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Chemistry

Microscopie à deux photons sensible à la polarisation pour une caractérisation de la structure amyloïde sans marquage

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Cet article décrit comment la microscopie à deux photons sensible à la polarisation pourrait être appliquée pour caractériser l’organisation locale au sein de superstructures-sphérolites amyloïdes sans marquage. Il décrit également comment préparer et mesurer l’échantillon, assembler la configuration requise et analyser les données pour obtenir des informations sur l’organisation locale des fibrilles amyloïdes.

Abstract

Par rapport à son homologue à un photon, l’excitation à deux photons est bénéfique pour les expériences de bio-imagerie en raison de sa phototoxicité plus faible, de sa pénétration tissulaire plus profonde, de son fonctionnement efficace dans les systèmes densément emballés et de la photosélection angulaire réduite des fluorophores. Ainsi, l’introduction de l’analyse de polarisation en microscopie à fluorescence à deux photons (2PFM) permet une détermination plus précise de l’organisation moléculaire d’un échantillon par rapport aux méthodes d’imagerie standard basées sur des processus optiques linéaires. Dans ce travail, nous nous concentrons sur la 2PFM sensible à la polarisation (ps-2PFM) et son application dans la détermination de l’ordre moléculaire au sein de bio-structures complexes-sphérolites amyloïdes. Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson sont souvent diagnostiquées par la détection d’agrégats amyloïdes-protéines formés en raison d’un processus de mauvais repliement des protéines. L’exploration de leur structure permet de mieux comprendre leur parcours de création et, par conséquent, de développer des méthodes de diagnostic plus sensibles. Cet article présente le ps-2PFM adapté à la détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine et des agrégats de protéines amyloïdogènes sphériques. De plus, nous démontrons que la technique proposée permet de résoudre l’organisation tridimensionnelle des fibrilles à l’intérieur de la spherulite.

Introduction

Au cours des dernières décennies, bien qu’il y ait eu un développement significatif de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence pour la bio-imagerie des protéines et de leurs agrégats1, seules quelques-unes ont été utilisées pour résoudre leur ordre local au sein de l’échantillon 2,3. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence4 a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité structurale intrinsèque des superstructures-sphérolites amyloïdes. De plus, la détermination quantitative de l’ordre local à l’intérieur de biostructures complexes et densément emballées telles que les sphérulites pourrait être résolue à l’aide de méthodes sensibles à la polarisation3. Cependant, les techniques de fluorescence standard avec pénétration superficielle des tissus sont limitées car l’utilisation de longueurs d’onde UV-VIS pour exciter les fluorophores in vivo conduit à une diffusion élevée de la lumière tissulaire5. De plus, une telle imagerie nécessite souvent de concevoir et de lier des sondes fluorescentes spécifiques à une biomolécule ciblée, ce qui augmente le coût et la quantité de travail nécessaire pour effectuer l’imagerie.

Récemment, pour résoudre ces problèmes, notre équipe a adapté la microscopie à fluorescence excitée à deux photons sensible à la polarisation (ps-2PFM) pour l’imagerie sans marquage des structures biologiques 6,7. Ps-2PFM permet de mesurer la dépendance de l’intensité de la fluorescence à deux photons sur la direction de polarisation linéaire du faisceau d’excitation et d’analyser la polarisation de la fluorescence émise8. La mise en œuvre de cette technique nécessite de compléter le chemin d’excitation standard du microscope multiphotonique (Figure 1) par une plaque demi-onde pour contrôler le plan de polarisation de la lumière. Ensuite, des graphiques polaires, illustrant la dépendance de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons sur la polarisation du faisceau laser d’excitation, sont créés à partir de signaux collectés par deux photodiodes à avalanche, rassemblant ainsi les deux composantes mutuellement perpendiculaires de la polarisation de fluorescence.

La dernière étape est le processus d’analyse des données, en tenant compte de l’impact des éléments optiques, tels que les miroirs dichroïques ou un objectif à grande ouverture numérique, sur la polarisation. En raison de la nature du processus à deux photons, cette méthode permet à la fois une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée, car l’excitation à deux photons des fluorophores en dehors du plan focal est limitée de manière probabiliste. Il a également été prouvé que des méthodes similaires pouvaient être mises en œuvre avec succès pour l’imagerie in vivo de sondes dans le proche infrarouge (NIR) pour l’imagerie des tissus profonds9. Le Ps-2PFM a déjà été appliqué à l’imagerie des fluorophores dans les membranes cellulaires10 et l’ADN11,12, ainsi qu’à des marqueurs fluorescents non standard de systèmes biologiques, tels que les nanoparticules d’or13. Cependant, dans tous ces exemples, l’information sur l’organisation des biomolécules a été obtenue indirectement et a nécessité une orientation mutuelle prédéfinie entre un fluorophore et une biomolécule.

Dans l’un de nos articles récents, nous avons montré que le ps-2PFM pouvait être appliqué avec succès pour déterminer la polarisation locale de l’autofluorescence des superstructures amyloïdes et de la fluorescence de la thioflavine T, un colorant spécifique de l’amyloïde, lié aux fibrilles amyloïdes dans les sphérulites6. De plus, dans un autre cas, nous avons prouvé que le ps-2PFM pouvait être utilisé pour détecter l’orientation des fibrilles amyloïdes à l’intérieur des sphérulites amyloïdes dans un régime de taille submicronique, ce qui a été confirmé en le corrélant avec l’imagerie par microscopie électronique à transmission (MET)7. L’obtention de ce résultat a été possible grâce à i) l’autofluorescence intrinsèque des sphéroulites-amyloïdes, lorsqu’elles sont excitées avec un ou deux photons, présente une autofluorescence intrinsèque avec des maxima d’émission situés dans une gamme de 450 à 500 nm et des sections efficaces d’absorption à deux photons comparables à celles des colorants fluorescents standard14, ii) des modèles mathématiques introduits précédemment pour décrire comment le ps-2PEF des colorants marquant les membranes biologiques et les structures de l’ADN pourrait être appliqué à fluorescence manifestée par les sphérulites et les colorants qui leur sont liés 8,11,15. Ainsi, avant de procéder à l’analyse, nous vous recommandons vivement de consulter la théorie requise décrite à la fois dans le texte principal et les informations à l’appui de notre premier article sur ce sujet6. Nous présentons ici le protocole d’application de la technique ps-2PFM pour une caractérisation structurale amyloïde sans marquage des sphérulites d’insuline bovine.

