): сбор урожая и криоконсервация
- Нажмите кнопку «Образец » и следуйте инструкциям на экране, чтобы получить образец контроля качества из активной культуры.
- Разделите образец контроля качества на три аликвоты по 1 мл каждый. Используйте 1 мл для анализа проточной цитометрии, подсчета и размера клеток. Используйте 1 мл для тестирования на микоплазму, количество копий вектора, лентивирус, компетентный к репликации, и эндотоксинов. Отправьте окончательный 1 мл для окрашивания по Граму.
- Готовят окончательный буфер (стерильный изотонический кристаллоидный раствор с добавлением 4 % HSA в пакете объемом 2 л, см. таблицу материалов). Сохраните 100 мл этого буфера для приготовления раствора криопротектора на более позднем этапе.
- Измените матрицу действий, чтобы установить время окончания культуры на 2 минуты в будущем и удалите все остальные оставшиеся действия. Следуйте инструкциям на экране, чтобы прикрепить окончательный буфер для состава к набору трубок и начать сбор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессор автоматически перенесет ячейки в пакет целевых ячеек. Объем составит 100 мл. - Возьмите образец объемом 0,5 мл из пакета Target cell bag QC и выполните подсчет клеток.
- Запечатайте пакет для ячеек Target и извлеките его из комплекта трубок. Разделите CAR-T-продукт на соответствующие дозы и криоконсервируйте их в морозильной камере с контролируемой скоростью. Хранят ячейки в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота при температуре ≤ -150 ºC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная формулировка и аликвотирование доз зависят от протокола. Здесь мы приводим пример, в котором три равные дозы CAR-T-клеток и флаконов QC криоконсервируются. За подробностями обратитесь к разделу 10. - Загрузите технологические данные с прибора, снимите и утилизируйте комплект трубок и выполните отключение.
10. Криоконсервация CAR-T-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что CAR-T-клетки криоконсервируются после изготовления и хранятся до тех пор, пока пациент не будет готов к инфузии. Несмотря на то, что можно вводить свежеизготовленные CAR-T-клетки, это увеличивает логистическую нагрузку, поскольку требует координации производства CAR-T-клеток с инфузией CAR-T-клеток. Это может быть проблематично в случае производственного сбоя. В частности, если клинический протокол требует проведения лимфодеплетирующей химиотерапии перед инфузией CAR-T-клеток, мы настоятельно рекомендуем криоконсервацию, поскольку производственный сбой может подвергнуть пациента риску ненужной химиотерапии. Регулирующие органы могут потребовать от исследователей продемонстрировать, что продукт проходит все испытания на высвобождение перед инфузией, чего может быть трудно достичь без криоконсервации.
- Из конечных 100 мл собранного продукта определите и удалите объем, необходимый для соблюдения требуемых доз CAR-T, и флаконы контроля качества (QC) для проведения дополнительных испытаний на высвобождение (например, на жизнеспособность), удержание и стерильность образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно разработать полностью определенную стратегию аликвотирования конечного продукта. Мы предлагаем производить несколько доз препарата, чтобы обеспечить возможность повторных вливаний, при условии наличия достаточного количества материала. Объем продукта 10-20 мл в пакете обеспечивает быстрое размораживание и легкую инфузию путем нажатия шприца. Рекомендуется заполнять каждый продукт до желаемой дозы CAR-T-клеток (например, 5 × 106 CAR-T-клеток на кг или 2,5 × 108 CAR-T-клеток), так как это позволит избежать необходимости расчета дозы в день инфузии. Также рекомендуется криоконсервировать не менее четырех флаконов для контроля качества и учитывать возможность того, что в них могут быть остатки материала; Мы рекомендуем сохранить этот материал, так как он может быть полезен для научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ. - Центрифугируйте ячейки, чтобы уменьшить объем.
- Доведите продукт (продукты) до половины желаемого конечного объема, используя часть буфера для окончательной рецептуры, отложенную на шаге 9.3.
- Приготовьте 2 криопротектора, создав 20% раствор ДМСО в буфере для окончательной рецептуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав криопротектора и концентрация ДМСО могут быть изменены. - Добавьте 2 криопротектора в клетки в равном объеме для получения конечной концентрации ДМСО 10%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность воздействия криопротектора должна быть сведена к минимуму. - Наполните пакеты с дозами и флаконы с контролем качества. Отправьте 1 мл для стерильности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулирующие органы обычно требуют проведения 14-дневного анализа на стерильность конечного продукта. Тем не менее, появляются быстрые тесты на стерильность; В настоящее время наиболее распространен компендиальный 14-дневный метод. - Криоконсервируйте продукты с помощью морозильной камеры с регулируемой скоростью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа замораживания с регулируемой скоростью должна быть проверена на скорость охлаждения от ~ -1 ºC/мин до ~ -45 ºC с компенсацией точки эвтектики. - Храните продукт в паровой фазе в морозильной камере со сверхнизкой температурой жидкого азота при температуре ≤ -150 °C.
