Summary
本文描述了如何应用偏振敏感双光子显微镜来表征无标记淀粉样蛋白超结构-球晶中的局部组织。它还描述了如何制备和测量样品、组装所需的设置以及分析数据以获取有关淀粉样蛋白原纤维局部组织的信息。
Abstract
与单光子激发相比，双光子激发有利于生物成像实验，因为它具有较低的光毒性、更深的组织穿透性、在密集系统中的高效操作以及减少荧光团的角度光选择。因此，与基于线性光学过程的标准成像方法相比，在双光子荧光显微镜 （2PFM） 中引入偏振分析可以更精确地确定样品中的分子组织。在这项工作中，我们重点研究了偏振敏感的2PFM（ps-2PFM）及其在复杂生物结构-淀粉样蛋白球晶中分子有序测定中的应用。阿尔茨海默氏症或帕金森氏症等神经退行性疾病通常通过检测由于蛋白质错误折叠过程受损而形成的淀粉样蛋白-蛋白质聚集体来诊断。探索它们的结构可以更好地了解它们的产生途径，从而开发更灵敏的诊断方法。本文介绍了适用于测定牛胰岛素球晶和球形淀粉样蛋白聚集体内部局部原纤维顺序的ps-2PFM。此外，我们证明了所提出的技术可以解决球状体内部原纤维的三维组织。
Introduction
在过去的几十年中，尽管许多用于蛋白质及其聚集体生物成像的荧光显微镜技术已经取得了重大发展1，但只有少数技术被用于解析它们在样品中的局部排序 2,3。采用荧光寿命成像显微镜4研究了淀粉样蛋白超结构-球晶的内在结构异质性。此外，可以使用偏振敏感方法解决复杂和致密的生物结构（如球晶）内部局部顺序的定量测定3。然而，具有浅层组织穿透的标准荧光技术是有限的，因为使用紫外可见分光度在体内激发荧光团会导致高组织光散射5。此外，这种成像通常需要设计特定的荧光探针并将其结合到目标生物分子上，从而增加了执行成像所需的成本和工作量。
最近，为了解决这些问题，我们的团队采用了偏振敏感双光子激发荧光显微镜 （ps-2PFM） 对生物结构进行无标记成像 6,7。Ps-2PFM允许测量双光子荧光强度对激发光束线性偏振方向的依赖性，并分析发射荧光的偏振8。该技术的实施需要用半波板补充标准多光子显微镜设置激发路径（图1）以控制光偏振平面。然后，从两个雪崩光电二极管收集的信号中创建极坐标图，描述双光子激发荧光强度对激发激光束偏振的依赖性，从而收集荧光偏振的两个相互垂直的分量。
最后一步是数据分析过程，考虑到光学元件（如二向色镜或高数值孔径物镜）对偏振的影响。由于双光子过程的性质，这种方法既减少了角度选择，又提高了轴向分辨率，因为焦平面外荧光团的双光子激发在概率上受到限制。还证明，类似的方法可以成功地用于近红外探针 （NIR） 的体内成像，用于深部组织成像9。Ps-2PFM先前已应用于细胞膜10和DNA11,12中的成像荧光团，以及生物系统的非标准荧光标记物，例如金纳米颗粒13。然而，在所有这些例子中，有关生物分子组织的信息都是间接获得的，并且需要荧光团和生物分子之间预定义的相互取向。
在我们最近的一篇论文中，我们已经证明 ps-2PFM 可以成功地用于确定淀粉样蛋白超结构的自发荧光的局部极化和硫黄素 T（一种淀粉样蛋白特异性染料）与球晶中的淀粉样蛋白原纤维结合的荧光6。此外，在另一项研究中，我们已经证明 ps-2PFM 可用于检测亚微米尺寸范围内淀粉样蛋白球晶内的淀粉样蛋白原纤维取向，这通过将其与透射电子显微镜 （TEM） 成像相关联来证实7.这一结果的实现得益于：i）球晶-淀粉样蛋白的内在自发荧光，当用一个或两个光子激发时，表现出内在的自发荧光，最大发射波长位于450至500nm范围内，双光子吸收截面与标准荧光染料相当14，ii）前面介绍的数学模型，用于描述如何将标记生物膜和DNA结构的染料的ps-2PEF应用于球晶和与其结合的染料表现出的荧光 8,11,15。因此，在进行分析之前，我们强烈建议您仔细阅读我们关于该主题的第一篇论文的正文和支持信息中描述的所需理论6.在这里，我们介绍了如何应用ps-2PFM技术对牛胰岛素球晶进行无标记淀粉样蛋白结构表征的方案。
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Protocol
