Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

مجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب لتوصيف هيكلي أميلويد خال من الملصقات

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

تصف هذه الورقة كيف يمكن تطبيق المجهر ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب لتوصيف التنظيم المحلي داخل الهياكل الفوقية الأميلويد الخالية من التسمية. كما يصف كيفية تحضير العينة وقياسها ، وتجميع الإعداد المطلوب ، وتحليل البيانات للحصول على معلومات حول التنظيم المحلي لألياف الأميلويد.

Abstract

بالمقارنة مع نظيره ذو الفوتون الواحد ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون مفيدة لتجارب التصوير الحيوي بسبب انخفاض السمية الضوئية ، واختراق الأنسجة الأعمق ، والتشغيل الفعال في الأنظمة المزدحمة ، وتقليل الانتقاء الضوئي الزاوي للفلوروفور. وبالتالي ، فإن إدخال تحليل الاستقطاب في المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) يوفر تحديدا أكثر دقة للتنظيم الجزيئي في عينة مقارنة بطرق التصوير القياسية القائمة على العمليات البصرية الخطية. في هذا العمل ، نركز على 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) وتطبيقها في تحديد الترتيب الجزيئي داخل الهياكل الحيوية المعقدة - كرويات الأميلويد. غالبا ما يتم تشخيص الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو باركنسون من خلال الكشف عن مجاميع بروتين الأميلويد التي تشكلت بسبب ضعف عملية اختلال البروتين. يؤدي استكشاف هيكلها إلى فهم أفضل لمسار إنشائها وبالتالي تطوير طرق تشخيص أكثر حساسية. تقدم هذه الورقة ps-2PFM التي تم تكييفها لتحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري ومجاميع البروتين النشواني الكروي. علاوة على ذلك ، نثبت أن التقنية المقترحة يمكن أن تحل التنظيم ثلاثي الأبعاد للألياف داخل الكروية.

Introduction

على مدى العقود الماضية ، على الرغم من حدوث تطور كبير للعديد من تقنيات الفحص المجهري الفلوري للتصوير الحيوي للبروتينات ومجاميعها1 ، فقد تم استخدام عدد قليل فقط لحل ترتيبها المحلي داخل العينة 2,3. تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياةالفلوري 4 لدراسة عدم التجانس الهيكلي الجوهري للهياكل الفوقية الأميلويد الكروية. علاوة على ذلك ، يمكن حل التحديد الكمي للترتيب المحلي داخل الهياكل الحيوية المعقدة والمعبأة بكثافة مثل spherulites باستخدام طرق حساسة للاستقطاب3. ومع ذلك ، فإن تقنيات التألق القياسية مع اختراق الأنسجة السطحية محدودة لأن استخدام الأطوال الموجية للأشعة المرئية وفوق البنفسجية لإثارة الفلوروفورات في الجسم الحي يؤدي إلى تشتت ضوء الأنسجةالعالي 5. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتطلب هذا التصوير تصميم وربط مجسات فلورية محددة بجزيء حيوي مستهدف ، وبالتالي زيادة تكلفة ومقدار العمل اللازم لإجراء التصوير.

في الآونة الأخيرة ، لمعالجة هذه المشكلات ، قام فريقنا بتكييف الفحص المجهري الفلوري المثار ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب (ps-2PFM) للتصوير الخالي من الملصقات للهياكل البيولوجية 6,7. يسمح Ps-2PFM بقياس اعتماد شدة مضان الفوتون على اتجاه الاستقطاب الخطي لحزمة الإثارة وتحليل استقطاب التألق المنبعث8. يتطلب تنفيذ هذه التقنية تكملة مسار إثارة إعداد المجهر متعدد الفوتون القياسي (الشكل 1) بلوحة نصف موجة للتحكم في مستوى استقطاب الضوء. بعد ذلك ، يتم إنشاء الرسوم البيانية القطبية ، التي تصور اعتماد شدة التألق المثارة ثنائية الفوتون على استقطاب شعاع ليزر الإثارة ، من الإشارات التي تم جمعها بواسطة اثنين من الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي ، وبالتالي جمع المكونين المتعامدين بشكل متبادل لاستقطاب التألق.

الخطوة الأخيرة هي عملية تحليل البيانات ، مع مراعاة تأثير العناصر البصرية ، مثل المرايا ثنائية اللون أو هدف الفتحة العددية العالية ، على الاستقطاب. نظرا لطبيعة عملية الفوتونين ، توفر هذه الطريقة كلا من اختيار الصورة الزاوي المنخفض والدقة المحورية المحسنة ، حيث أن إثارة الفوتون الثنائي للفلوروفورات خارج المستوى البؤري محدودة على الأرجح. وقد ثبت أيضا أنه يمكن تنفيذ طرق مماثلة بنجاح للتصوير في الجسم الحي لمجسات الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) لتصوير الأنسجة العميقة9. تم تطبيق Ps-2PFM سابقا على صور الفلوروفورات في أغشية الخلايا10 و DNA11,12 ، بالإضافة إلى علامات الفلورسنت غير القياسية للأنظمة البيولوجية ، مثل جسيمات الذهبالنانوية 13. ومع ذلك ، في كل هذه الأمثلة ، تم الحصول على المعلومات حول تنظيم الجزيئات الحيوية بشكل غير مباشر وتتطلب توجها متبادلا محددا مسبقا بين الفلوروفور والجزيء الحيوي.

في إحدى أوراقنا الأخيرة ، أظهرنا أنه يمكن تطبيق ps-2PFM بنجاح لتحديد الاستقطاب المحلي للتألق الذاتي للهياكل الفوقية للأميلويد والتألق من Thioflavin T ، وهي صبغة خاصة بالأميلويد ، مرتبطة بألياف الأميلويد في كروية6. علاوة على ذلك ، في واحد آخر ، أثبتنا أنه يمكن استخدام ps-2PFM للكشف عن اتجاه ليفي الأميلويد داخل كرويات الأميلويد في نظام حجم دون ميكرون ، وهو ما تم تأكيده من خلال ربطه بالتصوير المجهري الإلكتروني (TEM)7. كان تحقيق هذه النتيجة ممكنا بفضل أ) التألق الذاتي الجوهري للكرويات-الأميلويدات ، عند إثارته إما بفوتون واحد أو فوتونين ، يظهر تألقا ذاتيا جوهريا مع الحد الأقصى للانبعاثات الموجود في نطاق من 450 إلى 500 نانومتر ومقطع عرضي لامتصاص الفوتون يمكن مقارنته بالأصباغ الفلورية القياسية14 ، ii) النماذج الرياضية التي تم تقديمها سابقا لوصف كيفية تطبيق ps-2PEF للأصباغ التي تضع علامات على الأغشية البيولوجية وهياكل الحمض النووي مضان أظهرته كرويات وأصباغ مرتبطة بها8،11،15. وبالتالي ، قبل الشروع في التحليل ، نوصي بشدة بالنظر في النظرية المطلوبة الموضحة في كل من النص الرئيسي والمعلومات الداعمة لورقتنا الأولى المتعلقة بهذا الموضوع6. هنا ، نقدم بروتوكول كيفية تطبيق تقنية ps-2PFM للتوصيف الهيكلي للأميلويد الخالي من الملصقات لكويات الأنسولين البقري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير شرائح المجهر مع كرويات كاملة النمو

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. تم تحضير جميع المحاليل بالماء منزوع الأيونات (18.2 متر مكعب سم عند 25 درجة مئوية) تم الحصول عليها من نظام تنقية المياه.