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Protocol

1. Préparation des lames de microscope avec des sphérulites adultes

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole. Toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau déminéralisée (18,2 MΩ·cm à 25 °C) obtenue à partir du système de purification de l’eau.

  1. Incuber les sphérulites amyloïdes selon le protocole décrit par Krebs et al16. avec quelques modifications, comme décrit ci-dessous.
    1. Peser 10 mg d’insuline en poudre dans un tube de 1,5 ml.
    2. Dissoudre la poudre avec une aliquote de 1 mL de la solution déminéraliséeH2O/HCl (pH 1,5).
    3. Scellez l’échantillon avec le ruban adhésif et mettez-le dans un mélangeur thermique pour incuber pendant 24 h à 70 °C (0 tr/min).
      REMARQUE : Pour effectuer l’imagerie des amyloïdes dans leur environnement d’origine (c’est-à-dire hydraté) et prévenir la déformation de l’échantillon due à la déshydratation, il est nécessaire de préparer des lames de microscope selon la description suivante (schéma illustré à la figure 2).
  2. Lavez soigneusement la lame en verre du microscope avec de l’eau.
  3. Trempez les lames dans du méthanol et laissez-les sécher dans des conditions ambiantes sur une lingette sans poussière.
  4. Prélever une aliquote de 100 μL de la solution de sphérulite dans le tube à l’aide d’une pipette automatique (étape 1.1.2) et l’ajouter au puits situé dans la zone centrale de la lame de microscope.
  5. Recouvrez la solution d’une lamelle, en évitant la formation de bulles d’air.
  6. Déposer le support le long des bords de la lamelle sur la lame à l’aide d’une pipette automatique pour sceller la solution native des sphérulites.
    REMARQUE : Il est très important de déposer le support de glissière à la fois sur la lamelle et sur les surfaces de glissière. Faites-le sous le capot fumant en raison de la toxicité du solvant volatil (xylène). Voir l’encadré de la figure 2.
  7. Laissez l’échantillon du microscope dans des conditions ambiantes pour que le produit de montage durcisse.
    REMARQUE : Le processus de durcissement dépend de la température et de l’humidité, mais doit être terminé dans les 12 heures.
  8. Vérifiez si les sphérulites d’insuline ont été formées correctement à l’aide d’un microscope optique polarisé (POM) avec des polariseurs croisés. Parcourez l’échantillon à la recherche d’un motif caractéristique de zones lumineuses, appelé croix de Malte, comme le montre la figure 3.
    NOTE : Les sphérulites amyloïdes peuvent être définies comme des superstructures sphériques caractérisées par une morphologie hétérogène avec une structure noyau-coquille. Dans le détail, ils sont composés d’un noyau amorphe et de fibrilles amyloïdes à croissance radiale16. En raison du caractère anisotrope des structures de sphérulite, elles peuvent interagir de manière distincte avec la lumière polarisée (par exemple, par réfraction) et modifier leur phase, ce qui peut être facilement observé sous POM avec des polariseurs croisés. Cette méthode n’a été utilisée que pour étudier les sphérulites complètement développées caractérisées par un motif de croix de Malte de type modèle. Par conséquent, les agrégats ou les sphérulites structurellement déformés ont été exclus des recherches ultérieures.

2. Construire et aligner le système

REMARQUE : Une représentation schématique d’un microscope à deux photons sensible à la polarisation se trouve à la figure 1.

  1. Installez un laser femtoseconde avec une accordabilité de la longueur d’onde de sortie dans la plage de 690 à 1 080 nm, par exemple, fonctionnant sur un laser Ti :Sapphire à verrouillage de mode avec des impulsions ~100 fs et un taux de répétition de 80 MHz.
  2. Ajoutez une plaque demi-onde montée sur une platine de rotation sur le chemin d’excitation de l’installation pour contrôler la polarisation de la lumière incidente dans le plan d’échantillonnage du microscope XY.
  3. Installez le miroir dichroïque pour couper le faisceau d’excitation de l’optique de détection.
    NOTE : Les caractéristiques optiques d’un miroir dichroïque doivent permettre de réfléchir le faisceau d’excitation (vers l’échantillon) dans la gamme de longueurs d’onde NIR et d’être simultanément transparentes pour la gamme de longueurs d’onde correspondant à l’émission des échantillons.
  4. Installez une platine de balayage piézoélectrique pour les balayages raster dans le plan XY pour un Z choisi.
  5. Montez l’objectif d’immersion à NA élevé, par exemple, un objectif d’immersion d’huile apochromatique 100x/1,4 NA.
    REMARQUE : Comme l’ensemble de l’installation fonctionne en mode épi-fluorescence, les signaux incidents et émis passent par le même objectif.
  6. Dans le chemin d’émission, ajoutez un séparateur de faisceau polarisant qui divise l’émission excitée à deux photons en deux composantes polarisées orthogonalement (IX et IY)
  7. Installez deux photodiodes à avalanche (APD) comptant les photons dans une configuration leur permettant de collecter la lumière transférée et réfléchie à l’aide du séparateur de faisceau, respectivement (Figure 1).
  8. Montez des filtres de coupure dépendants de la longueur d’onde sur le chemin d’excitation et d’émission du système, par exemple, un filtre passe-long de 800 nm directement dans le chemin optique d’excitation et un filtre passe-court de 700 dans le chemin d’émission.
    REMARQUE : Analysez les spectres d’émission de la sphérulite afin que toute contribution potentielle de la génération de deuxième harmonique (SHG) ou de la lumière laser puisse être exclue à l’aide des filtres d’émission appropriés. Il convient également de noter que ce système devrait également permettre des mesures de SHG sensibles à la polarisation, ce qui pourrait être utilisé pour résoudre l’ordre des biomolécules dans les échantillons. Cependant, l’analyse des données du signal SHG diffère de la fluorescence, qui, plus en détail, a été décrite par Aït-Belkacem et al.17.
  9. Alignez l’ensemble du système (en utilisant le mode d’alignement intégré à de nombreux lasers) jusqu’à ce que des intensités de signal similaires soient collectées à l’aide des deux photodiodes.
  10. Vérifiez si le faisceau d’excitation focalisé par l’objectif à NA élevé et imagé sur une caméra a une forme circulaire concentrique comme présenté à la figure 4A.
  11. Ajustez le temps de balayage et la puissance correspondante pour minimiser les dommages induits par le laser incident sur l’échantillon. Un exemple de brûlage ponctuel est présenté à la figure 4B. Mesurez la puissance nominale à l’aide d’un wattmètre numérique portatif connecté à un capteur de puissance à photodiode situé à l’entrée du corps du microscope.
    REMARQUE : Les échantillons biologiques peuvent être facilement brûlés en raison de l’éclairage laser. Dans ce cas, la plage de puissance de 100 à 900 μW (au point focal de la lentille de l’objectif) s’est avérée être un excellent compromis entre la stabilité de l’échantillon et l’émission intense.
  12. Avant la mesure de l’échantillon, testez la qualité de l’alignement de l’optique avec un échantillon de référence isotrope (par exemple, la fluorescéine incorporée dans le polymère amorphe). Pour effectuer le contrôle d’étalonnage, suivez la procédure décrite à la section 3 en utilisant une référence isotrope au lieu d’un échantillon amyloïde.
    NOTA : En supposant que la configuration de la microscopie est idéalement ajustée pour l’échantillon ayant des propriétés isotropes, les deux composantes d’émission de 2P (IX et IY) détectées avec deux APD doivent être caractérisées par la même intensité (Figure 4C).