1.用完全生长的球晶准备显微镜载玻片
注意：有关本协议中使用的所有材料，试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。所有溶液均采用从净水系统获得的去离子水（25 °C时为18.2 MΩ·cm）制备。
- 根据Krebs等人描述的方案孵育淀粉样球晶16。 进行一些修改，如下所述。
- 在 1.5 mL 试管中称取 10 mg 胰岛素粉。
- 用 1 mL 去离子 H2O/HCl 溶液 （pH 1.5） 等分试样溶解粉末。
- 用胶带密封样品并将其放入热混合器中，在70°C（0rpm）下孵育24小时。
注意：为了在天然（即水合）环境中对淀粉样蛋白进行成像并防止样品因脱水而变形，有必要根据以下描述准备显微镜载玻片（ 方案如图 2 所示）。
- 用水彻底清洗显微镜载玻片。
- 将载玻片浸入甲醇中，然后在环境条件下用无尘湿巾晾干。
- 用自动移液管从试管中取出100μL等分的球晶溶液（步骤1.1.2），并将其加入位于显微镜载玻片中心区域的孔中。
- 用盖玻片盖住溶液，避免气泡形成。
- 用自动移液器沿盖玻片的边缘将封片剂沉积在载玻片上，以密封球晶的天然溶液。
注意： 在盖玻片和载玻片表面上都沉积载玻片封片剂非常重要。由于挥发性溶剂（二甲苯）的毒性，在发烟罩下执行此操作。请参阅 图 2 中的插图。 - 将显微镜样品置于环境条件下，让封片剂硬化。
注意：硬化过程取决于温度和湿度，但应在 12 小时内完成。 - 使用带有交叉偏振片的偏振光学显微镜 （POM） 检查胰岛素球晶是否正确形成。扫描样品，寻找明亮区域的特征图案，称为马耳他十字，如 图 3 所示。
注：淀粉样球晶可以定义为球形超结构，其特征是具有核壳结构的异质形态。详细地说，它们由无定形核心和径向生长的淀粉样蛋白原纤维16组成。由于球晶结构的各向异性特性，它们可以与偏振光（例如，通过折射）独特地相互作用并改变它们的相位，这可以很容易地在带有交叉偏振片的POM下观察到。该方法仅用于研究以模型状麦芽糖酶交叉图案为特征的完全发育的球晶。因此，聚集体或结构扭曲的球晶被排除在进一步研究之外。
2. 构建和调整系统
注：偏振敏感双光子显微镜的示意图如 图1所示。
- 安装输出波长可在 690-1,080 nm 范围内的飞秒激光器，例如，在锁模 Ti：蓝宝石激光器上运行，重复频率为 ~100 fs 脉冲，重复频率为 80 MHz。
- 将安装在旋转台上的半波板添加到装置的激发路径中，以控制XY显微镜样品平面中入射光的偏振。
- 安装二向色镜以切断来自检测光学元件的激发光束。
注意：二向色镜的光学特性应允许在近红外波长范围内反射激发光束（到样品），同时在与样品发射相对应的波长范围内是透明的。 - 安装压电扫描台，用于在所选 Z 轴的 XY 平面内进行光栅扫描。
- 安装高数值孔径浸没物镜，例如复消色差油浸物镜 100x/1.4 NA。
注意：由于整个设置在落射荧光模式下运行，因此入射信号和发射信号通过同一目标。 - 在发射路径中，添加一个偏振分束器，将双光子激发发射分成两个正交偏振分量（IX 和 IY）
- 在允许它们分别使用分束器收集传输和反射的光的配置中安装两个光子计数雪崩光电二极管 （APD）（图 1）。
- 在系统的激发和发射路径上安装正确的波长相关截止滤光片，例如，将 800 nm 长通滤光片直接安装在激发光路中，将 700 nm 短通滤光片安装在发射路径中。
注意：分析球晶的发射光谱，以便使用正确的发射滤光片可以排除二次谐波产生 （SHG） 或激光的任何潜在贡献。还值得注意的是，该系统还应该允许测量偏振敏感的SHG，这可用于解析样品中生物分子的顺序。然而，SHG信号的数据分析与荧光不同，Aït-Belkacem等人更详细地描述了荧光17。 - 对准整个系统（使用许多激光器内置的对准模式），直到使用两个光电二极管收集到相似的信号强度。
- 检查由高数值孔径物镜聚焦并在相机上成像的激发光束是否具有同心圆形，如 图4A所示。
