Summary
Dette papir beskriver, hvordan polarisationsfølsom to-fotonmikroskopi kan anvendes til at karakterisere den lokale organisation inden for etiketfri amyloid-overbygninger-sfærulitter. Det beskriver også, hvordan man forbereder og måler prøven, samler den nødvendige opsætning og analyserer dataene for at få oplysninger om den lokale organisering af amyloidfibriller.
Abstract
Sammenlignet med dets en-foton-modstykke er to-foton-excitation gavnlig for bioimaging-eksperimenter på grund af dets lavere fototoksicitet, dybere vævspenetration, effektiv drift i tætpakkede systemer og reduceret vinkelfotovalg af fluoroforer. Således giver indførelsen af polarisationsanalyse i to-fotonfluorescensmikroskopi (2PFM) en mere præcis bestemmelse af molekylær organisation i en prøve sammenlignet med standardbilleddannelsesmetoder baseret på lineære optiske processer. I dette arbejde fokuserer vi på polarisationsfølsom 2PFM (ps-2PFM) og dens anvendelse til bestemmelse af molekylær orden inden for komplekse biostrukturer-amyloidsfærulitter. Neurodegenerative sygdomme som Alzheimers eller Parkinsons diagnosticeres ofte ved påvisning af amyloider-proteinaggregater dannet på grund af en nedsat proteinfejlfoldningsproces. Udforskning af deres struktur fører til en bedre forståelse af deres skabelsesvej og følgelig til udvikling af mere følsomme diagnostiske metoder. Dette papir præsenterer ps-2PFM tilpasset til bestemmelse af lokal fibrilbestilling inde i bovin insulinsfærulitter og sfæriske amyloidogene proteinaggregater. Desuden beviser vi, at den foreslåede teknik kan løse den tredimensionelle organisering af fibriller inde i sfærulitten.
Introduction
I løbet af de sidste årtier, selvom der har været en betydelig udvikling af adskillige fluorescensmikroskopiteknikker til bioimaging af proteiner og deres aggregater1, er kun få blevet brugt til at løse deres lokale rækkefølge inden for prøven 2,3. Fluorescens lifetime imaging mikroskopi4 blev brugt til at studere den iboende strukturelle heterogenitet af amyloid superstrukturer-sfærulitter. Desuden kunne kvantitativ bestemmelse af den lokale orden inde i komplekse og tætpakkede biostrukturer såsom sfærulitter løses ved hjælp af polarisationsfølsomme metoder3. Imidlertid er standard fluorescensteknikker med overfladisk vævspenetration begrænset, da brug af UV-VIS-bølgelængder til at excitere fluoroforer in vivo fører til høj vævslysspredning5. Derudover kræver sådan billeddannelse ofte design og binding af specifikke fluorescerende sonder til et målrettet biomolekyle, hvilket øger omkostningerne og mængden af arbejde, der er nødvendigt for at udføre billeddannelse.
For nylig, for at løse disse problemer, har vores team tilpasset polarisationsfølsom to-foton exciteret fluorescensmikroskopi (ps-2PFM) til etiketfri billeddannelse af biologiske strukturer 6,7. Ps-2PFM muliggør måling af afhængigheden af to-foton fluorescensintensitet på retningen af lineær polarisering af excitationsstrålen og analyse af polariseringen af den udsendte fluorescens8. Implementeringen af denne teknik kræver tilskud af standard multi-fotonmikroskopopsætningens excitationsvej (figur 1) med en halvbølgeplade til styring af lyspolarisationsplanet. Derefter skabes polære grafer, der viser afhængigheden af to-foton exciteret fluorescensintensitet på polariseringen af excitationslaserstrålen, fra signaler indsamlet af to lavinefotodioder, hvorved de to gensidigt vinkelrette komponenter af fluorescenspolarisering opsamles.
Det sidste trin er dataanalyseprocessen under hensyntagen til virkningen af de optiske elementer, såsom dikroiske spejle eller et højt numerisk blændemål, på polarisering. På grund af to-foton-processens natur giver denne metode både reduceret vinkelfotovalg og forbedret aksial opløsning, da to-foton-excitation af fluoroforer uden for brændplanet sandsynligvis er begrænset. Det blev også bevist, at lignende metoder med succes kunne implementeres til in vivo-billeddannelse af nær-infrarøde sonder (NIR) til dybvævsbilleddannelse9. Ps-2PFM er tidligere blevet anvendt til billedfluoroforer i cellemembraner10 og DNA11,12 samt ikke-standardiserede fluorescerende markører for biologiske systemer, såsom guldnanopartikler13. I alle disse eksempler blev oplysningerne om organiseringen af biomolekyler imidlertid opnået indirekte og krævede en foruddefineret gensidig orientering mellem en fluorofor og et biomolekyle.