  1. احتضان كرويات الأميلويد بناء على البروتوكول الذي وصفه كريبس وآخرون16. مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه.
    1. تزن 10 ملغ من مسحوق الأنسولين في أنبوب 1.5 مل.
    2. قم بإذابة المسحوق بحصة 1 مل من محلول H2O / HCl منزوع الأيونات (درجة الحموضة 1.5).
    3. أغلق العينة بالشريط وضعها في خلاط حراري لاحتضانها لمدة 24 ساعة عند 70 درجة مئوية (0 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: لإجراء تصوير الأميلويدات في بيئتها الأصلية (أي المائية) ومنع تشوه العينة بسبب الجفاف ، من الضروري تحضير شرائح المجهر وفقا للوصف التالي (المخطط الموضح في الشكل 2).
  2. اغسل شريحة زجاج المجهر جيدا بالماء.
  3. اغمس الشرائح في الميثانول واتركها حتى تجف في ظل الظروف المحيطة على منديل خال من الغبار.
  4. خذ حصة 100 ميكرولتر من محلول spherulite من الأنبوب باستخدام ماصة أوتوماتيكية (الخطوة 1.1.2) وأضفها إلى البئر الموجود في المنطقة المركزية من شريحة المجهر.
  5. قم بتغطية المحلول بغطاء ، وتجنب تكوين فقاعة الهواء.
  6. قم بتركيب الرواسب على طول حواف الغطاء على الشريحة باستخدام ماصة أوتوماتيكية لإغلاق المحلول الأصلي للكرويات.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان إيداع حامل الشريحة على كل من غطاء الغطاء وكذلك الأسطح المنزلقة. افعل ذلك تحت غطاء الدخان بسبب سمية المذيب المتطاير (الزيلين). انظر الجزء الداخلي في الشكل 2.
  7. اترك عينة المجهر في ظل الظروف المحيطة حتى يتصلب المركب.
    ملاحظة: تعتمد عملية التصلب على درجة الحرارة والرطوبة ولكن يجب إكمالها في غضون 12 ساعة.
  8. تحقق مما إذا كانت كرويات الأنسولين قد تشكلت بشكل صحيح باستخدام المجهر البصري المستقطب (POM) مع المستقطبات المتقاطعة. امسح العينة بحثا عن نمط مميز للمناطق الساطعة، يسمى الصليب المالطي، كما هو موضح في الشكل 3.
    ملاحظة: يمكن تعريف كرويات الأميلويد على أنها هياكل فوقية كروية تتميز بمورفولوجيا غير متجانسة ذات بنية قشرة أساسية. بالتفصيل ، فهي تتألف من نواة غير متبلورة وألياف الأميلويد المتنامية شعاعيا16. نظرا للطابع متباين الخواص للهياكل الكروية ، يمكن أن تتفاعل بشكل مميز مع الضوء المستقطب (على سبيل المثال ، عن طريق الانكسار) وتغيير طورها ، والذي يمكن ملاحظته بسهولة تحت POM مع المستقطبات المتقاطعة. تم استخدام هذه الطريقة لدراسة الكرويات المطورة بالكامل فقط والتي تتميز بنمط متقاطع يشبه النموذج. وبالتالي ، تم استبعاد الركام أو الكرووليت المشوه هيكليا من مزيد من التحقيقات.

2. بناء ومواءمة النظام

ملاحظة: يمكن العثور على تمثيل تخطيطي لمجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب في الشكل 1.

  1. قم بتثبيت ليزر فيمتو ثانية مع قابلية ضبط الطول الموجي الناتج في نطاق 690-1080 نانومتر ، على سبيل المثال ، يعمل على وضع مغلق Ti: ليزر الياقوت مع ~ 100 fs نبضات بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز.
  2. أضف لوحة نصف موجة مثبتة على مرحلة دوران إلى مسار الإثارة الخاص بالإعداد للتحكم في استقطاب الضوء الساقط في مستوى عينة المجهر XY.
  3. قم بتثبيت المرآة ثنائية اللون لقطع شعاع الإثارة من بصريات الكشف.
    ملاحظة: يجب أن تسمح الخصائص البصرية للمرآة ثنائية اللون بعكس حزمة الإثارة (للعينة) في نطاق الأطوال الموجية NIR وأن تكون شفافة في نفس الوقت لنطاق الطول الموجي المقابل للانبعاث من العينات.
  4. قم بتثبيت مرحلة مسح كهرضغطية لعمليات المسح النقطية داخل المستوى XY ل Z المختار.
  5. قم بتركيب هدف الغمر العالي NA ، على سبيل المثال ، هدف غمر الزيت apoochromatic 100x / 1.4 NA.
    ملاحظة: نظرا لأن الإعداد بأكمله يعمل في وضع التألق الوبائي، فإن الإشارات الساقطة والمنبعثة تمر بنفس الهدف.
  6. في مسار الانبعاث ، أضف مقسم شعاع مستقطب يقسم الانبعاث المثار ثنائي الفوتون إلى مكونين مستقطبين بشكل متعامد (IX و IY)
  7. قم بتركيب اثنين من الثنائيات الضوئية لعد الفوتونات (APDs) في تكوين يسمح لهما بجمع الضوء المنقول والمنعكس باستخدام مقسم الحزمة ، على التوالي (الشكل 1).
  8. قم بتركيب مرشحات القطع الصحيحة المعتمدة على الطول الموجي على مسار الإثارة والانبعاث للنظام ، على سبيل المثال ، مرشح تمرير طويل 800 نانومتر مباشرة في المسار البصري للإثارة ومرشح تمرير قصير 700 في مسار الانبعاث.
    ملاحظة: قم بتحليل أطياف الانبعاث من spherulite بحيث يمكن استبعاد أي مساهمة محتملة من الجيل التوافقي الثاني (SHG) أو ضوء الليزر باستخدام مرشحات الانبعاث الصحيحة. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا النظام يجب أن يسمح أيضا بقياسات SHG الحساسة للاستقطاب ، والتي يمكن استخدامها لحل ترتيب الجزيئات الحيوية داخل العينات. ومع ذلك ، فإن تحليل البيانات لإشارة SHG يختلف عن التألق ، والذي وصفه Aït-Belkacem et al.17 بمزيد من التفصيل.
  9. قم بمحاذاة النظام بأكمله (باستخدام وضع المحاذاة المدمج في العديد من أجهزة الليزر) حتى يتم جمع شدة إشارة مماثلة باستخدام كل من الثنائيات الضوئية.
  10. تحقق مما إذا كان شعاع الإثارة الذي يركز عليه هدف NA العالي والمصور على الكاميرا له شكل دائري متحد المركز كما هو موضح في الشكل 4A.
  11. اضبط وقت المسح والطاقة المقابلة لتقليل الضرر الناجم عن الليزر الساقط على العينة. يتم عرض حرق مثالي يشبه النقطة في الشكل 4B. قم بقياس الطاقة الاسمية باستخدام مقياس طاقة رقمي محمول باليد متصل بجهاز استشعار طاقة الصمام الثنائي الضوئي الموجود عند مدخل جسم المجهر.
    ملاحظة: يمكن حرق العينات البيولوجية بسهولة بسبب إضاءة الليزر. في هذه الحالة ، وجد أن نطاق الطاقة 100-900 μW (عند النقطة البؤرية للعدسة الموضوعية) هو مقايضة ممتازة بين استقرار العينة والانبعاثات الشديدة.
  12. قبل قياس العينة ، اختبر جودة محاذاة البصريات مع عينة مرجعية متباينة الخواص (على سبيل المثال ، الفلوريسئين المتجسد في البوليمر غير المتبلور). لإجراء فحص المعايرة ، اتبع الإجراء الموضح في القسم 3 باستخدام مرجع الخواص بدلا من عينة الأميلويد.
    ملاحظة: مع افتراض أن إعداد الفحص المجهري يتم ضبطه بشكل مثالي للعينة ذات الخواص الخواص ، يجب تمييز كل من مكونات انبعاث 2P (IX و IY) المكتشفة مع اثنين من APDs بنفس الكثافة (الشكل 4C).

