Remoção de puparium de insetos: um método para investigação pupal

Overview

Este artigo descreve uma técnica para remover o puparium de um inseto, mantendo a pupa interna intacta e, portanto, apta para uma investigação mais aprofundada. O protocolo de exemplo mostra o procedimento com Drosophila guttifera; no entanto, essa técnica é aplicável a outras espécies de Drosophila.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Fukutomi et al., Métodos para Encenação de Períodos Pupal e Medição da Pigmentação das Asas de Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Remoção de pupário

NOTA Pupas de Drosophila são cobertas por uma estrutura chamada puparium. Um inseto de Muscomorpha (moscas) não derrama sua cutícula larval na pupação; em vez disso, endurece a cutícula após a apolise, e usa-a como uma capa protetora da pupa, o pupário. Uma pupa que reside dentro de um pupário tem uma verdadeira cutícula pupal, que é muito macia e frágil. Antes da apólise ocorrer em torno de P4(ii), epitélio e pupário são ligados e, portanto, remover o puparium sem danos é muito difícil. Depois de P5, remover o puparium é trabalhoso, mas útil para observação morfológica e definição de estágios pupais. O processo é realizado da seguinte forma.

1. Afixe um pedaço de fita dupla face em um pedaço de papel toalha.
2. Coloque uma pupa no lado ventral da fita dupla para cima(Figura 1A).
3. Localize o espaço entre o lado anterior do pupário e a pupa interna. Agarre e remova o puparium em torno desta lacuna usando fórceps, e exponha o lado anterior da cabeça da pupa.
4. Insira a ponta de um fórceps movendo-a paralelamente ao eixo anterior-posterior. Levante a ponta dos fórceps para quebrar localmente o puparium. Repita esta ação até que a quebra atinja a parte posterior do pupário. Certifique-se de que uma lacuna também se forme entre as pernas puparium e pupal, e quebre o lado ventral do pupário e minimize os danos à pupa interna (Figura 1B).
5. Depois de quebrar o pupário o máximo possível, tire a pupa usando um pincel fino (#5/0)(Figura 1C).
6. Coloque a pupa em um pedaço de papel de tecido que foi umedecido com ddH₂O e colocado em uma placa de Petri de plástico (diâmetro de 60 mm x altura 15 mm). Tire fotos o mais rápido possível porque a pupa exposta é vulnerável e facilmente se seca.
    

Representative Results

Figura 1. Ilustração da remoção de pupário. (A) Coloque um lado ventral de pupa sobre um pedaço de fita dupla face. Remova a parte anterior do pupário. (B) Quebre o pupário com fórceps do lado ventral. (C) Depois de quebrar o puparium, tire a pupa usando um pincel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)