I en af vores seneste papirer har vi vist, at ps-2PFM med succes kunne anvendes til bestemmelse af den lokale polarisering af autofluorescensen af amyloidoverbygninger og fluorescens fra Thioflavin T, et amyloidspecifikt farvestof, bundet til amyloidfibriller i sfærulitter6. Desuden har vi i en anden bevist, at ps-2PFM kunne bruges til at detektere amyloidfibrilorientering inde i amyloidsfærulitter i et submikronstørrelsesregime, hvilket blev bekræftet ved at korrelere det med transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeddannelse7. Opnåelsen af dette resultat var mulig takket være i) iboende autofluorescens af sfærulitter-amyloider, når de spændes med enten en eller to fotoner, udviser iboende autofluorescens med emissionsmaksima placeret i et område fra 450 til 500 nm og to-fotonabsorptionstværsnit, der kan sammenlignes med standard fluorescerende farvestoffer14, ii) matematiske modeller, der tidligere blev introduceret for at beskrive, hvordan ps-2PEF af farvestoffer, mærkning af biologiske membraner og DNA-strukturer kunne anvendes på fluorescens udstillet af sfærulitter og farvestoffer bundet til dem 8,11,15. Før vi fortsætter med analysen, anbefaler vi derfor stærkt at gennemgå den krævede teori, der er beskrevet i begge, hovedteksten og understøttende oplysninger i vores første papir vedrørende dette emne6. Her præsenterer vi protokollen for, hvordan man anvender ps-2PFM-teknikken til en etiketfri amyloid strukturel karakterisering af bovin insulinsfærulitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af mikroskopets dias med fuldvoksne sfærulitter
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol. Alle opløsninger blev fremstillet med deioniseret vand (18,2 MΩ cm ved 25 °C) opnået fra vandrensningssystemet.
- Amyloid sfærulitterne inkuberes baseret på protokollen beskrevet af Krebs et al16. med nogle ændringer, som beskrevet nedenfor.
- 10 mg insulinpulver afvejes i et 1,5 ml rør.
- Pulveret opløses med en 1 ml alikvote af den deioniseredeH2O/HCl-opløsning (pH 1,5).
- Prøven forsegles med tapen og anbringes i en termisk mixer for at inkubere i 24 timer ved 70 °C (0 omdr./min.).
BEMÆRK: For at udføre billeddannelse af amyloider i deres oprindelige (dvs. hydrerede) miljø og forhindre prøvedeformation på grund af dehydrering er det nødvendigt at forberede mikroskopglas i henhold til følgende beskrivelse (skema vist i figur 2).
- Vask mikroskopglasglasset grundigt med vand.
- Dyp diasene i methanol og lad dem tørre under omgivende forhold på en støvfri serviet.
- Der tages en 100 μL alikvote af sfærulitopløsningen fra røret med en automatisk pipette (trin 1.1.2) og tilsæt den til brønden placeret i det centrale område af mikroskopglasset.
- Dæk opløsningen med en dæksel, undgå dannelse af luftbobler.
- Aflejr monteringsbeslaget langs kanterne af dækselen på diaset med en automatisk pipette for at forsegle sfæruliternes oprindelige opløsning.
BEMÆRK: Det er af stor betydning at deponere glidebeslag på både dæksel såvel som glideflader. Gør dette under den rygende hætte på grund af toksiciteten af det flygtige opløsningsmiddel (xylen). Se indsatsen i figur 2. - Lad mikroskopprøven stå under omgivende forhold, så monteringsmidlet hærder.
BEMÆRK: Hærdningsprocessen er temperatur- og fugtighedsafhængig, men skal være afsluttet inden for 12 timer. - Kontroller, om insulinsfærulitter blev dannet korrekt ved hjælp af et polariseret optisk mikroskop (POM) med krydsede polarisatorer. Scan gennem prøven på udkig efter et karakteristisk mønster af lyse områder, kaldet et maltesisk kors, som vist i figur 3.