3. Mesure des sphérulites d’insuline bovine

REMARQUE : Pour effectuer toutes les mesures ps-2PF décrites, un logiciel écrit à la main a été utilisé, qui contrôle les positions de l’étage piézoélectrique et de la demi-lame d’onde et recueille le signal des deux photodiodes, permettant de tracer les balayages XY (balayages matriciels) à partir de zones sélectionnées sur des lames de microscope ainsi que des graphiques polaires à partir de coordonnées d’échantillons spécifiques. Des notes supplémentaires ont également été ajoutées au protocole, ce qui permettra aux utilisateurs d’effectuer la mesure sans lui, car l’étage piézoélectrique et l’étage de rotation utilisés pour faire tourner la plaque demi-onde pourraient être contrôlés à l’aide de leurs propres contrôleurs ou du logiciel correspondant. Néanmoins, il est fortement recommandé d’écrire un algorithme combinant l’angle de rotation d’une plaque demi-onde avec l’intensité 2PEF collectée avec les deux photodiodes, car cette corrélation (graphes polaires) est cruciale pour une analyse correcte des données résultant en informations structurelles.

  1. Montez l’éprouvette avec les sphérulites sur la platine piézoélectrique (immobiliser la lame de verre avec du ruban adhésif). Assurez-vous de le monter de manière à ce qu’un côté en verre mince (lamelle) fasse face à l’objectif, car les objectifs numériques élevés sont caractérisés par des distances de travail relativement courtes.
    REMARQUE : Comme l’immersion dans l’huile est utilisée, une petite goutte d’huile minérale doit être appliquée sur l’objectif avant le montage et la mise au point de l’échantillon.
  2. En changeant les positions XY et Z à l’aide des boutons du microscope, concentrez l’objectif sur l’une des sphérulites trouvées dans la solution, mais sachez que, comme les diamètres des sphérulites sont généralement de l’ordre de quelques dizaines de μm, concentrez-vous sur la zone centrale de l’ensemble de la structure. Recherchez des halos noirs et blancs autour de la sphérulite spécifique comme signes de sous-mise au point et de mise au point supérieure, respectivement. Ajustez l’axe « Z » pour qu’il se situe entre ces extrêmes.
    REMARQUE : Il est important de trouver un échantillon isolé sans défauts structurels. Des sphérulites extrêmement petites peuvent dériver en raison de la contrainte matérielle introduite par l’objectif, tandis que les plus grandes structures sont probablement agrégées ou fortement déformées.
  3. Centrez la sphérulite dans le champ de vision du plan microscopique observé et déterminez la taille du balayage XY en regardant combien d’étapes piézo-étaiées dans les directions X et Y (affichées sur le contrôleur piézo-platine ou dans son logiciel) sont nécessaires pour couvrir la zone de l’ensemble de la structure.
    REMARQUE : Il est recommandé de régler le système de manière à ce que le début du balayage XY soit situé près de l’un des coins de la sphérulite et coïncide avec la position zéro de la platine (X et Y = 0)
  4. Ajustez les paramètres d’analyse suivants :
    1. Ajustez la polarisation du faisceau d’excitation et faites tourner la plaque demi-onde pour obtenir la polarisation correspondant aux axes « X » et « Y » du plan d’échantillonnage du microscope.
      REMARQUE : Cela peut être fait en mesurant les graphiques polaires d’un milieu fluorescent isotrope tel que la fluorescéine. Pour de tels matériaux, l’intensité maximale de fluorescence est parallèle à la polarisation du faisceau d’excitation ; ainsi, la rotation de la plaque demi-onde ajuste la polarisation avec les axes X et Y sur le plan d’observation, également désigné par les axes X et Y sur les graphiques polaires comme dans la figure 4C. Des graphiques polaires complets peuvent être mesurés en collectant l’intensité 2PEF mesurée sur les deux photodiodes pour une rotation de 180° de la plaque demi-onde (rotation de 360° de la polarisation de la lumière d’excitation) et en corrélant l’intensité avec l’angle de polarisation de la lumière d’excitation. Cela pourrait être fait manuellement, en mesurant l’intensité d’émission pour chaque angle de plaque demi-onde séparément, puis en l’assemblant dans un graphique polaire dans un logiciel d’analyse de données ou automatiquement, à l’aide d’un logiciel dédié ou auto-écrit.
    2. Ajustez les paramètres de la scène piézoélectrique : vitesse de balayage, pas et portée pour couvrir la zone de l’ensemble de la sphérulite.
      REMARQUE : La plage de balayage doit être supérieure au diamètre de la sphérulite pour cadrer entièrement l’ensemble de la superstructure dans le balayage raster. La faible vitesse et le faible pas de numérisation permettent aux utilisateurs d’obtenir des images de haute qualité ; Cependant, cela peut entraîner une brûlure de l’échantillon. Par conséquent, un compromis dépendant de la taille de la sphérulite est nécessaire. Ces paramètres ne peuvent pas être appliqués universellement. Exemples de paramètres utilisés dans la figure 5A : plage de balayage 45 x 45 μm, pas de balayage 1 μm et vitesse de balayage 2 μm/s.
  5. Ouvrez l’obturateur, allumez les photodiodes et collectez Equation 1 les composants d’émission Equation 2 2P pour chaque étape de la zone de balayage sélectionnée - pour le faisceau d’excitation polarisé en fonction des axes X, puis Y. Des exemples de balayages matriciels d’autofluorescence excitée par deux photons (2PAF) de sphérulites d’insuline sont présentés à la figure 5A.
    REMARQUE : La mesure des balayages matriciels nécessite de corréler les coordonnées de l’étage piézoélectrique avec Equation 1 Equation 2 les composants d’émission collectés, ce qui peut être fait manuellement, en mesurant l’intensité en chaque point de la zone sélectionnée, puis en l’assemblant dans une matrice 2D, ou automatiquement, via un logiciel auto-écrit. Les balayages matriciels peuvent être présentés comme une somme de l’intensité des composantes d’émission Equation 1 Equation 2 ou distinctement pour une composante d’émission spécifique. Comme elles sont très dépendantes de la structure, les distorsions structurelles dans les sphérulites sont facilement visibles. Cependant, en raison du mouvement de la platine du microscope, certains échantillons peuvent s’éloigner du champ de vision. Par conséquent, les images doivent être examinées à la recherche d’artefacts. Il est nécessaire de vérifier la position de la sphérulite avant et après l’examen.
  6. Pour effectuer une analyse complète de la polarisation à partir d’un point spécifique de l’échantillon, désactivez le faisceau d’excitation.
  7. Par la suite, choisissez des coordonnées spécifiques du piézostade correspondant à l’emplacement choisi sur la sphérulite où l’information sur l’orientation des molécules est requise avec une résolution inférieure au μm.
  8. Ajustez la platine piézoélectrique pour centrer le champ de vision à l’endroit indiqué (X, Y).
  9. Allumez le faisceau d’excitation et effectuez une analyse complète (360°) de la polarisation et Equation 2 de l’émission Equation 1 en activant la rotation de la plaque demi-onde (rotation de 180°). Présenter les composantes 2PF Ix et Iy sous la forme d’un graphique polaire (comme le montre la figure 5B).
    REMARQUE : Cette étape peut être répétée à différents endroits de l’échantillon pour recueillir une quantité suffisante de données.

4. Détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine

NOTE : Tous les calculs numériques liés à l’analyse des données ont été effectués à l’aide du langage de programmation Python et basés sur les fonctions disponibles dans les bibliothèques NumPy et SciPy. Le traçage des données nécessite la bibliothèque Matplotlib. Tous les calculs sont basés sur des formules présentées dans des informations à l’appui dans l’un des articles d’Obstarczyk et al.6.

  1. Simulation de l’intensité de la fluorescence à deux photons excitée pour la distribution spécifiée de molécules avec une direction sélectionnée de la polarisation de la lumière incidente (notée par α)
    NOTE : Les formules présentées sont basées sur l’hypothèse de moments dipolaires d’absorption et d’émission parallèles d’un fluorophore. Pour une discussion d’autres cas (par exemple, différentes directions des moments dipolaires d’absorption et d’émission, transfert d’énergie entre les fluorophores), voir l’article de Le Floc’h et al8.
    1. Retrouvez les paramètres rendant compte de la variation du champ électrique par les effets de mélange de polarisation et de dépolarisation provoqués par le miroir dichroïque monté dans une installation :
      1. γ représente le facteur d’amplitude entre la réflectivité et Equation 3 Equation 4 la lumière polarisée d’un miroir dichroïque.
      2. δ représente le déphasage (ellipticité) entre Equation 3 la lumière polarisée et Equation 4 la lumière polarisée.
        NOTE : La définition correcte de ces deux paramètres est cruciale pour une caractérisation structurale réussie en raison de leur forte influence sur la forme des graphes polaires mesurés11,18. Dans le cas du système présenté, les deux paramètres ont été déterminés lors de mesures ellipsométriques d’un miroir dichroïque appliqué dans un système.
    2. Calculer les vecteurs de champ électrique incident se propageant dans les axes X et Y de chaque angle mesuré lors de la mesure ps-TPFM à l’aide des équations (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      REMARQUE Si l’intensité est mesurée sur l’ensemble des 360° avec l’étape 1°, calculez les vecteurs de champ électrique pour tous les 360°. Tous les angles doivent être exprimés en radians. ρ est connecté à la fréquence optique ω du champ électrique simulé (ρ=ω·t) et utilisé intégré de 0 à 2π lors des calculs des vecteurs de champ électrique incident se propageant dans les axes X et Y pour chaque angle α mesuré lors de la mesure ps-TPFM.
    3. Définir les fonctions des moments dipolaires de transition dans les directions des trois axes d’un système cartésien selon les équations (6-8) :
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      REMARQUE : φ est l’angle d’orientation de l’axe long de la fibrille amyloïde dans la base de sondage XY. Les angles θ et φ sont les angles polaires et azimutaux utilisés pour définir l’orientation du moment dipolaire de transition d’un fluorophore.
    4. Utilisez les fonctions définies à l’étape 4.1.3. définir des fonctions pour Jx (Φ,θ,φ) et JY(Φ,θ,φ), qui rendent compte de la contribution de la focalisation serrée de la lumière avec un objectif à grande ouverture numérique à la détection de polarisation de fluorescence dans les directions X et Y à l’aide des équations (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      NOTE : Les facteurs K1, K2, K3 sont liés à l’objectif du microscope utilisé lors de la mesure ps-TPFM. Dans ces expériences, un objectif d’immersion dans l’huile apochromatique de 100x/1,4 NA a été utilisé et les facteurs K1, K2, K3 étaient respectivement de 2,945, 0,069 et 1,016.
    5. Définir une fonction pour f(Ω), qui est une distribution angulaire moléculaire, dépendant de la demi-ouverture d’un cône de fluorophore Ψ, avec une épaisseur variable ΔΨ ; Utilisez l’équation (11). La représentation graphique des trois angles concernant la fibrille amyloïde est présentée à la figure 6.
      Equation 15(11)
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous écrivez l’exposant - la puissance de 2 fonctionne sur l’argument de la fonction, pas sur la fonction entière !
    6. Définir tous les facteurs f WWIJKL comme indiqué dans les équations (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13 ans)
      Equation 18 (14 ans)
      Equation 19 (15 ans)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18 ans)
      Equation 23 (19 ans)
      Equation 24 (20 ans)
      Equation 25 (21 ans)
    7. Calculer les intensités de fluorescence excitées à deux photons Equation 26 et Equation 27 pour chaque angle mesuré (de la même manière qu’au point 4.1.2) à l’aide des équations (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Vérifiez si la simulation fonctionne correctement à l’aide des valeurs des variables suivantes (placées dans la légende de la figure 7) et comparez les résultats obtenus avec la figure 7A-C.