3. قياس كرويات الأنسولين البقري

ملاحظة: لإجراء جميع قياسات ps-2PF الموصوفة ، تم استخدام برنامج مكتوب بخط اليد ، والذي يتحكم في مواضع المرحلة الكهرضغطية ونصف الصفيحة الموجية ويجمع الإشارة من كل من الثنائيات الضوئية ، مما يسمح برسم عمليات المسح XY (المسح النقطية) من مناطق محددة على شرائح المجهر وكذلك الرسوم البيانية القطبية من إحداثيات عينة محددة. كما تمت إضافة ملاحظات إضافية إلى البروتوكول ، والتي ستسمح للمستخدمين بإجراء القياس بدونها ، حيث يمكن التحكم في كل من مرحلة بيزو ومرحلة الدوران المستخدمة لتدوير لوحة نصف الموجة باستخدام وحدات التحكم الخاصة بهم أو البرامج المقابلة. ومع ذلك ، يوصى بشدة بكتابة خوارزمية تجمع بين زاوية دوران لوحة نصف موجة مع شدة 2PEF التي تم جمعها مع كل من الثنائيات الضوئية لأن هذا الارتباط (الرسوم البيانية القطبية) أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات المناسب مما يؤدي إلى معلومات هيكلية.

  1. قم بتركيب العينة باستخدام الكرووليت على المسرح الكهرضغطية (شل حركة الشريحة الزجاجية بشريط). تأكد من تركيبه بطريقة يواجه فيها جانب زجاجي رفيع (غطاء الغطاء) الهدف حيث تتميز الأهداف العددية العالية بمسافات عمل قصيرة نسبيا.
    ملاحظة: عند استخدام غمر الزيت ، يجب وضع قطرة صغيرة من الزيت المعدني على الهدف قبل تركيب العينة وتركيزها.
  2. من خلال تغيير مواضع XY و Z باستخدام مقابض المجهر ، ركز الهدف على أحد الكرويات الموجودة في المحلول ، ولكن اعلم أنه نظرا لأن أقطار الكروية عادة ما تكون في نطاق عشرات الميكرومتر ، ركز داخل المنطقة المركزية للهيكل بأكمله. ابحث عن الهالات السوداء والبيضاء حول الكروية المحددة كعلامات على التركيز السفلي والعلوي ، على التوالي. اضبط المحور "Z" ليكون بين هذين النقيضين.
    ملاحظة: من المهم العثور على عينة معزولة بدون عيوب هيكلية. قد تنجرف الكرويات الصغيرة للغاية بسبب الإجهاد المادي الناتج عن الهدف بينما من المحتمل أن تكون الهياكل الأكبر مجمعة أو مشوهة للغاية.
  3. قم بتوسيط الكروية في مجال رؤية المستوى المجهري المرصود وحدد حجم المسح XY من خلال النظر في عدد خطوات المرحلة الانضغاطية في الاتجاهين X و Y (المعروضة على وحدة التحكم في مرحلة الانضغاطية أو في برنامجها) اللازمة لتغطية مساحة الهيكل بأكمله.
    ملاحظة: يوصى بضبط النظام بحيث تكون بداية فحص XY بالقرب من أحد أركان الكروية وتتزامن مع موضع الصفر للمرحلة (X و Y = 0)
  4. اضبط معلمات المسح التالية:
    1. اضبط استقطاب حزمة الإثارة ، وقم بتدوير لوحة نصف الموجة للحصول على الاستقطاب المقابل للمحورين "X" و "Y" لمستوى عينة المجهر.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك عن طريق قياس الرسوم البيانية القطبية لوسط الفلورسنت الخواص مثل الفلوريسين. بالنسبة لمثل هذه المواد ، تكون شدة التألق القصوى موازية لاستقطاب شعاع الإثارة ؛ وبالتالي ، فإن تدوير لوحة نصف الموجة يضبط الاستقطاب مع المحور X و Y على مستوى المراقبة ، والذي يشار إليه أيضا بالمحور X و Y على الرسوم البيانية القطبية كما في الشكل 4C. يمكن قياس الرسوم البيانية القطبية الكاملة من خلال جمع شدة 2PEF المقاسة على كل من الثنائيات الضوئية لدوران 180 درجة للوحة نصف الموجة (دوران 360 درجة لاستقطاب ضوء الإثارة) وربط الشدة بزاوية استقطاب ضوء الإثارة. يمكن القيام بذلك يدويا ، عن طريق قياس كثافة الانبعاثات لكل زاوية لوحة نصف موجة بشكل منفصل ثم تجميعها في رسم بياني قطبي في برنامج تحليل البيانات أو تلقائيا ، باستخدام برنامج مخصص أو مكتوب ذاتيا.
    2. اضبط معلمات مرحلة الانضغاطة: سرعة المسح والخطوة والنطاق لتغطية مساحة الكرة الأرضية بأكملها.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق المسح أعلى من قطر الكروية لتأطير البنية الفوقية بالكامل داخل المسح النقطي. تسمح سرعة المسح المنخفضة والخطوة للمستخدمين بالحصول على صور عالية الجودة ؛ ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى حرق العينة. لذلك ، من الضروري إجراء مقايضة تعتمد على حجم الكروية. لا يمكن تطبيق هذه المعلمات عالميا. المعلمات النموذجية المستخدمة في الشكل 5A: نطاق المسح 45 × 45 ميكرومتر ، خطوة المسح 1 ميكرومتر ، وسرعة المسح 2 ميكرومتر / ثانية.
  5. افتح الغالق ، وقم بتشغيل الثنائيات الضوئية ، وجمع Equation 1 Equation 2 مكونات انبعاث 2P لكل خطوة من منطقة المسح المحددة - لاستقطاب شعاع الإثارة بما يتوافق مع X ثم محاور Y. يتم عرض المسح النقطي النموذجي ثنائي الفوتون (2PAF) للكرويات الأنسولينية في الشكل 5A.
    ملاحظة: يتطلب قياس عمليات المسح النقطية ربط إحداثيات مرحلة بيزو بمكونات Equation 1 الانبعاثات المجمعة Equation 2 ، والتي يمكن إجراؤها يدويا ، عن طريق قياس الكثافة في كل نقطة من المنطقة المحددة ثم تجميعها في مصفوفة 2D ، أو تلقائيا ، عبر برنامج مكتوب ذاتيا. يمكن تقديم عمليات المسح النقطية كجمع لكثافة Equation 1 مكونات الانبعاثات Equation 2 أو بشكل مميز لمكون انبعاث معين. نظرا لأنها تعتمد بشكل كبير على البنية ، فإن التشوهات الهيكلية داخل الكرويات يمكن رؤيتها بسهولة. ومع ذلك ، بسبب حركة مرحلة المجهر ، قد تنجرف بعض العينات من مجال الرؤية. لذلك ، يجب فحص الصور بحثا عن القطع الأثرية. من الضروري التحقق من موضع الكروية قبل وبعد الفحص.
  6. لإجراء تحليل الاستقطاب الكامل من البقعة المحددة في العينة ، قم بإيقاف تشغيل شعاع الإثارة.
  7. بعد ذلك ، اختر إحداثيات محددة من مرحلة الضغط المقابلة للموقع المختار على الكروية حيث تكون المعلومات حول اتجاه الجزيئات مطلوبة بدقة دون ميكرومتر.
  8. اضبط المرحلة الكهرضغطية لتوسيط مجال الرؤية عند الإشارة (X ، Y).
  9. قم بتشغيل شعاع الإثارة وقم بإجراء تحليل Equation 1 استقطاب كامل (360 درجة) وانبعاث Equation 2 عن طريق تشغيل دوران لوحة نصف الموجة (دوران 180 درجة). قدم مكونات 2PF IX و Iy في شكل رسم بياني قطبي (كما هو موضح في الشكل 5B).
    ملاحظة: يمكن تكرار هذه الخطوة في مواقع مختلفة في العينة لجمع كمية كافية من البيانات.

4. تحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري

ملاحظة: تم إجراء جميع الحسابات العددية المتصلة بتحليل البيانات باستخدام لغة برمجة Python واستنادا إلى الوظائف المتوفرة في مكتبات NumPy و SciPy. يتطلب رسم البيانات مكتبة Matplotlib. تستند جميع الحسابات إلى الصيغ المقدمة في المعلومات الداعمة في إحدى الأوراق التي كتبها Obstarczyk et al.6.

  1. محاكاة شدة مضان ثنائي الفوتون متحمس للتوزيع المحدد للجزيئات مع اتجاه محدد لاستقطاب الضوء الساقط (يشار إليه بالرمز α)
    ملاحظة: تستند الصيغ المقدمة إلى افتراض الامتصاص المتوازي ولحظات الانبعاث ثنائي القطب للفلوروفور. لمناقشة الحالات الأخرى (على سبيل المثال ، الاتجاهات المختلفة لعزوم ثنائي القطب للامتصاص والانبعاث ، ونقل الطاقة بين الفلوروفورات) ، انظر ورقة Le Floc'h et al8.
    1. أوجد المعلمات التي تمثل تغير المجال الكهربائي عن طريق خلط الاستقطاب وتأثيرات إزالة الاستقطاب التي تسببها المرآة ثنائية اللون المثبتة في الإعداد:
      1. يمثل γ عامل السعة بين انعكاسية Equation 3 الضوء المستقطب Equation 4 والمستقطب من مرآة ثنائية اللون.
      2. يمثل δ إزاحة الطور (الإهليلجية) بين Equation 3 الضوء المستقطب Equation 4 .
        ملاحظة: يعد تحديد هاتين المعلمتين بشكل صحيح أمرا بالغ الأهمية لنجاح التوصيف الهيكلي بسبب تأثيرهما القوي على شكل الرسوم البيانية القطبية المقاسة11,18. في حالة النظام المقدم ، تم تحديد كلا المعلمتين أثناء قياسات القياس الإهليلجي لمرآة ثنائية اللون مطبقة في النظام.
    2. احسب متجهات المجال الكهربائي الساقطة التي تنتشر في المحورين X و Y لكل زاوية تم قياسها أثناء قياس ps-TPFM باستخدام المعادلات (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      ملاحظة إذا تم قياس الشدة على 360 درجة بأكملها مع الخطوة 1 درجة، حساب متجهات المجال الكهربائي لجميع 360 درجة. يجب أن تكون جميع الزوايا بالراديان. ρ المعلمة متصلة بالتردد البصري ω للمجال الكهربائي المحاكي (ρ = ω ·t) وتستخدم متكاملة من 0 إلى 2π أثناء حسابات متجهات المجال الكهربائي الساقطة التي تنتشر في المحور X و Y لكل زاوية α قياسها أثناء قياس ps-TPFM.
    3. تحديد دوال العزوم ثنائية القطب الانتقالية في اتجاهات ثلاثة محاور للنظام الديكارتي وفقا للمعادلات (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      ملاحظة: φ هي زاوية اتجاه المحور الطويل لألياف الأميلويد في إطار العينة XY. θ وزوايا φ هي الزوايا القطبية والسمتية المستخدمة لتحديد اتجاه عزم ثنائي القطب الانتقالي للفلوروفور.
    4. استخدم الدالات المحددة في الخطوة 4.1.3. لتحديد وظائف Jx (Φ ، θ ، φ) و JY (Φ ، θ ، φ) ، والتي تمثل مساهمة تركيز الضوء الضيق مع هدف الفتحة العددية العالية في اكتشاف استقطاب التألق في اتجاه X و Y باستخدام المعادلات (9 ، 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      ملاحظة: ترتبط عوامل K1 و K2 و K3 بهدف المجهر المستخدم أثناء قياس ps-TPFM. في هذه التجارب ، تم استخدام هدف غمر الزيت apochromatic 100x / 1.4 NA وكانت عوامل K1 و K2 و K3 2.945 و 0.069 و 1.016 على التوالي.
    5. تحديد دالة ل f (Ω) ، وهو توزيع زاوي جزيئي ، اعتمادا على نصف فتحة مخروط الفلوروفور Ψ ، بسمك متغير ΔΨ ؛ استخدم المعادلة (11). يتم عرض التمثيل البياني لجميع الزوايا الثلاث المتعلقة بالألياف النشوانية في الشكل 6.
      Equation 15(11)
      ملاحظة: كن حذرا أثناء كتابة الأس - قوة 2 تعمل على وسيطة الدالة ، وليس الدالة بأكملها!
    6. حدد جميع عوامل fWWIJKL كما هو موضح في المعادلات (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. احسب شدة Equation 26 التألق المثارة ثنائية الفوتون ولكل Equation 27 زاوية مقاسة (كما في النقطة 4.1.2) باستخدام المعادلات (22 ، 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. تحقق مما إذا كانت المحاكاة تعمل بشكل صحيح باستخدام قيم المتغيرات التالية (الموضوعة في وسيلة الإيضاح إلى الشكل 7) وقارن النتائج التي تم الحصول عليها بالشكل 7A-C.
      ملاحظة: يجب كتابة جميع الدرجات بالراديان.
  2. تناسب الشدة المحاكاة مع شدة التألق الذاتي ثنائي الفوتون لكرويات الأنسولين البقري التي تم جمعها أثناء قياسات ps-2PFM.
    ملاحظة: يتطلب حل بنية الكروية بناء على قياسات ps-2PFM استخدام المعادلات المكتوبة في البروتوكول لمحاكاة الكثافة النظرية للتألق المثار ثنائي الفوتون وملاءمة جميع المعلمات المتصلة بترتيب الفلوروفور الجزيئي. يتطلب تكرارات متعددة على القيم المختلفة ل Φ ، زاوية تصف دوران الألياف في عينة المجهر XY ، و ΔΨ ، انحرافات التوزيع المخروطي لثنائي القطب الانبعاث Ψ بسبب الدورات الجزيئية في خيوط ثابتة Ψ حتى الوصول إلى أعلى معامل R2 ممكن بين شدة إشارة التألق المثارة ثنائية الفوتون التي تم جمعها أثناء القياس والشدة الطبيعية التي تمت محاكاتها وفقا ل الخطوة 4.1 من البروتوكول.