11. Экспертиза выполнения процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса TCT из активной культуры отбирается несколько образцов контроля качества. В таблице 2 представлена сетка, которая может помочь читателю упорядочить результаты для справки и рассчитать метрики производительности процедуры. Приведенные ниже термины, состоящие из буквы и цифры (например, «B4»), относятся к ячейкам в сетке этой таблицы. При расчете производительности используются следующие значения: B3 = предварительное обогащение общих ядросодержащих клеток (TNC); B4 = ТНК после обогащения; E2 = сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток в процентах от общего количества клеток исходного продукта афереза; E4 = сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток в процентах от общего количества клеток после обогащения; G2 = CD19+ клетки в процентах от общего количества клеток исходного продукта; G4 = CD19+ клетки в процентах от общего количества клеток после обогащения CD4+/CD8+; B10 = ТНК активной культуры в день сбора урожая.
Таблица 2: Сетка выполнения процедуры. Мы предоставляем эту сетку, чтобы помочь организовать результаты тестирования в процессе, необходимые для расчета статистики производительности процедуры. Строки представляют собой выборки, проанализированные в различные моменты времени во время процедуры, и помечены номерами от 1 до 11. Ряды 6-9 можно использовать для сбора результатов проб, взятых после 6-го дня культивации, но до дня сбора урожая. Столбцы обозначают измеряемые параметры и обозначаются буквами A-H. Поля, затененные серым цветом, не применяются. Некоторые дополнительные поля могут не применяться в зависимости от того, выполняется ли обогащение CD4+/CD8+ в рамках процедуры, а также от продолжительности культивирования. Мы рекомендуем написать «Н/Д» в этих полях. Сокращения: TNC = общее количество ядросодержащих клеток; QC = контроль качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
- Рассчитайте восстановление CD4+/CD8+ клеток после отбора, разделив общее количество CD4+ плюс CD8+ Т-клеток после обогащения на общее количество CD4+ плюс CD8+ Т-клеток до обогащения, используя уравнение (1).
Восстановление CD4+/CD8+ Т-клеток =
(1) - Рассчитайте истощение CD19+ клеток после обогащения, разделив общее количество CD19+ клеток после обогащения CD4+/CD8+ на общее количество CD19+ клеток до обогащения. Поскольку ожидается, что это число будет очень малым, сообщите логарифм этой дроби, как показано в уравнении (2):
Логарифмическое истощение клеток CD19 = log10
(2) - Рассчитайте общий рост в разрез, разделив общее количество клеток в активной культуре при сборе урожая на количество клеток, засеянных по уравнению (3):
Общий рост сгиба =
(3) - Рассчитайте среднесуточный прирост, взяв корень из общего прироста по отношению ко дню сбора урожая, используя уравнение (4):
Среднесуточный прирост = день сбора урожая √ (общий прирост) (4)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты первых трех серий производства CAR-T в рамках исследования NCT05480449 представлены ниже в таблице 3. Исходный материал, вектор, культуральные цитокины и концентрации АТ в сыворотке крови поддерживались постоянными для каждого запуска. Продукты собирали на 7 или 8 день. Среднесуточный прирост клеток составил 46% (увеличение общего количества клеток), что указывает на то, что процесс TCT был эффективным в стимулировании роста клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что процессор может производить консистентные и воспроизводимые продукты CAR-T-клеток.
Окончательные результаты испытаний продукта, сведенные в таблицу 4, показывают, что CAR-T-клетки прошли контроль качества. Жизнеспособность клеток составляла от 88% до 94%, а чистота CD3 Т-клеток составляла 89-93%. Важно отметить, что эндотоксин, микоплазма, стерильность, репликационно-компетентный лентивирус и остаточные лейкозные клетки не были обнаружены. Эти результаты подтверждают, что процесс TCT позволяет получить высококачественные CAR-T-клетки, соответствующие нормативным стандартам для клинического использования.