- 调整扫描时间和相应的功率，以尽量减少入射激光对样品造成的损害。示例性点状燃烧如 图4B所示。使用连接到位于显微镜主体入口处的光电二极管功率传感器的数字手持式功率计测量标称功率。
注意：由于激光照射，生物标本很容易被烧毁。在这种情况下，100 -900 μW的功率范围（在物镜的焦点处）被发现是样品稳定性和强发射之间的极好权衡。 - 在样品测量之前，测试光学器件与各向同性参考样品（例如，非晶态聚合物中体现的荧光素）的对准质量。要执行校准检查，请按照第 3 节中描述的步骤使用各向同性参考而不是淀粉样蛋白样品。
注：假设显微镜设置针对具有各向同性特性的样品进行了理想调整，用两个APD检测到的两个2P发射分量（IX 和IY）都应具有相同的强度（图4C）。
3. 牛胰岛素球晶的测量
注：为了执行所有描述的ps-2PF测量，使用了手写软件，该软件控制压电载物台和半波片的位置，并收集来自两个光电二极管的信号，允许绘制显微镜载玻片上选定区域的XY扫描（光栅扫描）以及来自特定样品坐标的极坐标图。该协议还添加了其他注释，这将允许用户在没有它的情况下执行测量，因为用于旋转半波板的压电台和旋转台都可以使用他们自己的控制器或相应的软件进行控制。尽管如此，强烈建议编写一种算法，将半波板的旋转角度与两个光电二极管收集的 2PEF 强度相结合，因为这种相关性（极坐标图）对于适当的数据分析至关重要，从而获得结构信息。
- 将带有球晶的试样安装在压电载物台上（用胶带固定载玻片）。确保以薄玻璃面（盖玻片）朝向物镜的方式安装它，因为高数值物镜的特点是工作距离相对较短。
注意：由于使用油浸，在样品安装和聚焦之前，应将一小滴矿物油滴在物镜上。 - 通过使用显微镜旋钮改变 XY 和 Z 位置，将物镜聚焦在溶液中发现的球晶之一上，但请注意，由于球晶直径通常在数十微米的范围内，因此聚焦在整个结构的中心区域内。在特定球晶周围寻找黑色和白色光晕，分别作为焦点不足和上焦的迹象。将“Z”轴调整为介于这些极端之间。
注意：找到一个没有结构缺陷的分离样品是很重要的。由于物镜引入的材料应力，极小的球晶可能会漂移，而最大的结构可能是聚集或高度扭曲的。 - 将球晶居中于观察到的微观平面的视场中，并通过查看X和Y方向上需要多少个压电阶步骤（显示在压电台控制器或其软件中）来确定XY扫描的大小。
注意：建议以这样的方式设置系统，即 XY 扫描的起点位于球晶的一个角附近，并与载物台的零位置重合（X 和 Y = 0） - 调整以下扫描参数：
- 调整激发光束的偏振度，旋转半波片，得到显微镜样品平面的“X”和“Y”轴对应的偏振。
注意：这可以通过测量各向同性荧光介质（如荧光素）的极坐标图来完成。对于此类材料，最大荧光强度平行于激发光束偏振;因此，旋转半波板可以调整观察平面上X轴和Y轴的偏振，在极坐标图上也表示为X轴和Y轴，如 图4C所示。通过收集两个光电二极管上测量的 2PEF 强度，可以测量半波板旋转 180°（激发光偏振旋转 360°），并将强度与激发光偏振角相关联。它可以手动完成，通过单独测量每个半波板角度的发射强度，然后在数据分析软件中将其组装成极坐标图，或者使用专用或自行编写的软件自动完成。 - 调整压电台参数：扫描速度、步长和范围，以覆盖整个球晶的面积。
注意：扫描范围必须高于球晶直径，才能在光栅扫描中完全覆盖整个上部结构。低扫描速度和步长使用户能够获得高质量的图像;但是，这可能会导致样品烧毁。因此，需要根据球晶尺寸进行权衡。这些参数不能普遍应用。 图5A中使用的示例性参数：扫描范围45 x 45 μm，扫描步骤1 μm，扫描速度2 μm/s。
- 调整激发光束的偏振度，旋转半波片，得到显微镜样品平面的“X”和“Y”轴对应的偏振。
- 打开快门，打开光电二极管，并收集
所 
选扫描区域每一步的2P发射分量 - 激发光束相应地偏振到X轴，然后是Y轴。 图5A显示了胰岛素球晶的示例性双光子激发自发荧光（2PAF）光栅扫描。