    1. أوجد نصف الزاوية Ψ .
      ملاحظة: بالنسبة لكرويات الأنسولين البقري ، يجب أن تكون مساوية ل Ψ = 29 ° 6.
    2. سير العمل المناسب:
      1. اختر قيمة Φ من 0 درجة إلى 180 درجة (في الشكل 8A و 8B Φ = 16 درجة و 127 درجة على التوالي).
      2. اختر قيمة ΔΨ من 0 درجة إلى 90 درجة (في الشكل 8 أ ، ب ، δψ = 24 درجة و 1 درجة ، على التوالي).
      3. احسب Equation 28 (المعادلة 22) و Equation 30(المعادلة 23) للنطاق المقاس الكامل لزوايا θ باستخدام القيم المختارة ل Φ و ΔΨ.
      4. قارن الشدة المحسوبة أثناء عمليات المحاكاة (كلاهما طبيعي إلى القيمة القصوى ل
      5. احسب Equation 28) مع شدة طبيعية من
      6. احسب Equation 1 و Equation 2 (كلاهما طبيعي إلى الحد الأقصى لقيمة Equation 1) المقاسة أثناء قياس ps-2PFM.
        ملاحظة: في التجارب المقدمة ، تم حساب معاملات ارتباط عزم منتج بيرسون باستخدام دالة "corrcoef" من مكتبة NumPy Python.
    3. في النهاية ، اختر قيم Φ و ΔΨ مما يؤدي إلى أعلى معاملات الارتباط والتقارب بين الشدة المحاكاة والإشارة المقاسة المشابهة لما هو موضح في الشكل 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر البروتوكول المقدم إرشادات خطوة بخطوة من خلال إعداد الهياكل الفوقية للأميلويد للاختبار باستخدام ps-2PFM ، وبناء النظام المجهري ، وقياسات العينة المناسبة. ومع ذلك ، قبل المجموعة النهائية من القياسات ، من الضروري محاذاة APDs بشكل صحيح مع مرجع الخواص ، مما يؤدي إلى جمع إشارة متناظرة ذات شكل وشدة متشابهين على كلا الكاشفين (الشكل 4C). حتى الحد الأدنى من الاختلافات بين الشدة المقاسة على أجهزة الكشف في المحورين X و Y يجب أن تؤخذ في الاعتبار في القياسات الإضافية وخاصة أثناء التحليل كعامل تصحيح مناسب. بعد التركيب ، تحتوي العينة على كرويات مفردة ، مما يعطي صليبا مالطيا مميزا على POM كما في الشكل 2B ، وبعد إجراء مسح نقطي 2PFM ، يجب أن تبدو الصورة مشابهة لما هو موضح في الشكل 5A ، وهو ما يتوافق مع عمليات المسح النقطية 2PFM المبلغ عنها للكرويات 6,7 والجزيئات الحيوية المنظمة المختلفة11,12. يمكن للمرء أن يلاحظ بعض التغييرات في موقع المحور بأعلى سطوع ، والذي يرتبط بحقيقة أن شدة إشارة التألق تعتمد بشدة على استقطاب شعاع الإثارة. لذلك ، من الضروري التحقق من موضع نصف الموجة الذي يتوافق مع إثارة العينة على طول المحورين X (الشكل 5A ، أعلى) و Y (الشكل 5A ، أسفل). تجدر الإشارة أيضا إلى كيفية تغير الرسوم البيانية القطبية أثناء إجراء تحليل استقطاب كامل من نقاط مختارة مختلفة. خارج الكروية ، يبدو الرسم البياني القطبي وكأنه مجموعة من القطع الأثرية وطفرات ضوضاء الإشارة العشوائية (الشكل 5B ، I). قد يشير هذا الرسم البياني أيضا إلى انجراف الكروية بين القياسات ويتطلب إيجاد إحداثيات جديدة للهيكل بأكمله عن طريق مسح نقطي آخر 2PF. يتم عرض الرسوم البيانية القطبية المقاسة بشكل صحيح من مواقع عالية الترتيب من الأنسولين الكروي على طول المحورين X و Y في الشكل 5B II و III ، على التوالي. يمكن أن يكون لها أشكال وأشكال هندسية مختلفة ، اعتمادا على الاتجاه المحلي وتنظيم الفلوروفورات المقاسة من البقعةالمحددة 7.

تركز الخطوة الأخيرة من البروتوكول على تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام خوارزمية تستند إلى نموذج رياضي يجمع بين اتجاه ألياف الأميلويد في المستوى XY Φ ، ولحظات ثنائي القطب العابرة الفلوروفور المرتبطة Ψ ، وانحرافاتها ΔΨ (الشكل 6) مع كثافة Equation 1 ومضان Equation 2 مستحث بفوتونين. يجب أن تنتج الوظائف المنفذة بشكل صحيح والمعروضة في البروتوكول ، بعد إدخال بيانات الإدخال المناسبة (الخطوة 4.9 من البروتوكول) ، رسوما بيانية قطبية متطابقة مع تلك المعروضة في الشكل 7. أي انحرافات - اتجاه بيانات مختلفة أو شدة أو أشكال Equation 26 محاكاة و Equation 32- تشير إلى أخطاء في التعليمات البرمجية. إذا كان النموذج يعمل ، يمكن للمرء أن ينتقل إلى الخطوة الأخيرة من البروتوكول - تركيب البيانات المحاكاة للبيانات الحقيقية التي تم الحصول عليها من قياس ps-2PFM. يجب أن تؤدي القيم المختارة ل Φ و ΔΨ مع أعلى معاملات الارتباط والتقارب بين الشدة المحاكاة والإشارة المقاسة إلى صور مماثلة كما هو موضح في الشكل 8. يجب أن يكون هناك أفضل ملاءمة Equation 26 ممكنة ووظائف Equation 32 للاتجاه العام وشكل Equation 1 و Equation 2 ويجب أن تتوافق قيم Φ و ΔΨ مع الاتجاه المحلي للألياف والفلوروفورات في البقعة المقاسة على الكروية. يمكن أيضا استخدام نماذج وطرق تركيب مماثلة لتحديد التنظيم المحلي للجزيئات الحيوية الأخرى مثل DNA11.