Для этой процедуры были разработаны три панели проточной цитометрии (рис. 3). К ним относятся панель CD4/CD8 для определения процентного содержания CD4+ и CD8+ Т-клеток до и после обогащения, панель CD19 CAR-T для проверки эффективности трансдукции и панель CD3/CD19 для определения жизнеспособности и содержания остаточных лейкозных (CD19+) клеток в конечном продукте. Результаты этих панелей подтверждают успешное производство CAR-T-клеток и отсутствие остаточных лейкозных клеток в конечном продукте.
В целом, результаты свидетельствуют о том, что процесс ТХТ позволяет производить однородные и высококачественные продукты CAR-T-клеток, пригодные для клинического использования.
Рисунок 3: Анализ методом проточной цитометрии. Стратегия стробирования, используемая для анализа проточной цитометрии, изображена для каждой панели. Ворота нарисованы в виде черных прямоугольников или эллипсов и помечены, а синие стрелки указывают направление стробирования. (A) Панель CD4/CD8. В-клетки определяются как CD19+ субпопуляция, а Т-клетки как CD3+ субпопуляция лимфатических ворот. CD4+ и CD8+ Т-клетки являются подпопуляциями Т-клеточных ворот. (B) Панель CD19 CAR-T. CAR+ Т-клетки определяются как CD19-CAR+ субпопуляция CD3+ Т-клеток. Кроме того, перечислены CD4+ и CD8+ субпопуляции, которые являются CD19 CAR+. (C) Панель CD3/CD19. Эта панель идентична панели CD4/CD8, за исключением того, что в ней отсутствуют маркеры CD4 и CD8. Сокращения: SSC-A = область бокового рассеяния; лимфа = лимфоцит; CD19-CAR = CD19-специфический рецептор химерного антигена; 7AAD = 7-аминоактиномицин D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Бежать # | Исходный материал | Вектор | Культуральные цитокины | AB Сыворотка, % | Окончательный TNC | Общее количество собранных CAR-T-клеток | Общий рост складки | Среднесуточный прирост | День урожая | ||
| 1 | Терпеливый Т-клетки, аферез, Криоконсервированные |
huCART19 | ИЛ2 | 5% | 2,75х109 | 2,24х108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Терпеливый Т-клетки, аферез, Криоконсервированные |
huCART19 | ИЛ2 | 5% | 4,15х109 | 1,14х108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Терпеливый Т-клетки, аферез, Криоконсервированные |
huCART19 | ИЛ2 | 5% | 4,20х109 | 8,40х107 | 21 | 46% | 8 | ||
Таблица 3: Параметры и ростовые характеристики трех серий производства CAR-T в клинических масштабах. Показаны подробные сведения об условиях культивирования, росте и дне сбора урожая для первых трех производственных циклов с использованием процессора для NCT05480449 клинического исследования. huCART19, гуманизированный CD19-направленный лентивирусный вектор CAR. Обратите внимание, что эффективность трансдукции и жизнеспособность этих продуктов приведены в таблице 4. Сокращения: CAR-T-клетки = химерные антигенные рецепторы Т-клетки; TNC = общее количество ядросодержащих клеток.
| Тестирование релизов | ||||||||||
| Проба | Жизнеспособность клеток | CD3 % | Эндотоксин | Микоплазма | Эффективность трансдукции | Остаточные лейкозные клетки | Стерильность День 14 | Последовательность векторной ДНК на клетку | Векторная последовательность ДНК на трансдуцированную клетку | Лентивирус, способный к репликации |
| Спецификация | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3.5 ЕС/мл |
Отрицательная | ≥ 2 % | < 1 % | Нет роста | Отчет о результате | 0.04-8 Копии/трансдуцированная ячейка |
< 50 копий/μг ДНК |
| Результаты | ||||||||||
| Запуск 1 | 90 | 89 | <0,4 | Отрицательная | 36 % | Не Обнаружены |
Нет Рост |
1.04 | 2.89 | Не Обнаружены |
| Запуск 2 | 88 | 93 | <0,4 | Отрицательная | 39 % | Не Обнаружены |
Нет Рост |
1.16 | 2.97 | Не Обнаружены |
| Запуск 3 | 94 | 91 | <0,4 | Отрицательная | 18 % | Не Обнаружены |
Нет Рост |
0.43 | 2.39 | Не Обнаружены |
Таблица 4: Испытания конечной продукции и спецификации выпуска. Технические характеристики, указанные в этой таблице, относятся к NCT05480449 клиническому исследованию (IND 28617). Жизнеспособность после оттаивания, эффективность трансдукции CD3% и содержание остаточных лейкозных клеток определяли методом проточной цитометрии. Эндотоксин измеряли с помощью хромогенного теста на основе лизата амебоцитов, лицензированного FDA. Испытание на стерильность проводили по методике, соответствующей требованиям USP<71>. Микоплазму, порядковый номер векторной ДНК на клетку и репликационно-компетентный лентивирус измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Порядковый номер векторной ДНК на трансдуцированную клетку рассчитывали путем деления порядкового номера векторной ДНК на эффективность трансдукции. Сокращения: EU = единица эндотоксина; IND = исследуемый новый препарат; FDA = Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.