BEMÆRK: Amyloidsfærulitterne kan defineres som sfæriske overbygninger karakteriseret ved en heterogen morfologi med en kerneskalstruktur. I detaljer består de af en amorf kerne og radialt voksende amyloidfibriller16. På grund af den anisotrope karakter af sfærulitstrukturer kan de tydeligt interagere med polariseret lys (fx ved brydning) og ændre deres fase, som let kan observeres under POM med krydsede polarisatorer. Denne metode blev brugt til kun at studere fuldt udviklede sfærulitter kendetegnet ved et modellignende maltesisk krydsmønster. Aggregater eller strukturelt forvrængede sfærulitter blev derfor udelukket fra yderligere undersøgelser.
2. Opbygning og tilpasning af systemet
BEMÆRK: En skematisk gengivelse af et polarisationsfølsomt to-fotonmikroskop findes i figur 1.
- Installer en femtosekundlaser med udgangsbølgelængdeindstillingen i området 690-1.080 nm, for eksempel der fungerer på en tilstandslåst Ti: Safirlaser med ~ 100 fs impulser på 80 MHz gentagelseshastighed.
- Tilføj en halvbølgeplade monteret på et rotationstrin til opsætningens excitationsvej for at kontrollere polariseringen af det indfaldende lys i XY-mikroskopprøveplanet.
- Installer det dikroiske spejl for at afskære excitationsstrålen fra detekteringsoptikken.
BEMÆRK: De optiske egenskaber ved et dikroisk spejl skal gøre det muligt at reflektere excitationsstrålen (til prøven) i NIR-bølgelængdeområdet og samtidig være gennemsigtig for bølgelængdeområdet svarende til emission fra prøverne. - Installer et piezoelektrisk scanningstrin til rasterscanninger i XY-planet for et valgt Z.
- Monter det høje NA-nedsænkningsmål, for eksempel et apokromatisk olienedsænkningsmål 100x/1.4 NA.
BEMÆRK: Da hele opsætningen fungerer i en epifluorescenstilstand, passerer de indfaldende og udsendte signaler det samme mål. - I emissionsvejen tilføjes en polariserende strålesplitter, der opdeler to-foton-exciteret emission i to ortogonalt polariserede komponenter (IX og IY)
- Installer to fotontællende lavinefotodioder (APD'er) i en konfiguration, der gør det muligt for dem at indsamle lys, der overføres og reflekteres ved hjælp af henholdsvis strålesplitteren (figur 1).
- Monter korrekte bølgelængdeafhængige afskæringsfiltre på systemets excitations- og emissionsvej, for eksempel et 800 nm langpasfilter direkte i den optiske excitationsvej og et 700 kortpasfilter i emissionsvejen.
BEMÆRK: Analyser emissionsspektrene fra sfærulit, så ethvert potentielt bidrag fra anden harmonisk generation (SHG) eller laserlys kan udelukkes ved hjælp af de korrekte emissionsfiltre. Det er også værd at bemærke, at dette system også bør tillade målinger af polarisationsfølsom SHG, som kan bruges til at løse rækkefølgen af biomolekyler i prøverne. Dataanalysen af SHG-signalet adskiller sig imidlertid fra fluorescens, som mere detaljeret blev beskrevet af Aït-Belkacem et al.17. - Juster hele systemet (ved hjælp af justeringstilstanden, der er indbygget i mange lasere), indtil lignende signalintensiteter indsamles ved hjælp af begge fotodioder.
- Kontroller, om excitationsstrålen, der fokuseres af det høje NA-mål og afbildes på et kamera, har en koncentrisk cirkulær form som vist i figur 4A.
- Juster scanningstiden og den tilsvarende effekt for at minimere den skade, der induceres af den indfaldende laser på prøven. Eksemplarisk punktlignende brænding er vist i figur 4B. Mål den nominelle effekt ved hjælp af en digital håndholdt effektmåler, der er tilsluttet en fotodiodeeffektsensor placeret ved indgangen til mikroskopets krop.
BEMÆRK: Biologiske prøver kan let brændes på grund af laserbelysning. I dette tilfælde viste effektområdet 100-900 μW (i fokuspunktet for objektivobjektivet) sig at være en fremragende afvejning mellem prøvestabilitet og intens emission. - Før prøvemålingen testes kvaliteten af optikens justering med en isotrop referenceprøve (f.eks. fluorescein indeholdt i den amorfe polymer). For at udføre kalibreringskontrollen skal du følge proceduren beskrevet i punkt 3 ved hjælp af en isotrop reference i stedet for en amyloidprøve.
BEMÆRK: Med en antagelse om, at mikroskopiopsætningen er ideelt justeret for prøven med isotrope egenskaber, skal begge 2P-emissionskomponenter (IX og IY) detekteret med to APD'er karakteriseres med samme intensitet (figur 4C).