注：测量光栅扫描需要将压电平台坐标与收集的发射分量相关联，这可以手动完成，方法是测量所选区域每个点的强度，然后将其组装成 2D 矩阵，或者通过自行编写的软件自动完成。光栅扫描可以表示为发射分量强度的总和，也可以表示为特定发射分量的独特表现。由于它们高度依赖于结构，因此很容易看到球晶内的结构变形。然而，由于显微镜载物台的移动，一些样品可能会偏离视野。因此，需要对图像进行伪影筛查。有必要在扫描前后检查球晶的位置。 - 要从样品上的特定光斑进行全偏振分析，请关闭激发光束。
- 随后，选择与球晶上所选位置相对应的压电子级的特定坐标，其中需要以亚μm分辨率获得有关分子取向的信息。
- 调整压电载物台以将视场居中 view在指示 （X， Y） 处。
- 打开激发光束，通过打开半波板的旋转（180°旋转）进行全（360°）偏振和发射分析。以极坐标图的形式呈现 2PF Ix 和 Iy 分量（如图 5B 所示）。
注意：可以在样品的不同位置重复此步骤，以收集足够数量的数据。
4.确定牛胰岛素球晶内的局部原纤维顺序
注意：所有与数据分析相关的数值计算都是使用 Python 编程语言完成的，并基于库 NumPy 和 SciPy 中可用的函数。绘制数据需要 Matplotlib 库。所有计算均基于Obstarczyk等人6的一篇论文中的支持信息中提出的公式。
- 模拟为分子的指定分布而激发的双光子荧光的强度，其入射光偏振的选定方向（用 α)
注：所提出的公式基于荧光团的平行吸收和发射偶极矩的假设。有关其他情况的讨论（例如，吸收和发射偶极矩的不同方向，荧光团之间的能量转移），请参阅Le Floc'h等人的论文8.- 查找考虑由安装在装置中的二向色镜引起的偏振混合和去偏振效应引起的电场变化的参数：
- γ 表示来自二向色镜的
反射率和 
偏振光之间的振幅因子。 - δ表示偏振光和偏振光之间的相移（椭圆度）。
注意：正确定义这两个参数对于成功的结构表征至关重要，因为它们对测量的极坐标图11,18 的形状有很大影响。在所提出的系统中，这两个参数都是在对系统中施加的二向色镜进行椭偏仪测量时确定的。
- γ 表示来自二向色镜的
- 使用公式 （1-5） 计算在 ps-TPFM 测量期间测量的每个角度的 X 轴和 Y 轴上传播的入射电场矢量。
（1）
（二）
（3）
（4）
（5）
注意 如果使用步长 1° 在整个 360° 上测量强度，请计算所有 360° 的电场矢量。所有角度都应以弧度为单位。 ρ 参数与模拟电场的光频 ω （ρ=ω·t），并在计算 ps-TPFM 测量期间测量的每个角度在 X 轴和 α Y 轴传播的入射电场矢量时使用 0 到 2π 积分。 - 根据方程 （6-8） 定义笛卡尔系统三个轴方向上的跃迁偶极矩的函数：
（6）
（7）
（8）
注意：φ 是 XY 样品框架中淀粉样原纤维长轴的方向角。θ 角和 φ 角是用于定义荧光团过渡偶极矩方向的极角和方位角。 - 使用步骤 4.1.3 中定义的函数。定义 Jx （Φ，θ，φ） 和 JY（Φ，θ，φ） 的函数，使用公式 （9， 10） 解释高数值孔径物镜的紧密聚焦对 X 和 Y 方向荧光偏振检测的贡献。
（9）
（10）
注意： K1、 K2、 K3 因素与 ps-TPFM 测量期间使用的显微镜物镜有关。在这些实验中，使用复消色差油浸物镜 100x/1.4 NA，K1、 K2、 K3 因子分别为 2.945、0.069 和 1.016。 - 定义 f（Ω） 的函数，该函数是分子角分布，取决于荧光团锥体的半孔径 Ψ，厚度可变 ΔΨ;使用等式（11）。 图 6 显示了与淀粉样原纤维有关的所有三个角度的图形表示。
（11）
注意：写指数时要小心 - 2 的幂适用于函数参数，而不是整个函数！ - 定义所有 fWWIJKL 因子，如等式 （12-21） 所示。
（12）
（13）
（14）
（15）
（16）
（17）
（18）
（19）
（20）
（21） - 使用方程（22,23）计算双光子激发的荧光强度
和
每个测量角度（类似于第4.1.2点）。
= 
（22）
= 