Дополнительный рисунок S1: Доклинические испытания CAR-T-клеток, изготовленных с использованием процесса TCT. Мышам с иммунодефицитом (NSG) вводили клетки ксенотрансплантата лейкоза пациента на 0-й день, а затем лечили CD19-направленными CAR-T-клетками, изготовленными на процессоре («полуавтоматическое производство»), традиционно изготовленными CD19-направленными CAR-T-клетками («стандартное производство») или физиологическим раствором на 7-й день. (А, Б) Выживаемость мышей, получавших полуавтоматические CAR-T-клетки при двух уровнях дозы (0,5 ×10 , 6 или 2 × 106 CAR-T-клеток) по сравнению с физиологическим раствором (p < 0,0001 для обоих уровней дозы). (C) Сравнение полуавтоматических и стандартных CAR-T-клеток при уровне дозы, который, как известно, не является излечивающим для стандартных клеток (0,5 × 10,6 CAR-T-клеток). Выживаемость была значительно выше у мышей, получавших CAR-T-клетки из процессора (p = 0,001). (D) Сравнение полуавтоматических и стандартных CAR-T-клеток при уровне дозы, который, как известно, является лечебным для стандартных CD19 CAR-T-клеток. Выживаемость достоверно не отличалась (р = 0,4). (E) Сравнение CAR-T-клеток из процессора на двух уровнях дозы. Значимый эффект дозы наблюдался с лучшей выживаемостью у мышей, получавших 2 × 106 клеток huCART19 (p = 0,007). Каждая группа состояла из 5 мышей. Сокращения: NSG = non-obese diabetic severe combined immunodeficiency gamma; TCT = трансдукция Т-клеток; CAR-T = Т-клетки химерного антигенного рецептора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Сравнение роста и лентивирусной трансдукции Т-клеток человека, культивируемых в среде, дополненной различными партиями АБ-сыворотки человека. (A) Экспансия человеческих Т-клеток, нетрансдуцированных (UTD) или трансдуцированных лентивирусным вектором CD19 CAR-T (CAR19) в культурах, дополненных тремя различными партиями АБ-сыворотки человека (7J, 22A или 21J). Темпы роста по одному из лотов (22А) были существенно выше, чем по двум другим. (B) Средний процент (3 репликации) клеток CAR19+ в субпопуляциях CD3+ и CD3+/CD4+ или CD3+/CD8+ расширенных ex vivo Т-клеток, полученных от здоровых доноров. Следует отметить, что различия в скорости роста, по-видимому, не влияли на способность клеток поглощать лентивирус, что было определено с помощью проточного цитометрического анализа клеток из расширенных культур. Эффективность трансдукции Т-клеток и субпопуляций CD4+ и CD8+ была одинаковой от культуры к культуре. Столбцы погрешности представляют собой стандартные отклонения 3 повторяющихся культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-клеточная терапия стала перспективным подходом к лечению В-клеточных и других злокачественных новообразований. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток имеют ряд ограничений, таких как высокая стоимость, трудоемкое производство и открытые этапы, которые увеличивают риск загрязнения. В последнее время появилось несколько полуавтоматических платформ, в том числе Miltenyi CliniMACS Prodigy («процессор»), чтобы устранить эти ограничения. Процесс трансдукции Т-клеток (ТСТ), интегрированный в процессор, описанный в данной рукописи, включает обогащение, активацию, вирусную трансдукцию, размножение культуры и сбор урожая Т-клеток в закрытой системе. Конкурирующие автоматизированные платформы клеточных процессоров в настоящее время используются менее широко, но могут иметь лучший мониторинг параметров культуры в процессе производства, выгодную стоимость оборудования или материалов или меньшую занимаемую площадь, что может позволить использовать их в шкафу биобезопасности вместо выделенного пространства в чистом помещении. Важно выбрать платформу, которая оптимально подходит для данного приложения и среды.