3. Måling af bovin insulin sfærulitter
BEMÆRK: For at udføre alle de beskrevne ps-2PF-målinger blev der brugt håndskrevet software, som styrer positionerne for det piezoelektriske stadium og halvbølgepladen og indsamler signalet fra begge fotodioder, hvilket giver mulighed for at plotte XY-scanningerne (rasterscanninger) fra udvalgte områder på mikroskopdias samt polære grafer fra specifikke prøvekoordinater. Yderligere noter er også blevet tilføjet til protokollen, som giver brugerne mulighed for at udføre målingen uden den, da både piezo-trinnet og rotationstrinnet, der bruges til at rotere halvbølgepladen, kunne styres ved hjælp af deres egne controllere eller tilsvarende software. Alligevel anbefales det kraftigt at skrive en algoritme, der kombinerer rotationsvinklen på en halvbølgeplade med 2PEF-intensitet indsamlet med begge fotodioder, da denne korrelation (polære grafer) er afgørende for korrekt dataanalyse, hvilket resulterer i strukturel information.
- Monter prøven med sfærulitterne på det piezoelektriske stadium (immobiliser glasglideren med tape). Sørg for at montere den på en måde, hvor en tynd glasside (dæksel) vender mod målet, da høje numeriske mål er kendetegnet ved relativt korte arbejdsafstande.
BEMÆRK: Når der anvendes olienedsænkning, skal der påføres en lille dråbe mineralolie på målet, før prøven monteres og fokuseres. - Ved at ændre XY- og Z-positioner ved hjælp af mikroskopknapper skal du fokusere målet på en af de sfærulitter, der findes i opløsningen, men vær opmærksom på, at fordi sfæruledimetre typisk ligger i området tiere μm, skal du fokusere inden for det centrale område af hele strukturen. Se efter sorte og hvide glorier omkring den specifikke sfærulit som tegn på henholdsvis under- og øvre fokus. Juster "Z" -aksen for at være mellem disse ekstremer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at finde en isoleret prøve uden strukturelle defekter. Ekstremt små sfærulitter kan glide af på grund af den materielle belastning, der introduceres af målet, mens de største strukturer sandsynligvis er aggregerede eller stærkt forvrængede. - Centrer sfærulitten i synsfeltet for det observerede mikroskopiske plan og bestem størrelsen på XY-scanning ved at se på, hvor mange piezostage-trin i X- og Y-retninger (vist på piezostage-controlleren eller i dens software) der er nødvendige for at dække hele strukturens område.
BEMÆRK: Det anbefales at indstille systemet på en sådan måde, at begyndelsen af XY-scanningen er placeret nær et af hjørnerne af sfærulitten og falder sammen med scenens nulposition (X og Y = 0) - Juster følgende scanningsparametre:
- Juster polariseringen af excitationsstrålen, og drej halvbølgepladen for at opnå polariseringen svarende til "X" og "Y" akserne i mikroskopprøveplanet.
BEMÆRK: Dette kan gøres ved at måle de polære grafer af isotropt fluorescerende medium såsom fluorescein. For sådanne materialer er maksimal fluorescensintensitet parallel med excitationsstrålepolarisationen; således justerer rotation af halvbølgepladen polariseringen med X- og Y-aksen på observationsplanet, også betegnet som X- og Y-aksen på polære grafer som i figur 4C. Fuld polær graf kunne måles ved at indsamle den målte 2PEF-intensitet på begge fotodioder for 180 ° rotation af halvbølgeplade (360 ° rotation af excitationslyspolarisering) og korrelere intensiteten med excitationslysets polarisationsvinkel. Det kunne gøres manuelt ved at måle emissionsintensiteten for hver halvbølgepladevinkel separat og derefter samle den i en polær graf i dataanalysesoftware eller automatisk ved hjælp af dedikeret eller selvskrevet software. - Juster piezostageparametrene: scanningshastighed, trin og rækkevidde for at dække området for hele sfærulitten.
BEMÆRK: Scanningsområdet skal være højere end sfærulitdiameteren for at indramme hele overbygningen i rasterscanningen fuldt ud. Lav scanningshastighed og trin giver brugerne mulighed for at få billeder i høj kvalitet; Dette kan dog resultere i prøvebrænding. Derfor er en afvejning afhængig af sfærulitstørrelsen nødvendig. Disse parametre kan ikke anvendes universelt. Eksempler på parametre, der anvendes i figur 5A: scanningsområde 45 x 45 μm, scanningstrin 1 μm og scanningshastighed 2 μm/s.