（23） - 使用以下变量值（放置在图7的图例中）检查仿真是否正常工作，并将获得的结果与图7A-C进行比较。
注意：所有度数都应以弧度书写。
- 查找考虑由安装在装置中的二向色镜引起的偏振混合和去偏振效应引起的电场变化的参数：
- 将模拟强度拟合到ps-2PFM测量期间收集的牛胰岛素球晶的双光子激发自发荧光的强度中。
注：基于ps-2PFM测量解析球晶结构需要使用协议中编写的方程来模拟双光子激发荧光的理论强度，并拟合与分子荧光团排序相关的所有参数。它需要对 Φ 和 Δ Ψ 的各种值进行多次迭代，Φ 是描述 XY 显微镜样品中原纤维旋转的角度，以及 ΔΨ，由于灯丝中的分子旋转而导致的发射偶极子 Ψ 的锥形分布的像差固定 Ψ，直到达到测量期间收集的归一化双光子激发荧光信号强度与根据协议的步骤 4.1。- 确定 Ψ 半角。
注意：对于牛胰岛素球晶，它应等于 Ψ = 29°6。 - 试衣工作流程：
- 在 0° 到 180° 之间选择 Φ 的值（在 图 8A 和 8B 中，Φ = 16° 和 127°）。
- 在 0° 到 90° 之间选择 ΔΨ 的值（在图 8A、B 中，ΔΨ = 24° 和 1°）。
- 使用所选的 Φ 和 ΔΨ 值计算（公式 22）和（公式 23）的整个测量范围的 θ 角。
- 比较模拟期间计算的强度（均归一化为最大值
- 计算 ），归一化强度
- 计算 和 （均归一化为 的最大值 ） 在 ps-2PFM 测量期间测量。
注：在所介绍的实验中，使用NumPy Python库中的“corrcoef”函数计算Pearson积矩相关系数。
- 最后，选择 Φ 和 ΔΨ 的值，从而获得最高的相关系数，并在模拟强度和测量信号之间收敛，如 图 8 所示。
- 确定 Ψ 半角。
反射率和 
偏振光之间的振幅因子。
（1）
（二）
（3）
（4）
（5）
（6）
（7）
（8）
（9）
（10）
（11）
（12）
（13）
（14）
（15）
（16）
（17）
（18）
（19）
（20）
（21）
每个测量角度（类似于第4.1.2点）。
= 
（22）
= 
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Representative Results
所提出的方案通过制备用于 ps-2PFM 测试的淀粉样蛋白超结构、微观系统的构建和适当样品的测量提供了分步指导。然而，在进行最终一组测量之前，将APD与各向同性参考正确对齐至关重要，这应该会导致在两个探测器上收集形状和强度相似的对称信号（图4C）。在进一步的测量中，特别是在分析过程中，应将检测器在X轴和Y轴上测量的强度之间的最小差异作为适当的校正因子考虑在内。安装后，样品含有单个球晶，在POM上产生特征性的马耳他十字架，如图2B所示，在执行2PFM光栅扫描后，图像应与图5A所示的图像相似，这与报告的球晶6,7和不同有组织生物分子11,12的2PFM光栅扫描一致.人们可能会观察到具有最高亮度的轴的位置发生了一些变化，这与荧光信号强度强烈取决于激发光束的偏振有关。因此，有必要验证半波片的哪个位置对应于样品沿X（图5A，顶部）和Y（图5A，底部）轴的激发。还值得注意的是，在从不同的选定点进行全偏振分析时，极坐标图是如何变化的。在球晶石之外，极坐标图看起来像是伪影和随机信号噪声尖峰的集合（图5B，I）。这样的图表还可以指示球晶在测量之间的漂移，并且需要通过另一次 2PF 光栅扫描找到整个结构的新坐标。从胰岛素球晶沿 X 轴和 Y 轴的高度有序位置正确测量的极坐标图分别如图 5B II 和 III 所示。它们可以具有不同的形状和几何形状，具体取决于从所选斑点7 测量的荧光团的局部取向和组织。
该协议的最后一步侧重于使用基于数学模型的算法分析获得的数据，该算法结合了XY平面Φ中淀粉样纤维的取向，相关的荧光团瞬态偶极矩Ψ及其像差ΔΨ （图6）与强度 
和 
双光子诱导荧光。在输入适当的输入数据（协议步骤4.9）后，协议中正确实现的功能应产生与 图7所示相同的极坐标图。任何偏差 - 不同的数据方向、强度或模拟 