Figure 1
الشكل 1: إعداد الفحص المجهري الحساس للاستقطاب ثنائي الفوتون. مخطط يوضح إعداد المجهر ثنائي الفوتون المستخدم في قياسات التألق المثارة ثنائية الفوتون الحساسة للاستقطاب لكرويات الأنسولين البقري. يتم تصوير مكونات الانبعاث المثار ثنائي الفوتون المستقطب أفقيا ورأسيا (إلى مستوى عينة المجهر) مع IX و IY على التوالي. الاختصارات: SP = طائرة عينة ؛ O = الهدف ؛ DM = مرآة ثنائية اللون ؛ λ / 2 = لوحة نصف موجة ؛ LPF = مرشح تمرير طويل ؛ BE = موسع شعاع ؛ P = مستقطب جلان ؛ Ti: Sa = Titan: مصدر ضوء ليزر الياقوت ؛ م = مرآة ؛ SPF = مرشح تمرير قصير ؛ PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ L = عدسة بصرية ؛ APD = الصمام الثنائي الضوئي للانهيار الجليدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط يوضح إعداد الشريحة / الصورة. (أ) مخطط يوضح تحضير العينة المختومة ؛ (ب) صور فوتوغرافية للخطوات اللاحقة لختم العينة. I: حصة 100 ميكرولتر من محلول كروي على شريحة الفحص المجهري مع بئر ، II: إسقاط غطاء فوق المحلول ؛ III: ختم محكم يتكون من بوليمر مترسب (مركب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مراقبة جودة كرويات الأنسولين تحت المجهر الضوئي المستقطب. (A1 ، B1) وضع برايتفيلد وكذلك تحت (A2 ، B2) المستقطبات المتقاطعة. يمكن ملاحظة نمط الصليب المالطي المميز على الصور المقابلة التي تم التقاطها باستخدام المستقطبات المتقاطعة. (أ) مجاميع كروية ذات تشوهات هيكلية ، (ب) كروية معزولة عالية الجودة. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: اختبار محاذاة نظام ps-2PFM. (أ) صورة متحدة المركز غير مركزة لمضان الفلوريسئين كما يظهر بدون (A1) ومع مرآة ثنائية اللون (A2) ، (ب) كروي تالف ضوئيا مع ثقوب محترقة تنشأ بسبب تحليل الاستقطاب الممدود في نقاط مختارة على طول الاتجاهين x و y ، (C) مكونات انبعاث مثارة ثنائية الفوتون اعتمادا على زاوية استقطاب الضوء الساقط كما هو مسجل لعينة الخواص (محلول فلوريسين). وتدل على مكونات الانبعاث المقاسة بواسطة الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي التي تقيس محور استقطاب الانبعاث X و Y ، على التوالي. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر (A1 ، A2) ، 10 ميكرومتر (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: المسح النقطي النموذجي 2PFM والرسوم البيانية القطبية من كروي الأنسولين الخالي من التسمية. (أ) المسح النقطي لشدة 2PF لكرويات الأنسولين الخالية من الملصقات: استقطاب ضوء الإثارة: (A1) الاستقطاب الأفقي ، (A2) الاستقطاب الرأسي ، ويشار إلى الانبعاث بأسهم بيضاء ، ويظهر الجزء الداخلي نفس الكروي المصور تحت مجهر ضوئي مستقطب قياسي مع مستقطبات متقاطعة. (B) الرسوم البيانية القطبية المشتقة من ثلاث نقاط يشار إليها في المسح A1 (B1, I; ب 2 ، الثاني ؛ B3 ، III). يشير Ixو Iyإلى مكونات الانبعاث المقاسة بواسطة الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي التي تقيس محور استقطاب الانبعاث X و Y ، على التوالي. اختصار: 2PF = مضان ثنائي الفوتون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التوزيع المخروطي لثنائي انبعاث الصبغة (نصف زاوية ، Ψ) فيما يتعلق بالمحور الليفي الطويل. يوضح الخط المتقطع المحور الليفي الطويل. يتم وصف دوران الألياف في مستوى عينة المجهر XY بالزاوية. يتم وصف انحرافات Ψ بسبب الدورات الجزيئية في الشعيرات بواسطة ΔΨ. هذا الرقم مأخوذ من Obstarczyk et al6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: محاكاة شدة مضان مثار ثنائي الفوتون مستقطب. مضان محسوب ل (A) Φ = 1 ° ، Ψ = 1 ° ، ΔΨ = 1 ° ؛ (ب) φ = 1°, ψ = 30°, ΔΨ = 1°؛ (ج) φ = 1 درجة ، ψ = 30 درجة ، ΔΨ = 60 درجة. تتوافق الخطوط الحمراء والزرقاء والصفراء مع Equation 26، Equation 32و ، و Equation 26 + Equation 32، على التوالي. تصف الزاوية Φ دوران الألياف في مستوى عينة المجهر XY ، Ψ - التوزيع المخروطي لثنائي القطب الانبعاث ، وانحرافات ΔΨ- ل Ψ بسبب الدوران الجزيئي في الخيوط. كانت جميع المعلمات الأخرى متطابقة في جميع الحالات: K1 = 2.945 ، K2 = 0.069 ، K3 = 1.016 ، γ = 0.01 ، و δ = 0.98845. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الرسوم البيانية القطبية لمجموعات البيانات التجريبية. (أ ، ب) الرسوم البيانية القطبية النموذجية بعد تركيب مجموعتي بيانات تجريبيتين تم جمعهما أثناء قياسات ps-TPFM لكرويات الأنسولين البقري. يتم تقديم مكونات الانبعاث المثار المقاس Equation 1 وثنائي Equation 2 الفوتون لمحور استقطاب الانبعاث X و Y بنقاط حمراء وزرقاء ، على التوالي ؛ وفي الوقت نفسه ، تقدم الخطوط الصلبة مكونات انبعاث مضان مثار ثنائي الفوتون المقابلة لمحور Equation 26 استقطاب الانبعاث X و Y و Equation 32. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب أداة قيمة لدراسة الترتيب المحلي للألياف داخل الهياكل الفوقية الأميلويد ، والتي تتطلب تعديلات صغيرة فقط على الإعداد القياسي متعدد الفوتونات. نظرا لأنه يعمل على الظواهر البصرية غير الخطية ، يمكن تحقيق تقليل اختيار الصورة الزاوية والدقة المحورية المحسنة مقارنة بطرق الفحص المجهري الفلوري المثار بفوتون واحد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يؤدي إلى انخفاض تشتت الضوء ، وانخفاض السمية الضوئية ، واختراق أعمق للعينة عند مقارنته بتقنيات الفحص المجهري الفلوري للإثارة ذات الفوتونالواحد 19,20. كما أثبتنا بالفعل ، فهو مناسب تماما لقياسات المجاميع المعبأة بكثافة من البروتينات مثل الكروية ، والتي يمكن إجراؤها بطريقة خالية منالملصقات 21.