      NOTE : Tous les degrés doivent être écrits en radians.
  2. Ajuster les intensités simulées à l’intensité de l’autofluorescence excitée par deux photons des sphérulites d’insuline bovine recueillies lors des mesures ps-2PFM.
    NOTE : La résolution de la structure de la sphérulite basée sur les mesures ps-2PFM nécessite d’utiliser les équations écrites dans le protocole pour simuler l’intensité théorique de la fluorescence excitée à deux photons et d’ajuster tous les paramètres liés à l’ordre du fluorophore moléculaire. Elle nécessite de multiples itérations sur les différentes valeurs de Φ, un angle décrivant la rotation de la fibrille dans l’échantillon du microscope XY, et ΔΨ, des aberrations de la distribution conique du dipôle d’émission Ψ dues aux rotations moléculaires dans les filaments pour Ψ fixe jusqu’à atteindre le coefficient R2 le plus élevé possible entre l’intensité du signal de fluorescence excitée normalisée à deux photons collectée pendant la mesure et les intensités normalisées simulées selon l’étape 4.1 du protocole.
    1. Déterminez le demi-angle Ψ .
      NOTA : Pour les sphérulites d’insuline bovine, elle doit être égale à Ψ = 29°6.
    2. Flux de travail d’ajustement :
      1. Choisissez la valeur de Φ comprise entre 0° et 180° (dans les figures 8A et 8B Φ = 16° et 127°, respectivement).
      2. Choisissez la valeur de ΔΨ comprise entre 0° et 90° (dans la figure 8A,B, ΔΨ = 24° et 1°, respectivement).
      3. Calculer Equation 28 (équation 22) et Equation 30(équation 23) pour toute la gamme mesurée des angles θ en utilisant les valeurs choisies de Φ et ΔΨ.
      4. Comparez les intensités calculées lors des simulations (à la fois normalisées à la valeur maximale de
      5. Calculer Equation 28) avec des intensités normalisées de
      6. Calculer Equation 1 et Equation 2 (tous deux normalisés à la valeur maximale de Equation 1) mesurés pendant la mesure ps-2PFM.
        NOTE : Dans les expériences présentées, les coefficients de corrélation produit-moment de Pearson ont été calculés à l’aide de la fonction « corrcoef » de la bibliothèque Python NumPy.
    3. En fin de compte, choisissez les valeurs de Φ et ΔΨ conduisant aux coefficients de corrélation les plus élevés et à la convergence entre les intensités simulées et le signal mesuré similaire à ce qui est montré sur la figure 8.

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Representative Results

Le protocole présenté fournit des conseils étape par étape tout au long de la préparation des superstructures amyloïdes pour les tests avec ps-2PFM, la construction du système microscopique et les mesures de l’échantillon approprié. Cependant, avant la dernière série de mesures, il est essentiel d’aligner correctement les APD avec une référence isotrope, ce qui devrait permettre de collecter un signal symétrique de forme et d’intensité similaires sur les deux détecteurs (Figure 4C). Même les différences minimes entre les intensités mesurées sur les détecteurs sur les axes X et Y doivent être prises en compte lors de mesures ultérieures et en particulier lors de l’analyse en tant que facteur de correction approprié. Après montage, l’échantillon contenant des sphérulites simples, donnant une croix de Malte caractéristique sur le POM comme dans la figure 2B, et après avoir effectué un balayage raster 2PFM, l’image devrait ressembler à ce qui est montré dans la figure 5A, ce qui est cohérent avec les balayages raster 2PFM rapportés des sphérulites 6,7 et de différentes biomolécules organisées11,12. On peut observer quelques changements dans l’emplacement de l’axe avec la luminosité la plus élevée, ce qui est lié au fait que l’intensité du signal de fluorescence dépend fortement de la polarisation du faisceau d’excitation. Par conséquent, il est nécessaire de vérifier quelle position de la demi-lame d’onde correspond à l’excitation de l’échantillon le long des axes X (Figure 5A, en haut) et Y (Figure 5A, en bas). Il est également intéressant de noter comment les graphiques polaires changent lors de l’exécution d’une analyse complète de la polarisation à partir de différents points sélectionnés. À l’extérieur de la sphérulite, le diagramme polaire ressemble à une collection d’artefacts et de pics de bruit de signal aléatoires (Figure 5B, I). Un tel graphique peut également indiquer la dérive de la sphérulite entre les mesures et nécessiter de trouver de nouvelles coordonnées de l’ensemble de la structure par un autre balayage raster 2PF. Les graphiques polaires correctement mesurés à partir d’emplacements très ordonnés de sphérulite d’insuline le long des axes X et Y sont présentés à la figure 5B II et III, respectivement. Ils peuvent avoir des formes et des géométries différentes, en fonction de l’orientation locale et de l’organisation des fluorophores mesurés à partir du point sélectionné7.