和 
形状 - 都表示代码中的错误。如果该模型有效，则可以进行协议的最后一步 - 将模拟数据拟合到从ps-2PFM测量中获得的真实数据。选择的 Φ 和 ΔΨ 值具有最高的相关系数，并且模拟强度与测量信号之间的收敛性应导致类似的图像，如 图 8 所示。应具有最佳拟合 度和 函数， 并且 Φ 和 ΔΨ 的值应与球晶石上被测点中原纤维和荧光团的局部取向相对应。类似的模型和拟合方法也可用于确定其他生物分子（如 DNA11）的局部组织。
图 1：双光子偏振敏感显微镜设置。 显示用于牛胰岛素球晶偏振敏感双光子激发荧光测量的双光子显微镜装置的方案。水平和垂直偏振（到显微镜样品平面）的双光子激发发射分量分别用 IX 和 IY 表示。缩写：SP = 样品平面;O = 目标;DM = 二向色镜;λ/2 = 半波片;LPF = 长通滤波器;BE = 扩束器;P = 格兰偏振片;Ti：Sa=Titan：蓝宝石激光光源;M = 镜子;SPF = 短通滤光片;PBS = 偏振分束器;L = 光学透镜;APD = 雪崩光电二极管。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：显示载玻片制备/照片的方案。 （A） 密封样品制备方案;（二）样品封口后续步骤的照片。I：将 100 μL 球晶溶液等分试样放在显微镜载玻片上，并带有孔，II：盖玻片滴在溶液顶部;III：由沉积的聚合物（封片剂）形成的紧密密封。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：偏振光显微镜下胰岛素球晶的质量控制。 （A1，B1） 明场模式以及 （A2，B2） 交叉偏振片。在用交叉偏振片拍摄的相应图像上可以观察到特征性的马耳他十字图案。（A）具有结构变形的球晶聚集体，（B）高质量的孤立球晶。比例尺 = 5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：测试 ps-2PFM 系统的对齐情况。 （A）荧光素荧光的同心散焦图像，如无（A1）和（A2）二向色镜所见， （B） 光损伤球晶，由于沿 x 和 y 方向在选定点进行细长偏振分析而产生烧孔，（C）依赖于各向同性样品（荧光素溶液）的入射光偏振角的双光子激发发射分量。并表示由雪崩光电二极管分别测量 X 和 Y 发射偏振轴测量的发射分量。比例尺 = 5 μm （A1，A2）， 10 μm （B）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：来自无标记胰岛素球体的示例性 2PFM 光栅扫描和极坐标图。 （A） 无标记胰岛素球晶的 2PF 强度光栅扫描： 激发光的偏振： （A1） 水平偏振、（A2） 垂直偏振和发射用白色箭头表示，插图显示了在标准偏振光显微镜下成像的相同球晶与交叉偏振片。（B） 从 A1 扫描（B1，I; B2，II级; B3，III级）。 Ix和 Iy表示分别由测量 X 和 Y 发射偏振轴的雪崩光电二极管测量的发射分量。缩写：2PF=双光子荧光。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：染料的发射偶极子（半角，Ψ）相对于长原纤维轴的锥形分布。 虚线表示长原纤维轴。原纤维在XY显微镜样品平面中的旋转由角度描述。由于细丝中分子旋转而导致的 Ψ 像差由 ΔΨ 描述。该图来自 Obstarczyk 等人6。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7：偏振双光子激发荧光的模拟强度。荧光计算公式为 （A） Φ = 1°， Ψ = 1°， ΔΨ = 1°;（b） φ = 1°， ψ = 30°， δψ = 1°;（c） φ = 1°， ψ = 30°， δψ = 60°。红线、蓝线和黄线分别对应 、 和 +。 Φ角描述了原纤维在XY显微镜样品平面中的旋转，Ψ - 发射偶极子的锥形分布，以及ΔΨ- 由于细丝中分子旋转而产生的Ψ像差。