ومع ذلك ، لاستخدام الطريقة الموضحة هنا بشكل فعال ، ينبغي إيلاء الاهتمام للعديد من القضايا الرئيسية. بدءا من إعداد العينات وجودتها ، أي الحضانة ، تأكد دائما من أن الهياكل الفوقية الأميلويد قد نمت بشكل صحيح. في حالة الكرويات ، استخدمنا مجهرا بصريا مستقطبا مع مستقطبات متقاطعة لتوطين الكرويات الناضجة ، والتي تعطي نمطا مالطيا متقاطعا مميزا ، ولها نصف قطر ~ 5 ميكرومتر16. ومع ذلك ، فإن الكرويات غير متجانسة ، ويمكن ملاحظة الهياكل المميزة داخل العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان اختيار الأنواع المنفصلة وغير المشوهة. أما بالنسبة لنظام القياس نفسه ، فمن الأهمية بمكان التحكم في استقطاب الضوء الساقط بحيث يجب تحديد استقطاب الحزمة عند مدخل جسم المجهر بدقة وتقليل إزالة الاستقطاب التي أدخلتها العناصر البصرية المستخدمة22. لضمان أفضل أداء ، نوصي باستخدام مرايا فضية عالية الجودة ومرشحات بصرية مطابقة للأطوال الموجية للإثارة وانبعاث التألق. نظرا للدور الرئيسي لاستقطاب الضوء أيضا في مسار الانبعاث ، من الضروري قياس عينة مرجعية متباينة الخواص قبل القياس الفعلي. إذا تمت محاذاة مسار الإثارة وكاشفات APD بشكل صحيح ، فيجب أن يرى المرء إشارة مكثفة بنفس القدر على كلا الكاشفين كما هو موضح في الشكل 4C. يجب أن يولد المرجع مضانا قويا ثنائي الفوتون متحمسا عند طاقة ليزر منخفضة نسبيا لتجنب التبييض الضوئي ؛ استخدمنا الفلوريسئين نظرا لأن المقاطع العرضية لامتصاص الفوتونين لأطوال موجية مختلفة تم الإبلاغ عنها بالفعل في الأدبيات23.

لتحديد ترتيب الهياكل داخل الكرويات بشكل صحيح ، ينبغي أيضا تكريس الكثير من الاهتمام لتحليل البيانات. الافتراض الأساسي لهذا النموذج هو تزامن عزم ثنائي القطب الانتقالي لامتصاص الضوء وانبعاثه. في ظل هذا الافتراض ، فإن محاذاة عزم ثنائي القطب الانتقالي للجزيء بالتوازي مع استقطاب الضوء الساقط يسمح بدمجه مع البنية الداخلية للعينة المختبرة ، مما ينتج عنه أعلى كثافة انبعاث. يمكن أيضا استخدام النموذج المعطى كتقريب جيد للاختلافات الصغيرة في الزاوية بين عزمتي ثنائي القطب8 ولكنه يتطلب مزيدا من التعديلات للانحرافات الكبيرة. لذلك ، كما هو موضح ، يجب أن تؤخذ بعض الافتراضات المتعلقة بالعينة في الاعتبار مسبقا للتصوير وتحليل البيانات. في حالة النموذج التي تستند إليها المحاكاة والمعادلات المستخدمة في هذه الطريقة ، فإن المصدر الرئيسي لإزالة الاستقطاب في النظام هو المرآة ثنائية اللون. لذلك ، قبل الشروع في تحليل البيانات ، من الضروري تحديد المعلمات المسؤولة عن إزالة الاستقطاب التي أدخلتها المرآة ثنائية اللون بسبب تأثيرها على شكل الرسوم البيانية القطبية التي تم جمعها وبالتالي التحديد الصحيح لتنظيم الجزيئات داخل الهيكل المفحوص أثناء التركيب18. تصبح هذه مشكلة رئيسية ، خاصة في حالة قياسات العديد من الأطوال الموجية ، لأن التغيير في إهليلجية المرآة ثنائية اللون يعتمد بشكل مميز على الطول الموجي12. يمكن أن يؤثر تحريض إزالة الاستقطاب بشدة على خصائص الإشارة المجمعة11. أخيرا وليس آخرا ، عند إنشاء البرنامج النصي لتحليل البيانات ، يجب الانتباه أثناء تقديم الوظائف والمتغيرات الرياضية المقدمة في الجزء الأخير من البروتوكول. لتجنب الأخطاء ، ركز على ميزات مثل استدعاء الوظائف المتعددة والمعلمات العامة ، والتي ستسرع أيضا وقت التحليل بشكل كبير.

يجب أن نذكر أيضا المشاكل الأكثر شيوعا التي قد يواجهها المرء عند استخدام الطريقة الموصوفة. يعتمد وقت تحضير العينة إلى حد كبير على سرعة تصلب التركيب. لتسريع ذلك ، نوصي بإعداد العينات في مكان دافئ وجاف ويتم إغلاق محلول spherulite قبل تركيبه في المجهر. قد تؤدي القياسات التي يتم إجراؤها في وقت مبكر جدا إلى فتح الشريحة وتدمير العدسة الموضوعية المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من التحضير المناسب للعينة ، قد تطفو كرويات صغيرة في المحلول أثناء القياس بسبب الإجهاد المادي الذي يسببه الهدف. لتجنب ذلك ، ننصح بمسح الهياكل المعزولة متوسطة الحجم لأن أكبرها عادة ما تكون مجاميع. يوصى بالتحقق مما إذا كان الكروي الممسوح ضوئيا قد تحرك بعد الحصول على البيانات ، مقارنة بالصورة قبل بدء القياس. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من المحاذاة الصحيحة لجميع العناصر البصرية وأجهزة الكشف المستخدمة لقياس ps-2PFM ، فإن الشدة Equation 1 المقاسة والمرجع Equation 2 الخواص قد لا تزال تختلف قليلا في الشدة. في مثل هذه الحالة ، من الضروري أخذ ذلك في الاعتبار عند تحليل البيانات من قياسات العينة بضرب أحد الشدة في عامل التصحيح المحدد أثناء القياسات المرجعية. أخيرا وليس آخرا ، من الممكن أنه أثناء إجراء التركيب ، لن يتمكن البرنامج النصي من العثور على أي قيم مطابقة ل Φ و ΔΨ. قد يكون هذا بسبب عدة عوامل - تم جمع البيانات من بقعة غير منظمة على عينة ، على سبيل المثال ، جوهر كروي. لم يتم تشكيل الهيكل المدروس بالكامل أثناء الحضانة ؛ محاكاة غير صحيحة ل Equation 26 و Equation 32؛ باستخدام معلمات مرآة ثنائية اللون غير صحيحة γ و δ ؛ مجموعة خطوات كبيرة جدا لزوايا Φ و ΔΨ بين كل تكرار أثناء التركيب. في حالة وجود بقعة غير منظمة ، نوصي بمحاولة جمع البيانات من النقاط القريبة من محيط الهيكل الذي تم فحصه. في حالة وجود بنية غير مكتملة ، كرر الحضانة أو ابحث في الشريحة عن هياكل أخرى. في حالة المحاكاة غير الصحيحة ، تحقق يدويا مما إذا كان عن طريق تغيير المعلمات Φ و Ψ و ΔΨ ، والشدة Equation 26 المحاكاة وتغيير Equation 32 وتصحيح أي أخطاء في الكود. في حالة معلمات المرآة ثنائية اللون غير الصحيحة ، تحقق بعناية من المعلمات γ و δ للمرآة ثنائية اللون المستخدمة أثناء القياسات. في حالة تعيين خطوة كبيرة للزوايا أثناء التركيب ، قم بتقليل الخطوة بين التكرارات المتتالية إلى 2 درجة أو 1 درجة. يجب أن نتذكر أيضا أنه في حالة عدم التنظيم المحلي القوي للهيكل ، سيكون R2 دائما أقل ، غالبا في حدود 0.5-0.6. وذلك لأن النموذج المقدم يصف جزيئات مرتبة للغاية حيث يتم محاذاة معظم لحظات ثنائي القطب العابرة في اتجاه مماثل. وبالتالي ، فإن مطابقة الهياكل غير المتبلورة أو شديدة الاضطراب تؤدي إلى انخفاض معاملات الارتباط. لذلك ، من الأهمية بمكان امتلاك بعض المعلومات الهيكلية على الأقل عن العينة قبل القياس لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها بشكل صحيح.