La dernière étape du protocole est centrée sur l’analyse des données obtenues à l’aide d’un algorithme basé sur un modèle mathématique combinant l’orientation des fibres amyloïdes dans le plan XY Φ, les moments dipolaires transitoires fluorophores associés Ψ, et leurs aberrations ΔΨ (Figure 6) avec intensité Equation 1 et Equation 2 de fluorescence induite par deux photons. Les fonctions correctement mises en œuvre présentées dans le protocole devraient, après avoir saisi les données d’entrée appropriées (étape 4.9 du protocole), produire des diagrammes polaires identiques à ceux présentés à la figure 7. Tout écart - orientation des données, intensités ou formes différentes de simulées Equation 26 et Equation 32- indique des erreurs dans le code. Si le modèle fonctionne, on peut passer à la dernière étape du protocole, c’est-à-dire l’ajustement des données simulées aux données réelles obtenues à partir de la mesure ps-2PFM. Les valeurs choisies de Φ et ΔΨ avec les coefficients de corrélation et de convergence les plus élevés entre les intensités simulées et le signal mesuré devraient conduire à des images similaires à celles de la figure 8. Il doit y avoir le meilleur ajustement possible de Equation 26 et Equation 32 les fonctions à l’orientation et à la forme globales de Equation 1 et Equation 2 et les valeurs de Φ et ΔΨ doivent correspondre à l’orientation locale des fibrilles et des fluorophores dans le point mesuré sur la sphérulite. Des modèles et des méthodes d’ajustement similaires pourraient également être utilisés pour la détermination de l’organisation locale d’autres biomolécules comme l’ADN11.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la microscopie sensible à la polarisation à deux photons. Schéma montrant la configuration du microscope à deux photons utilisée pour les mesures de fluorescence excitée à deux photons sensibles à la polarisation des sphérulites d’insuline bovine. Les composantes d’émission excitée à deux photons polarisées horizontalement et verticalement (par rapport au plan d’échantillonnage du microscope) sont représentées par IX et IY, respectivement. Abréviations : SP = plan d’échantillonnage ; O = objectif ; DM = miroir dichroïque ; λ/2 = plaque demi-onde ; LPF = filtre passe-long ; BE = expanseur de faisceau ; P = polariseur du gland ; Ti : Sa = Titan : source de lumière laser saphir ; M = Miroir ; SPF = filtre passe-court ; PBS = séparateur de faisceau de polarisation ; L = lentille optique ; APD = photodiode à avalanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma montrant la préparation de la lame/photo. (A) Schéma montrant la préparation de l’échantillon scellé ; (B) des photographies des étapes subséquentes du scellement de l’échantillon. I : une aliquote de 100 μL de la solution de sphérulite sur la lame de microscopie avec un puits, II : lamelle déposée sur le dessus de la solution ; III : joint étanche formé à partir d’un polymère déposé (montage). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Contrôle de la qualité des sphérulites d’insuline au microscope à lumière polarisée. (A1,B1) Mode fond clair ainsi que sous polariseurs croisés (A2,B2). Le motif caractéristique de la croix de Malte peut être observé sur les images correspondantes prises avec des polariseurs croisés. (A) Agrégats de sphérulites présentant des distorsions structurales, (B) Sphérulite isolée de haute qualité. Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Test de l’alignement du système ps-2PFM. (A) Image concentrique défocalisée de la fluorescence de la fluorescéine vue sans (A1) et avec un miroir dichroïque (A2), (B) sphérulite photoendommagée avec des trous brûlés résultant de l’analyse de polarisation allongée en des points sélectionnés le long des directions x et y, (C) des composantes d’émission excitées à deux photons en fonction de l’angle de polarisation de la lumière incidente telle qu’elle est enregistrée pour un échantillon isotrope (solution de fluorescéine). et désignent les composantes d’émission mesurées par des photodiodes à avalanche mesurant respectivement les axes de polarisation d’émission X et Y. Barres d’échelle = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemples de balayages matriciels 2PFM et de graphiques polaires à partir de sphérulite d’insuline sans marquage. (A) Balayages matriciels d’intensité 2PF de sphérulites d’insuline sans marquage : polarisation de la lumière d’excitation : (A1) polarisation horizontale, (A2) polarisation verticale et émission sont indiquées par des flèches blanches, et l’encart montre la même sphérulite imagée sous un microscope à lumière polarisée standard avec des polariseurs croisés. (B) Diagrammes polaires dérivés de trois points indiqués sur le balayage A1 (B1, I ; B2, II ; B3, III). Ixet Iydésignent les composantes d’émission mesurées par des photodiodes à avalanche mesurant respectivement l’axe de polarisation de l’émission X et Y. Abréviation : 2PF = fluorescence à deux photons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Distribution conique du dipôle d’émission du colorant (demi-angle, Ψ) par rapport à l’axe long des fibrilles. La ligne pointillée montre le long axe des fibrilles. La rotation de la fibrille dans le plan d’échantillonnage du microscope XY est décrite par l’angle. Les aberrations de Ψ dues aux rotations moléculaires dans les filaments sont décrites par ΔΨ. Ce chiffre provient d’Obstarczyk et al6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Intensité simulée de la fluorescence polarisée excitée à deux photons. Fluorescence calculée pour (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1° ; b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1° ; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Les lignes rouges, bleues et jaunes correspondent respectivement à , Equation 32et + Equation 32. L’angle Equation 26Equation 26 Φ décrit la rotation de la fibrille dans le plan d’échantillonnage du microscope XY, la distribution conique Ψ du dipôle d’émission et les aberrations ΔΨ- de Ψ dues aux rotations moléculaires dans les filaments. Tous les autres paramètres étaient identiques dans tous les cas : K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 et δ = 0,98845. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Graphiques polaires des ensembles de données expérimentales. (A,B) Exemples de graphes polaires après ajustement de deux ensembles de données expérimentales recueillis lors des mesures ps-TPFM des sphérulites d’insuline bovine. Les composantes d’émission mesurées Equation 1 et Equation 2 excitées à deux photons pour les axes de polarisation d’émission X et Y sont présentées par des points rouges et bleus, respectivement ; tandis que les lignes pleines présentent les composantes d’émission de fluorescence excitée à deux photons simulées correspondantes pour l’axe Equation 26 de polarisation d’émission d’émission X et Y et Equation 32. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La microscopie à deux photons sensible à la polarisation est un outil précieux pour étudier l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des superstructures amyloïdes, ne nécessitant que de petites modifications de la configuration multiphotonique standard. Puisqu’il fonctionne sur des phénomènes optiques non linéaires, il est possible d’obtenir une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée par rapport aux méthodes de microscopie à fluorescence excitée par un photon. De plus, elle conduit à une diffusion plus faible de la lumière, à une phototoxicité plus faible et à une pénétration plus profonde de l’échantillon par rapport aux techniques de microscopie à fluorescence à excitation à un photon19,20. Comme nous l’avons déjà prouvé, il est bien adapté aux mesures d’agrégats denses de protéines tels que les sphérulites, qui peuvent être effectuées sans marquage21.