所有其他参数在所有情况下都是相同的：K1 = 2.945，K2 = 0.069，K3 = 1.016，γ = 0.01，δ = 0.98845 。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：实验数据集的极坐标图。 （A，B） 拟合在牛胰岛素球晶的ps-TPFM测量期间收集的两个实验数据集后的示例性极坐标图。X和Y发射偏振轴的实测和双光子激发发射分量分别用红点和蓝点表示;同时，实线表示X和Y发射偏振轴和X发射偏振轴和的模拟双光子激发荧光发射分量。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
偏振敏感双光子显微镜是研究淀粉样蛋白超结构内部原纤维局部有序的宝贵工具，只需对标准多光子设置进行微小修改。由于它对非线性光学现象起作用，因此与单光子激发荧光显微镜方法相比，可以减少角度光选择并增强轴向分辨率。此外，与单光子激发荧光显微镜技术相比，它可降低光散射、降低光毒性和更深的样品穿透力19,20。正如我们已经证明的那样，它非常适合测量密集堆积的蛋白质聚集体，例如球晶，可以以无标记的方式进行21。
但是，为了有效地使用此处描述的方法，应注意几个关键问题。从样品制备及其质量（即孵育）开始，始终确保淀粉样蛋白上部结构正确生长。在球晶的情况下，我们使用带有交叉偏振器的偏振光学显微镜来定位成熟的球晶，这些球晶具有特征性的马耳他十字图案，半径为 ~5 μm16。然而，球晶是异质的，可以在样品中观察到独特的结构。因此，选择分离且不扭曲的物种至关重要。至于测量系统本身，控制入射光的偏振至关重要，这样才能精确确定显微镜主体入口处光束的偏振，并将所用光学元件引入的去偏振降至最低22.为确保最佳性能，我们建议使用与激发和荧光发射波长相匹配的高质量银反射镜和滤光片。由于光偏振在发射路径中也起着关键作用，因此在实际测量之前必须测量各向同性参考样品。如果激发路径和APD探测器正确对齐，则两个探测器上应该会看到同样强烈的信号，如 图4C所示。参考应在相对较低的激光功率下产生强烈的双光子激发荧光，以避免光漂白;我们使用荧光素，因为它的双光子吸收截面在不同波长的文献中已经报道过23.
为了正确确定球晶内部结构的排列，还应该非常注意数据分析。该模型的基本假设是光吸收和发射的跃迁偶极矩的共线性。在该假设下，将分子的跃迁偶极矩平行于入射光的偏振，使其与被测样品的内部结构结合，从而产生最高的发射强度。给定的模型也可以用作两个偶极矩8 之间角度的微小差异的良好近似值，但对于较大的偏差需要进一步修改。因此，如前所述，在成像和数据分析时，必须 先验 地考虑有关样品的一些假设。在该方法所基于的仿真和方程的模型情况下，系统中去偏振的主要来源是二向色镜。因此，在进行数据分析之前，有必要确定导致二向色镜引入去偏振的参数，因为它们对收集的极坐标图的形状有影响，因此，在拟合过程中正确确定被检查结构内分子的组织18.这成为一个关键问题，特别是在测量多个波长的情况下，因为二向色镜椭圆度的变化与波长明显相关12。去极化的感应会强烈影响所采集信号11的特性。最后但并非最不重要的一点是，在创建数据分析脚本时，在引入协议最后一部分中介绍的数学函数和变量时应注意。为避免错误，请关注多函数调用和全局参数等功能，这也将大大加快分析时间。
我们还应该提到使用所述方法时可能遇到的最常见问题。样品制备时间很大程度上取决于封片剂硬化的速度。为了加快速度，我们建议在温暖干燥的地方制备样品，并在将其安装到显微镜中之前密封球晶溶液。过早进行测量可能会导致载玻片开封并损坏使用过的物镜。此外，尽管样品制备得当，但由于物镜引入的材料应力，在测量过程中，小球晶仍可能漂浮在溶液中。为避免这种情况，我们建议扫描孤立的中型结构，因为最大的结构通常是聚集体。建议在开始测量之前，与图像相比，检查数据采集后扫描的球晶是否移动。此外，尽管用于测量ps-2PFM的所有光学元件和探测器都正确对准，但测量的强度和各向同性参考的强度仍可能略有不同。