Существенным ограничением клеточной и генной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия, является высокая стоимость коммерческих продуктов, что ограничивает доступ к жизненно важной терапии. Это особенно актуально в странах с ограниченными ресурсами и в странах, не входящих в первый мир. Мы обнаружили, что можно производить CAR-T-клетки по значительно более низкой цене, чем сопоставимый коммерческий продукт, при развертывании полуавтоматизированного процесса в условиях академической больницы, в которой в настоящее время имеются чистые помещения, соответствующие требованиям надлежащей производственной практики (cGMP), в контексте лаборатории стволовых клеток и поддержки клинической лаборатории, которая может выполнять некоторые из тестов в процессе производства и высвобождения. При таких обстоятельствах мы обнаруживаем, что предельные затраты на выполнение производственного цикла, включая материалы и рабочую силу для производства, а также все незавершенные и выпускные испытания (но не включая оборудование и помещения), составляют примерно 30 000 долларов США. Следует отметить, что капитальные затраты на оборудование процессора меньше, чем стоимость одного коммерческого продукта CAR-T-клеток.
Одной из потенциальных проблем, связанных с переходом от ручного к автоматизированному методу, является снижение гибкости. Несмотря на то, что процесс TCT запрограммирован с помощью прочных ограничений, он по-прежнему широко настраивается. Этот процесс имеет несколько отправных точек, включая полный процесс с обогащением Т-клетками, полный процесс без обогащения (например, для использования с предварительно обогащенными CD4+/CD8+ клетками, см. раздел 5 Протокола выше) и возобновление прерванного процесса. Кроме того, функция «Матрица активности» позволяет настраивать весь процесс выращивания. В связи с растущим интересом к быстрому производству CAR-T, следует отметить, что при желании можно настроить матрицу активности таким образом, чтобы она начинала сбор уже через несколько часов после трансдукции. Быстрая процедура имеет потенциальную двойную выгоду в виде сокращения времени производства и получения более мощного продукта, избегая дифференциации и потери антилейкозной активности12. Кроме того, был разработан вариант ТХТ для невирусных векторов с использованием электропорации, что еще больше повышает гибкость системы.
Оптимальное время сбора CAR-T-клеток зависит от различных факторов, включая желаемую целевую дозу, необходимое количество доз и максимальную плотность клеток, которую культуральный сосуд может поддерживать без ущерба для жизнеспособности клеток. Производитель рекомендует не превышать 5 миллиардов клеток в объеме 250 мл. Определение желаемой целевой дозы должно основываться на доклинических данных на животной модели. Например, в этом исследовании мы использовали мышей с нокаутом NOD scid gamma (NSG), которым вводили лейкозные ксенотрансплантаты пациента и лечили CAR-T-клетками, чтобы оценить, что эффективная доза составляет примерно от 2 до 5 миллионов CAR-T-клеток на килограмм (дополнительный рисунок S1). Мониторинг размера клеток также может быть полезен для определения оптимального времени для забора CAR-T-клеток. Тщательно учитывая эти факторы, исследователи могут оптимизировать время сбора CAR-T-клеток, чтобы гарантировать, что конечный продукт будет высокого качества и эффективности.
Разработка соответствующего плана тестирования выпуска является критически важным компонентом получения разрешения для приложения IND. Мы представляем набор тестов на выпуск, включая спецификации для нашего IND 28617, и мы считаем, что это будет хорошей отправной точкой для аналогичных продуктов. Тем не менее, мнения регуляторов постоянно меняются, и вариации представленного протокола могут привести к тому, что регуляторы потребуют других тестов или разных порогов спецификаций. Мы настоятельно рекомендуем внимательно ознакомиться с действующими нормативными руководящими документами, такими как Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) «Информация о химии, производстве и контроле (CMC) для исследуемых заявок на новые лекарственные препараты (INDs)»13. Общий принцип заключается в том, что тесты, демонстрирующие безопасность продукта, оцениваются более строго, чем тесты, демонстрирующие эффективность. Как правило, такие тесты, как стерильность, эндотоксин, микоплазма и репликационно-компетентный лентивирус, должны быть валидированы, и должны быть известны критерии их эффективности. В отличие от этого, в ранних фазах испытаний тестам на потенцию уделяется относительно мало внимания, и, возможно, нет необходимости в полной валидации. В недавнем проекте рекомендаций FDA говорится, что «экспрессия трансгена сама по себе как мера потенции может быть достаточной для поддержки ранних фаз исследований IND»14. Кроме того, тесты, которые используются для определения дозы, должны быть валидированы. Это может быть проблематично для новых мишеней CAR, для которых могут отсутствовать какие-либо стандартизированные анализы расхода или эталонные материалы. В этом случае FDA предполагает, что «эталонным материалом для анализа может быть хорошо охарактеризованная партия самого продукта генной терапии». 13 Например, мы установили положительный контроль для анализа потока CD19 CAR с использованием CAR-T-клеток из ранних инженерных запусков.