Cependant, pour utiliser efficacement la méthode décrite ici, il convient d’accorder une attention particulière à plusieurs questions clés. En commençant par la préparation de l’échantillon et sa qualité, c’est-à-dire l’incubation, assurez-vous toujours que les superstructures amyloïdes se sont développées correctement. Dans le cas des sphérulites, nous avons utilisé un microscope optique polarisé avec des polariseurs croisés pour localiser les sphérulites matures, qui donnent un motif caractéristique de croix de Malte et ont un rayon de ~5 μm16. Cependant, les sphérulites sont hétérogènes et des structures distinctes peuvent être observées dans l’échantillon. Par conséquent, il est crucial de choisir des espèces séparées et non déformées. En ce qui concerne le système de mesure lui-même, il est crucial de contrôler la polarisation de la lumière incidente afin de déterminer avec précision la polarisation du faisceau à l’entrée du corps du microscope et de minimiser la dépolarisation introduite par les éléments optiques utilisés22. Pour garantir les meilleures performances, nous vous recommandons d’utiliser des miroirs argentés et des filtres optiques de haute qualité adaptés aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de fluorescence. En raison du rôle clé de la polarisation de la lumière également dans le trajet d’émission, il est essentiel de mesurer un échantillon de référence isotrope avant la mesure proprement dite. Si le chemin d’excitation et les détecteurs APD sont correctement alignés, on devrait voir un signal d’intensité égale sur les deux détecteurs, comme le montre la figure 4C. La référence doit générer une forte fluorescence excitée à deux photons à une puissance laser relativement faible pour éviter le photoblanchiment ; Nous avons utilisé la fluorescéine car ses sections efficaces d’absorption de deux photons pour différentes longueurs d’onde étaient déjà rapportées dans la littérature23.

Pour déterminer correctement la disposition des structures à l’intérieur des sphérulites, une grande attention doit également être accordée à l’analyse des données. L’hypothèse de base de ce modèle est la colinéarité du moment dipolaire de transition de l’absorption et de l’émission de lumière. Dans cette hypothèse, l’alignement du moment dipolaire de transition de la molécule parallèlement à la polarisation de la lumière incidente permet sa combinaison avec la structure interne de l’échantillon testé, ce qui donne l’intensité d’émission la plus élevée. Le modèle donné peut également être utilisé comme une bonne approximation pour les petites différences d’angle entre les deux moments dipolaires8 , mais nécessite d’autres modifications pour les grands écarts. Par conséquent, comme nous l’avons décrit, certaines hypothèses concernant l’échantillon doivent être prises en considération a priori par rapport à l’imagerie et à l’analyse des données. Dans le cas modèle sur lequel la simulation et les équations utilisées dans cette méthode sont basées, la principale source de dépolarisation dans le système est le miroir dichroïque. Par conséquent, avant de procéder à l’analyse des données, il est nécessaire de déterminer les paramètres responsables de la dépolarisation introduite par le miroir dichroïque en raison de leur impact sur la forme des graphiques polaires collectés et, par conséquent, la détermination correcte de l’organisation des molécules au sein de la structure examinée lors de l’ajustement18. Cela devient un problème clé, en particulier dans le cas de mesures pour plusieurs longueurs d’onde, car la modification de l’ellipticité du miroir dichroïque est nettement dépendante de la longueur d’onde12. L’induction de la dépolarisation peut fortement affecter les caractéristiques du signal collecté11. Enfin, lors de la création du script pour l’analyse des données, il faut faire attention lors de l’introduction des fonctions et variables mathématiques présentées dans la dernière partie du protocole. Pour éviter les erreurs, concentrez-vous sur des fonctionnalités telles que l’appel de plusieurs fonctions et les paramètres globaux, ce qui accélérera également considérablement le temps d’analyse.