在这种情况下，在分析样品测量数据时，有必要将其中一个强度乘以参考测量期间确定的校正因子来考虑这一点。最后但并非最不重要的一点是，在拟合过程中，脚本可能无法找到任何匹配的 Φ 和 ΔΨ 值。这可能是由于几个因素造成的——数据是从样品上的杂乱无章的点收集的，例如，球晶岩的核心;研究的结构在孵育过程中未完全形成;不正确的模拟;使用不正确的二向色镜参数 γ 和 δ;拟合过程中每次迭代之间的 Φ 和 ΔΨ 角度的步长设置太大。如果位置杂乱无章，我们建议尝试从靠近被检查结构周边的点收集数据。在结构不完全形成的情况下，重复孵育或在载玻片中搜索其他结构。在模拟不正确的情况下，手动检查是否通过更改参数 Φ、Ψ 和 ΔΨ 来模拟强度，并更改和纠正代码中的任何错误。如果二向色镜参数不正确，请仔细检查测量过程中使用的二向色镜的γ和δ参数。如果在拟合过程中为角度设置了较大的步长，则将连续迭代之间的步长减少到 2º 或 1º。还应该记住，在结构的强烈局部混乱的情况下，R2 总是较低，通常在 0.5-0.6 的范围内。这是因为所提出的模型描述了高度有序的分子，其中大多数瞬态偶极矩都以相似的方向排列;因此，匹配无定形或高度无序的结构会导致较低的相关系数。因此，在测量之前至少掌握样品的一些结构信息对于正确分析获得的数据至关重要。
还值得注意的是，所提出的方法具有几个局限性。数据分析可能会产生具有足够高相关因子的 Φ 和 ΔΨ 角的几个值，这需要实验者利用他们的知识和经验来选择合适的值。在这种情况下，必须考虑边界条件，例如荧光团锥半角 Ψ 必须始终大于其像差 ΔΨ。此外，当我们将我们的数据与文献进行比较时，值得注意的是，一些论文将 Ψ 描述为全锥角，而我们则以半锥角进行操作。另一个限制是测量分辨率，仅限于亚微米分辨率。因此，系统的光选择性和由此产生的局部组织确定是基于在焦点激发的原纤维的平均信号，而不是单个结构。此外，样品本身需要具有足够的荧光量子产率，因为在fs入射激光功率下长时间曝光（获取极坐标图数据所必需的）可能会具有破坏性并影响结果。
尽管存在这些困难，但我们认为本文中提出的方法具有广泛的应用，用于水合和复杂环境中生物结构的基于标记和无标记的成像。我们之前已经表明，从 ps-2PEF 数据计算的局部原纤维有序与透射电子显微镜7 得出的信息相关。因此，我们证实了ps-2PEF在生物成像中的有效性，并进一步扩展了对淀粉样蛋白超结构结构有序性的知识。该方法可用于了解在生物样品的各种成分（例如蛋白质聚集体淀粉样蛋白的自发荧光）的情况下观察到的内在荧光的起源。给定有关吸收/发射偶极矩方向相对于淀粉样蛋白原纤维长轴方向的相关数据，原纤维的光学特性可以与其结构相关联6.我们指出，对于已经确定的 Ψ 角的结构，该技术允许根据其组织水平检测淀粉样蛋白超结构和胰岛素超结构多晶型的不同结构特征7。如前所述，所提出的设置也可以应用于偏振敏感的二次谐波产生测量，这也是一种无标记的双光子显微镜技术24。这不仅需要安装不同的滤光片，还需要改变用于数据分析的公式25。此外，通过添加正确对齐的四分之一波片，它可用于用圆偏振光激发样品，这可能导致淀粉样蛋白的手性非线性光学性质的产生，因为它们是手性生物聚合物，已确认具有很强的手性光学特性26。然而，在这种情况下，不断旋转的电矢量将导致激发发射方向的不断变化，因此无法使用本文中提出的方程确定任何结构信息。总而言之，ps-2PEF是一种很有前途的工具，可以以非侵入性方式确定具有有序发射偶极子（例如蛋白质聚集体，DNA或组织）的众多复杂生物结构中的组织。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了波兰国家科学中心资助的Sonata Bis 9项目（2019/34/E/ST5/00276）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
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