- Juster polariseringen af excitationsstrålen, og drej halvbølgepladen for at opnå polariseringen svarende til "X" og "Y" akserne i mikroskopprøveplanet.
- Åbn lukkeren, tænd fotodioderne, og saml
og 
2P-emissionskomponenter for hvert enkelt trin i det valgte scanningsområde - for excitationsstrålen polariseret svarende til X og derefter Y-akserne. Eksemplariske to-foton exciterede autofluorescens (2PAF) rasterscanninger af insulin sfærulitter er præsenteret i figur 5A.
BEMÆRK: Måling af rasterscanninger kræver korrelering af piezo-trinkoordinater med og indsamlede emissionskomponenter, hvilket kan gøres manuelt ved at måle intensiteten i hvert enkelt punkt i det valgte område og derefter samle det i en 2D-matrix eller automatisk via selvskrevet software. Rasterscanninger kan præsenteres som en summering af og emissionskomponenters intensitet eller tydeligt for en bestemt emissionskomponent. Da de er meget strukturafhængige, er strukturelle forvrængninger inden for sfærulitter let synlige. På grund af mikroskopets bevægelse kan nogle prøver imidlertid glide væk fra synsfeltet. Derfor skal billeder screenes for artefakter. Det er nødvendigt at kontrollere sfærulittens position før og efter scanningen. - For at udføre fuld polarisationsanalyse fra det specifikke sted på prøven skal du slukke for excitationsstrålen.
- Vælg derefter specifikke koordinater for piezostage svarende til det valgte sted på sfærulitten, hvor informationen om molekylernes orientering kræves med sub-μm-opløsningen.
- Juster det piezoelektriske trin for at centrere synsfeltet ved angivet (X, Y).
- Tænd for excitationsstrålen, og udfør fuld (360°) polarisationsanalyse af og emission ved at tænde for halvbølgepladens rotation (180° rotation). Nuværende 2PF IX og Iy komponenter i form af en polær graf (som vist i figur 5B).
BEMÆRK: Dette trin kan gentages forskellige steder i eksemplet for at indsamle en tilstrækkelig mængde data.
4. Bestemmelse af lokal fibrilbestilling inde i bovin insulin sfærulitter
BEMÆRK: Alle numeriske beregninger forbundet med dataanalysen blev udført ved hjælp af programmeringssproget Python og baseret på de tilgængelige funktioner i bibliotekerne NumPy og SciPy. Afbildning af dataene kræver biblioteket Matplotlib. Alle beregninger er baseret på formler, der præsenteres i understøttende oplysninger i et af papirerne af Obstarczyk et al.6.
- Simulering af intensiteten af to-fotonfluorescens exciteret for den specificerede fordeling af molekyler med en valgt retning af den indfaldende lyspolarisering (betegnet ved α)
BEMÆRK: De præsenterede formler er baseret på antagelsen om parallelle absorptions- og emissionsdipolmomenter for en fluorofor. For en diskussion af andre tilfælde (f.eks. forskellige retninger af absorptions- og emissionsdipolmomenterne, energioverførsel mellem fluoroforerne), se papiret af Le Floc'h et al8.- Find parametrene, der tegner sig for variationen af det elektriske felt ved polarisationsblanding og depolariseringseffekter forårsaget af det dikroiske spejl monteret i en opsætning:
- γ repræsenterer amplitudefaktoren mellem reflektionsevnen
af og 
polariseret lys fra et dikroisk spejl. - δ repræsenterer faseforskydningen (ellipticitet) mellem og polariseret lys.
BEMÆRK: Korrekt definition af disse to parametre er afgørende for vellykket strukturel karakterisering på grund af deres stærke indflydelse på formen af målte polære grafer11,18. I tilfælde af det præsenterede system blev begge parametre bestemt under ellipsometrimålinger af et dikroisk spejl påført i et system.
- γ repræsenterer amplitudefaktoren mellem reflektionsevnen
- Beregn de indfaldende elektriske feltvektorer, der formerer sig i X- og Y-aksernefor hver vinkel målt under ps-TPFM-målingen ved hjælp af ligninger (1-5).
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
BEMÆRK Hvis intensiteten måles over hele 360° med trin 1°, beregnes elektriske feltvektorer for alle 360°. Alle vinkler skal være i radianer. ρ parameter er forbundet til optisk frekvens ω af det simulerede elektriske felt (ρ=ω·t) og anvendes integreret fra 0 til 2π under beregningerne af de indfaldende elektriske feltvektorer, der udbreder sig i X- og Y-aksen for hver vinkel, der α måles under ps-TPFM-målingen. - Definer funktionerne for overgangsdipolmomenter i retning af tre akser i et kartesisk system i henhold til ligninger (6-8):
(6)
(7)
(8)
BEMÆRK: φ er orienteringsvinklen for amyloidfibrillernes lange akse i XY-prøverammen. θ og φ vinkler er de polære og azimutale vinkler, der bruges til at definere overgangsdipolmomentorienteringen af en fluorofor. - Brug de funktioner, der er defineret i trin 4.1.3. at definere funktioner for Jx (Φ,θ,φ) og JY(Φ,θ,φ), som tegner sig for bidraget fra tæt lysfokusering med højt numerisk blændemål til fluorescenspolarisationsdetektion i X- og Y-retning ved hjælp af ligninger (9, 10).
(9)
(10)
BEMÆRK: K1, K2, K3 faktorer er relateret til mikroskopmålet, der anvendes under ps-TPFM-målingen. I disse eksperimenter blev der anvendt et apokromatisk olienedsænkningsmål 100x / 1.4 NA, og K1, K2, K3 faktorer var henholdsvis 2.945, 0.069 og 1.016. - Definer en funktion for f (Ω), som er en molekylær vinkelfordeling afhængigt af halvblænden af en fluoroforkegle Ψ med en variabel tykkelse ΔΨ; Brug ligning (11). Den grafiske gengivelse af alle tre vinkler vedrørende amyloidfibril er vist i figur 6.
(11)
BEMÆRK: Vær forsigtig, mens du skriver eksponenten - kraften i 2 virker på funktionsargumentet, ikke hele funktionen! - Definer alle fWWIJKL-faktorer som vist i ligninger (12-21).
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21) - To-foton exciterede fluorescensintensiteter
beregnes og 
for hver målt vinkel (på samme måde som i punkt 4.1.2) ved hjælp af ligninger (22, 23).
= (22)
= (23) - Kontroller, om simuleringen fungerer korrekt ved hjælp af følgende variable værdier (placeret i forklaringen til figur 7), og sammenlign de opnåede resultater med figur 7A-C.
BEMÆRK: Alle grader skal skrives i radianer.
- Find parametrene, der tegner sig for variationen af det elektriske felt ved polarisationsblanding og depolariseringseffekter forårsaget af det dikroiske spejl monteret i en opsætning:
- Tilpas de simulerede intensiteter til intensiteten af to-foton-exciteret autofluorescens af bovin insulinsfærulitter indsamlet under ps-2PFM-målinger.
BEMÆRK: Løsning af sfærulitstrukturen baseret på ps-2PFM-målinger kræver brug af ligningerne skrevet i protokollen til at simulere den teoretiske intensitet af to-foton exciteret fluorescens og tilpasse alle parametre forbundet med rækkefølgen af molekylær fluorofor. Det kræver flere iterationer over de forskellige værdier af Φ, en vinkel, der beskriver fibrillernes rotation i XY-mikroskopprøven, og ΔΨ, aberrationer af den koniske fordeling af emissionsdipolen Ψ på grund af molekylrotationerne i filamenter for fast Ψ , indtil den når den højest muligeR2-koefficient mellem normaliseret to-foton exciteret fluorescenssignalintensitet indsamlet under måling og normaliserede intensiteter simuleret i henhold til Trin 4.1 i protokollen.- Bestem Ψ-halvvinklen.
BEMÆRK: For bovin insulinsfærulitter skal den være lig med Ψ = 29°6. - Tilpasning arbejdsgang:
- Vælg værdien af Φ fra 0° til 180° (i figur 8A og 8B Φ = henholdsvis 16° og 127°).
- Vælg værdien af ΔΨ fra 0° til 90° (i figur 8A,B, ΔΨ = henholdsvis 24° og 1°).
- Beregn (ligning 22) og (ligning 23) for hele det målte område af θ-vinkler ved hjælp af de valgte værdier af Φ og ΔΨ.
- Sammenlign intensiteterne beregnet under simuleringer (begge normaliseret til den maksimale værdi af
- Beregn ) med normaliserede intensiteter på
- Beregn og (begge normaliseret til den maksimale værdi af ) målt under ps-2PFM-måling.
BEMÆRK: I de præsenterede eksperimenter blev Pearson produktmomentkorrelationskoefficienter beregnet ved hjælp af funktionen "corrcoef" fra NumPy Python-biblioteket.
- Til sidst skal du vælge værdierne for Φ og ΔΨ , hvilket fører til de højeste korrelationskoefficienter og konvergens mellem de simulerede intensiteter og det målte signal svarende til det, der er vist i figur 8.
- Bestem Ψ-halvvinklen.
af og 
polariseret lys fra et dikroisk spejl.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
for hver målt vinkel (på samme måde som i punkt 4.1.2) ved hjælp af ligninger (22, 23).
= (22)
= (23)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede protokol giver trinvis vejledning gennem forberedelse af amyloidoverbygninger til test med ps-2PFM, konstruktion af det mikroskopiske system og målinger af den korrekte prøve. Før det endelige sæt målinger er det imidlertid vigtigt at justere APD'erne korrekt med en isotrop reference, hvilket bør resultere i indsamling af et symmetrisk signal med samme form og intensitet på begge detektorer (figur 4C). Selv minimale forskelle mellem intensiteterne målt på detektorerne i X- og Y-akser bør tages i betragtning ved yderligere målinger og især under analysen som en passende korrektionsfaktor. Efter montering indeholder prøven enkelte sfærulitter, hvilket giver et karakteristisk maltesisk kryds på POM som i figur 2B, og efter at have udført en 2PFM rasterscanning, skal billedet ligne det, der er vist i figur 5A, hvilket er i overensstemmelse med rapporterede 2PFM rasterscanninger af sfærulitter 6,7 og forskellige organiserede biomolekyler11,12. Man kan observere nogle ændringer i placeringen af aksen med den højeste lysstyrke, hvilket er relateret til det faktum, at fluorescenssignalintensiteten stærkt afhænger af polariseringen af excitationsstrålen. Derfor er det nødvendigt at kontrollere, hvilken position af halvbølgepladen der svarer til excitationen af prøven langs X- (figur 5A, øverst) og Y-aksen (figur 5A, nederst). Det er også værd at bemærke, hvordan polære grafer ændrer sig, mens der udføres en fuld polarisationsanalyse fra forskellige udvalgte steder. Uden for sfærulitten ligner polargrafen en samling artefakter og tilfældige signalstøjspidser (figur 5B, I). En sådan graf kan også indikere spherulittens drift mellem målinger og kræve at finde nye koordinater for hele strukturen ved en anden 2PF rasterscanning. Korrekt målte polære grafer fra højt ordnede steder af insulin sfærulit langs X- og Y-akserne er vist i henholdsvis figur 5B II og III. De kan have forskellige former og geometrier afhængigt af den lokale orientering og organisering af fluoroforer målt fra det valgte sted7.
Det sidste trin i protokollen er fokuseret på analysen af de opnåede data ved hjælp af en algoritme baseret på en matematisk model, der kombinerer orienteringen af amyloidfibre i XY-planet Φ, de associerede fluoroforforbiiente dipolmomenter Ψ og deres aberrationer ΔΨ (figur 6) med intensitet 
og 
to-fotoninduceret fluorescens. Korrekt implementerede funktioner, der præsenteres i protokollen, skal efter indtastning af de relevante inputdata (protokoltrin 4.9) producere identiske polære grafer som dem, der er vist i figur 7. Eventuelle afvigelser - forskellige dataorienteringer, intensiteter eller former for simulerede 
og 
-angiver fejl i koden. Hvis modellen fungerer, kan man gå videre til det sidste trin i protokollen og tilpasse de simulerede data til reelle data opnået fra ps-2PFM-målingen. De valgte værdier af Φ og ΔΨ med de højeste korrelationskoefficienter og konvergens mellem de simulerede intensiteter og det målte signal skal føre til lignende billeder som vist i figur 8. Der skal være den bedst mulige tilpasning af og funktioner til den overordnede orientering og form af og og værdierne af Φ og ΔΨ skal svare til den lokale orientering af fibriller og fluoroforer i det målte sted på sfærulit. Lignende modeller og tilpasningsmetoder kunne også bruges til bestemmelse af den lokale organisering af andre biomolekyler som DNA11.