Разработка и оптимизация производственного процесса для CAR-T-клеточной терапии может быть сложной и трудоемкой задачей, как мы убедились в нашей работе. Мы столкнулись с несколькими проблемами, в том числе с бактериальным загрязнением. Мы настоятельно рекомендуем использовать метод сухого оттаивания для размораживания ячеек, так как водяные бани могут увеличить риск загрязнения. Из-за культивирования даже небольшой посевной материал может привести к откровенному загрязнению, в результате чего продукт станет непригодным для использования. Кроме того, мы рекомендуем планировать логистику для тестирования релизов, которая может включать дополнительные проверки и заключение контрактов с внешними сторонами для обеспечения своевременного и точного тестирования. Еще одним важным элементом при разработке производственного процесса CAR-T является оптимизация эффективности трансдукции. Заявка на IND должна включать данные, демонстрирующие эффективность вирусного вектора. Чтобы выполнить это требование и в то же время получить информацию для оптимизации MOI, мы настоятельно рекомендуем проводить мелкомасштабное титрование вирусного вектора клинического класса на Т-клетках человека. Также важно учитывать использование традиционно производимых CAR-T-клеток в качестве контроля для экспериментов на мышах (как показано на дополнительном рисунке S1). Получение этих клеток может быть сложным и требовать тщательного планирования. Еще одним фактором, который следует учитывать, является использование человеческой АБ-сыворотки, которая является плохо определенным реагентом, который может оказывать значительное влияние на рост клеток и другие характеристики продукта. Чтобы решить эту проблему, мы предлагаем протестировать несколько партий сыворотки AB и провести небольшие эксперименты для оценки влияния партии на рост клеток (дополнительный рисунок S2). После того, как будет определена подходящая партия, следует приобрести достаточно большой объем, чтобы обеспечить согласованность во всей когорте исследования и свести к минимуму риск влияния партии на исходы пациентов, которые связаны с изменениями в партии сыворотки.
Подводя итог, можно сказать, что процессор и входящий в него процесс TCT предлагают метод производства, который может устранить ряд ограничений существующих процедур производства CAR-T, включая высокие затраты, трудоемкое производство и открытые этапы манипуляций. Представляя собой закрытую и полуавтоматическую систему, этот процессор обладает потенциалом для повышения доступности и ценовой доступности CAR-T-клеточной терапии. Он может работать с быстрым производством и невирусными векторами, что делает его гибкой альтернативой традиционным методам производства. Тщательно учитывая такие факторы, как желаемая целевая доза, максимальная плотность клеток и влияние АВ-сыворотки человека на рост клеток, исследователи могут оптимизировать время сбора CAR-T-клеток, чтобы обеспечить качество и эффективность конечного продукта. Несмотря на то, что этот процесс может быть сложным и трудоемким, планирование логистики для тестирования на высвобождение и устранение источников загрязнения может помочь снизить риски и обеспечить успешное производство CAR-T-клеток. В целом, процесс ТКТ представляет собой многообещающее направление терапии CAR-T-клетками, способное преодолеть существующие ограничения и улучшить доступность пациентов, что в конечном итоге принесет пользу пациентам с раком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.K., S.G. и Y.W. получили исследовательскую поддержку от Miltenyi Biotec.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность нескольким лицам и организациям за вклад в эту работу. Лаборатория клеточной и генной терапии и Лаборатория трансляционных и коррелятивных исследований Пенсильванского университета оказали ценную помощь в разработке процессов и подготовке к подаче заявок на IND. Мелисса Варгезе (Melissa Varghese) и Аманда ДиНофиа (Amanda DiNofia) внесли свой вклад в разработку процесса и подготовку к подаче заявок на IND, которые легли в основу этой рукописи. Эта работа была поддержана грантом Acceleration Grant of the Cell and Gene Therapy Collaborative of the Children's Hospital of Philadelphia. Авторы также хотели бы поблагодарить компанию Miltenyi Biotec за техническую и исследовательскую поддержку. На рисунок 1 распространяется авторское право © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Все права защищены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217 (2016).
- Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
- Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).
- Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
- Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