تجدر الإشارة أيضا إلى أن الطريقة المقدمة تمتلك العديد من القيود. يمكن أن يؤدي تحليل البيانات إلى عدة قيم لزوايا Φ و ΔΨ مع عوامل ارتباط عالية بما يكفي ، مما يتطلب من المجرب استخدام معرفته وخبرته لتحديد القيم المناسبة. في هذه الحالة ، يجب أن تؤخذ شروط الحدود في الاعتبار ، مثل أن مخروط الفلوروفور نصف الزاوية Ψ يجب أن يكون دائما أكبر من انحرافه ΔΨ. بالإضافة إلى ذلك ، عند مقارنة بياناتنا مع الأدبيات ، تجدر الإشارة إلى أن بعض الأوراق تصف Ψ كزاوية مخروطية كاملة ، بينما نعمل بزاوية نصف مخروطية. هناك قيد آخر هو دقة القياس ، التي تقتصر على دقة دون ميكرون. وبسبب ذلك ، فإن انتقائية الصورة للنظام وتحديد التنظيم المحلي الناتج تستند إلى متوسط الإشارة من الألياف المثارة في النقطة البؤرية بدلا من الهياكل الفردية. علاوة على ذلك ، تحتاج العينة نفسها إلى امتلاك عائد كمي مضان كاف ، حيث أن التعرض الطويل تحت طاقة الليزر الساقطة fs (ضروري للحصول على بيانات للرسوم البيانية القطبية) قد يكون مدمرا ويؤثر على النتائج.

على الرغم من هذه الصعوبات ، نعتقد أن الطريقة المقدمة في هذه الورقة لها مجموعة واسعة من التطبيقات ، للتصوير القائم على الملصقات والخالية من الملصقات للهياكل الحيوية في البيئات المائية والمعقدة. لقد أظهرنا سابقا أن ترتيب الألياف المحلية المحسوب من بيانات ps-2PEF يرتبط بالمعلومات المستمدة من المجهر الإلكترونيالنافذ 7. لذلك ، أكدنا صحة ps-2PEF في التصوير الحيوي ووسعنا المعرفة حول الترتيب الهيكلي للهياكل الفوقية الأميلويد. يمكن تطبيق هذه الطريقة للتعرف على أصل التألق الجوهري الذي لوحظ في حالة المكونات المختلفة للعينات البيولوجية ، مثل التألق الذاتي لمجاميع البروتين - الأميلويدات. بالنظر إلى البيانات ذات الصلة حول اتجاه اتجاهات عزم الامتصاص / الانبعاث ثنائي القطب فيما يتعلق بالمحور الطويل للألياف الأميلويد ، يمكن ربط الخصائص البصرية للألياف بهيكلها6. أشرنا إلى أنه بالنسبة للهياكل ذات الزاوية Ψ المحددة بالفعل ، تسمح هذه التقنية بالكشف عن السمات الهيكلية المميزة للهياكل الفوقية الأميلويد والأشكال المتعددة للهياكل الفوقية للأنسولين بناء على مستوى تنظيمها7. كما لوحظ سابقا في البروتوكول ، يمكن أيضا تطبيق الإعداد المقدم على قياسات الجيل التوافقي الثاني الحساسة للاستقطاب ، وهي أيضا تقنية مجهرية ثنائية الفوتون خالية منالملصقات 24. ولن يتطلب ذلك تركيب مرشحات بصرية مختلفة فحسب، بل سيتطلب أيضا تغيير الصيغ المستخدمة في تحليل البيانات25. علاوة على ذلك ، مع إضافة صفيحة موجية ربع محاذاة بشكل صحيح ، يمكن استخدامها لإثارة العينة بضوء مستقطب دائريا ، مما قد يؤدي إلى توليد خصائص بصرية غير خطية للأميلويدات لأنها بوليمرات حيوية شيرالية ذات خصائص شيروبصرية قوية مؤكدة26. ومع ذلك ، في مثل هذه الحالة ، سيؤدي المتجه الكهربائي الدوار باستمرار إلى الاتجاه المتغير باستمرار للانبعاث المثار ، مما يجعل من المستحيل تحديد أي معلومات هيكلية باستخدام المعادلات المعروضة في هذه المخطوطة. الكل في الكل ، ps-2PEF هو أداة واعدة لتحديد المنظمة داخل العديد من الهياكل الحيوية المعقدة مع ثنائيات أقطاب الانبعاثات المرتبة ، مثل مجاميع البروتين أو الحمض النووي أو الأنسجة بطريقة غير جراحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع Sonata Bis 9 (2019/34 / E / ST5 / 00276) بتمويل من المركز الوطني للعلوم في بولندا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Tags

حساس للاستقطاب ، مجهر ثنائي الفوتون ، خال من الملصقات ، توصيف هيكلي للأميلويد ، تجارب التصوير الحيوي ، السمية الضوئية ، اختراق الأنسجة ، الأنظمة المعبأة بكثافة ، الانتخاب الضوئي الزاوي ، الفلوروفورات ، تحليل الاستقطاب ، المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) ، التنظيم الجزيئي ، طرق التصوير القياسية ، العمليات البصرية الخطية ، 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) ، الترتيب الجزيئي ، الهياكل الحيوية المعقدة ، كرويات الأميلويد ، الأمراض التنكسية العصبية ، مرض الزهايمر ، باركنسون ، مجاميع بروتين الأميلويد ، ضعف عملية اختلال البروتين ، طرق التشخيص ، ترتيب الألياف المحلية ، كرويات الأنسولين البقري
مجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب لتوصيف هيكلي أميلويد خال من الملصقات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lipok, M., Obstarczyk, P.,… More

Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter