Удаление пупариума насекомых: метод исследования пупок

Overview

Эта статья описывает технику для удаления пупариум насекомого, сохраняя при этом внутри куколки нетронутыми и, следовательно, пригодны для дальнейшего исследования. Пример протокола показывает процедуру с Drosophila guttifera; однако, этот метод применим к другим видам дрозофилы.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Fukutomi и др., Методы для постановки pupal периодов и измерения пигментации крыла Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Удаление пупариума

ПРИМЕЧАНИЕ Куколки Дрозофилы покрыты структурой, называемой пупариумом. Насекомое мускоморфы (мухи) не проливает свою личиночную кутикулу при окукливания; вместо этого, он затвердевает кутикулу после аполиза, и использует его в качестве защитного покрытия куколки, puparium. Куколка, проживающая внутри пупариума, имеет настоящую куколку, которая очень мягкая и хрупкая. Перед тем, как аполиз происходит вокруг P4(ii), эпителия и пупариум прикрепляются друг к другу, и поэтому удалить пупариум без повреждений очень сложно. После P5 удаление пупария является трудоемким, но полезным для морфологического наблюдения и определения стадий пупок. Процесс осуществляется следующим образом.

1. Прикрепите кусок односторонней ленты на листе бумажного полотенца.
2. Поместите куколку на двустороннюю ленту брюшной стороны вверх(рисунок 1A).
3. Найдите пространство между передней стороной пупариума и внутренней куколки. Возьмитесь и удалите пупариум вокруг этого зазора с помощью типсов, и разоблачить переднюю сторону головы куколки.
4. Вставьте кончик типса, перемещая его параллельно передней-задней оси. Поднимите кончик типса, чтобы локально сломать пупариум. Повторите это действие до тех пор, пока поломка не достигнет задней части пупариума. Убедитесь, что разрыв также образуется между puparium и куколки ноги, и разорвать брюшной стороне пупария и свести к минимуму ущерб внутренней куколки (Рисунок 1B).
5. После нарушения puparium как можно больше, вынул куколку с помощью тонкой кисти (#5/0) (Рисунок 1C).
6. Поместите куколку на лист бумаги, который был увлажнен ddH₂O и помещен в пластиковую чашку Петри (диаметр 60 мм x высота 15 мм). Сфот фотографируете как можно скорее, потому что открытый куколка уязвима и легко становится сухой.
    

Representative Results

Рисунок 1. Иллюстрация удаления пупариума. (A) Поместите пупа брюшной стороны на кусок двусторонний ленты. Удалите переднюю часть пупария. (B) Разбейте пупариум типсами с брюшной стороны. (C) После нарушения puparium, вынул куколку с помощью кисти.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)