Il convient également de mentionner les problèmes les plus courants que l’on peut rencontrer lors de l’utilisation de la méthode décrite. Le temps de préparation de l’échantillon dépend beaucoup de la vitesse de durcissement du produit de montage. Pour accélérer cela, nous recommandons que les échantillons soient préparés dans un endroit chaud et sec et que la solution de sphérulite soit scellée avant de la monter dans un microscope. Des mesures effectuées trop tôt peuvent entraîner le descellement de la lame et la destruction de la lentille d’objectif utilisée. De plus, malgré une préparation adéquate de l’échantillon, de petites sphérulites peuvent flotter dans la solution pendant la mesure en raison de la contrainte matérielle introduite par l’objectif. Pour éviter cela, nous vous conseillons de scanner des structures isolées de taille moyenne, car les plus grandes sont généralement des agrégats. Il est recommandé de vérifier si la sphérulite scannée s’est déplacée après l’acquisition des données, par rapport à l’image avant de commencer la mesure. De plus, malgré l’alignement correct de tous les éléments optiques et détecteurs utilisés pour mesurer le ps-2PFM, les intensités mesurées Equation 1 et Equation 2 de la référence isotrope peuvent encore différer légèrement en intensité. Dans ce cas, il est nécessaire d’en tenir compte lors de l’analyse des données des mesures de l’échantillon en multipliant l’une des intensités par le facteur de correction déterminé lors des mesures de référence. Enfin, il est possible que pendant la procédure d’ajustement, le script ne soit pas en mesure de trouver des valeurs correspondantes de Φ et ΔΨ. Cela peut être dû à plusieurs facteurs : les données ont été recueillies à partir d’un endroit désorganisé d’un échantillon, par exemple, le noyau d’une sphérulite ; la structure étudiée n’était pas complètement formée pendant l’incubation ; simulation incorrecte de et Equation 32; utilisation de Equation 26 paramètres de miroir dichroïque incorrects γ et δ ; pas trop grand pour les angles Φ et ΔΨ entre chaque itération lors de l’ajustement. Dans le cas d’un endroit désorganisé, nous recommandons d’essayer de collecter des données à partir de points situés plus près du périmètre de la structure examinée. Dans le cas d’une structure incomplètement formée, répétez l’incubation ou recherchez d’autres structures sur la lame. Dans le cas de simulations incorrectes, vérifiez manuellement si, en modifiant les paramètres Φ, Ψ et ΔΨ, les intensités Equation 26 simulées et Equation 32 modifiez et corrigez les erreurs dans le code. En cas de paramètres de miroir dichroïque incorrects, vérifiez soigneusement les paramètres de γ et de δ du miroir dichroïque utilisés lors des mesures. Dans le cas d’un grand jeu de pas pour les angles lors de l’ajustement, réduisez l’intervalle entre les itérations successives à 2º ou 1º. Il faut également rappeler qu’en cas de forte désorganisation locale de la structure, R2 sera toujours plus faible, souvent de l’ordre de 0,5 à 0,6. En effet, le modèle présenté décrit des molécules hautement ordonnées où la plupart des moments dipolaires transitoires sont alignés dans une direction similaire ; Par conséquent, l’appariement de structures amorphes ou très désordonnées conduit à des coefficients de corrélation plus faibles. Par conséquent, il est crucial de posséder au moins quelques informations structurelles sur l’échantillon avant la mesure pour analyser correctement les données obtenues.

Il convient également de noter que la méthode présentée présente plusieurs limites. L’analyse des données pourrait aboutir à plusieurs valeurs d’angles Φ et ΔΨ avec des facteurs de corrélation suffisamment élevés, ce qui obligerait l’expérimentateur à utiliser ses connaissances et son expérience pour sélectionner les valeurs appropriées. Dans ce cas, les conditions aux limites doivent être prises en compte, telles que le demi-angle du cône fluorophore Ψ doit toujours être plus grand que son aberration ΔΨ. De plus, en comparant nos données avec la littérature, il est intéressant de noter que certains articles décrivent Ψ comme un angle de cône complet, alors que nous opérons sur un angle de demi-cône. Une autre limitation est la résolution de mesure, limitée à une résolution inférieure au micron. Pour cette raison, la photo-sélectivité du système et la détermination de l’organisation locale qui en résulte sont basées sur le signal moyenné des fibrilles excitées dans le point focal plutôt que sur des structures individuelles. De plus, l’échantillon lui-même doit posséder un rendement quantique de fluorescence suffisant, car une longue exposition sous la puissance laser incidente de fs (nécessaire pour acquérir des données pour les graphes polaires) peut être destructrice et avoir un impact sur les résultats.

Malgré ces difficultés, nous pensons que la méthode présentée dans cet article a un large éventail d’applications, pour l’imagerie de biostructures en milieu hydraté et complexe. Nous avions précédemment montré que l’ordre local des fibrilles calculé à partir des données ps-2PEF est en corrélation avec les informations dérivées de la microscopie électronique à transmission7. Par conséquent, nous avons confirmé la validité du ps-2PEF en bio-imagerie et élargi les connaissances sur l’ordre structurel des superstructures amyloïdes. Cette méthode peut être appliquée pour connaître l’origine de la fluorescence intrinsèque observée dans le cas de divers composants d’échantillons biologiques, tels que l’autofluorescence d’agrégats de protéines, les amyloïdes. Compte tenu des données pertinentes sur l’orientation des directions des moments dipolaires d’absorption/émission par rapport au grand axe des fibrilles amyloïdes, les propriétés optiques des fibrilles peuvent être corrélées avec leur structure6. Nous avons indiqué que pour les structures dont l’angle Ψ est déjà déterminé, cette technique permet de détecter des caractéristiques structurales distinctes des superstructures amyloïdes et des polymorphes des superstructures de l’insuline en fonction du niveau de leur organisation7. Comme indiqué précédemment dans le protocole, la configuration présentée pourrait également être appliquée pour les mesures de génération de deuxième harmonique sensibles à la polarisation, ce qui est également une technique de microscopie à deux photons sans marquage24. Cela nécessitera non seulement de monter différents filtres optiques, mais aussi de modifier les formules utilisées pour l’analyse des données25. De plus, avec l’ajout d’une quart de lame d’onde correctement alignée, il pourrait être utilisé pour exciter l’échantillon avec une lumière polarisée circulairement, ce qui pourrait conduire à la génération de propriétés optiques chirales non linéaires des amyloïdes puisqu’il s’agit de biopolymères chiraux avec de fortes propriétés chiroptiques confirmées26. Cependant, dans un tel cas, le vecteur électrique en rotation constante conduirait à un changement constant de direction de l’émission excitée, ce qui rendrait impossible la détermination d’une information structurelle à l’aide des équations présentées dans ce manuscrit. Dans l’ensemble, le ps-2PEF est un outil prometteur pour la détermination de l’organisation au sein de nombreuses biostructures complexes avec des dipôles d’émission ordonnés, tels que des agrégats de protéines, de l’ADN ou des tissus de manière non invasive.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le projet Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) financé par le Centre national des sciences en Pologne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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