Figur 1: To-foton polarisationsfølsom mikroskopi opsætning. Skema, der viser to-fotonmikroskopopsætningen, der anvendes til polarisationsfølsomme to-foton-exciterede fluorescensmålinger af bovin insulinsfærulitter. To-foton exciteret emission vandret og lodret polariseret (til mikroskopprøveplan) komponenter er afbildet med henholdsvis IX og IY. Forkortelser: SP = prøveplan; O = mål DM = dikroisk spejl; λ/2 = halvbølgeplade; LPF = langpasfilter; BE = bjælkeekspander; P = Glan polarisator; Ti: Sa = Titan: safirlaserlyskilde; M = spejl; SPF = kort pass filter; PBS = polarisationsstrålesplitter; L = optisk linse; APD = lavine fotodiode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skema, der viser diasforberedelsen/fotoet. A) Skema, der viser det forseglede prøvepræparat B) fotografier af de efterfølgende trin i prøveforseglingen. I: en 100 μL alikvote af sfærulitopløsningen på mikroskopiobjektglasset med en brønd, II: dæksel faldt oven på opløsningen; III: tæt forsegling dannet af aflejret polymer (monteringsmiddel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvalitetskontrol af insulinsfærulitterne under et polariseret lysmikroskop. (A1,B1) Brightfield-tilstand såvel som under (A2,B2) krydsede polarisatorer. Karakteristisk maltesisk krydsmønster kan observeres på de tilsvarende billeder taget med krydsede polarisatorer. A) Sfærulitteraggregater med strukturelle forvrængninger, B) isoleret sfærulit af høj kvalitet. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Test af justeringen af ps-2PFM-systemet. (A) Koncentrisk defokuseret billede af fluoresceinfluorescensen set uden (A1) og med (A2) dikroisk spejl, (B) fotobeskadiget sfærulit med brændte huller, der opstår på grund af den langstrakte polarisationsanalyse i udvalgte punkter langs x- og y-retninger (C) to-foton exciterede emissionskomponenter i afhængighed af polarisationsvinkel for indfaldende lys som registreret for en isotrop prøve (fluoresceinopløsning). og betegner emissionskomponenter målt med lavinefotodioder, der måler henholdsvis X- og Y-emissionspolarisationsaksen. Skalastænger = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksemplariske 2PFM rasterscanninger og polære grafer fra etiketfri insulinsfærulit. (A) 2PF-intensitetsrasterscanninger af etiketfrie insulinsfærulitter: polarisering af excitationslys: (A1) vandret polarisering, (A2) lodret polarisering og emission betegnes med hvide pile, og indsatsen viser den samme sfærulit afbildet under et standard polariseret lysmikroskop med krydsede polarisatorer. (B) Polære grafer afledt af tre pletter angivet på A1-scanningen (B1, I; B2, II; B3, III). Ixog Iybetegner emissionskomponenter målt med lavinefotodioder, der måler henholdsvis X- og Y-emissionspolarisationsaksen. Forkortelse: 2PF = to-foton fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Konisk fordeling af farvestoffets emissionsdipol (halvvinkel, Ψ) i forhold til den lange fibrilakse. Den stiplede linje viser den lange fibrilakse. Rotationen af fibrilen i XY-mikroskopprøveplanet beskrives ved vinklen. Aberrationer af Ψ på grund af de molekylære rotationer i filamenter er beskrevet af ΔΨ. Denne figur er fra Obstarczyk et al6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Simuleret intensitet af polariseret to-foton exciteret fluorescens. fluorescens beregnet for (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1° (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Røde, blå og gule linjer svarer til henholdsvis , og + . Φ vinkel beskriver fibrillernes rotation i XY-mikroskopprøveplanet, Ψ - konisk fordeling af emissionsdipol og ΔΨ- aberrationer af Ψ på grund af de molekylære rotationer i filamenter. Alle andre parametre var identiske i alle tilfælde: K1 = 2, 945, K2 = 0, 069, K3 = 1, 016, γ = 0, 01 og δ = 0, 98845. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Polære grafer over eksperimentelle datasæt. (A,B) Eksemplariske polære grafer efter tilpasning af to eksperimentelle datasæt indsamlet under ps-TPFM-målinger af bovin insulinsfærulit. Målte og to-foton exciterede emissionskomponenter for X- og Y-emissionspolarisationsakse præsenteres med henholdsvis røde og blå prikker; i mellemtiden præsenterer ubrudte linjer de tilsvarende simulerede to-foton exciterede fluorescensemissionskomponenter for X- og Y-emissionspolarisationsakse og . Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polarisationsfølsom to-fotonmikroskopi er et værdifuldt værktøj til at studere den lokale bestilling af fibriller inde i amyloidoverbygningerne, der kun kræver små ændringer af standard multifotonopsætningen. Da det fungerer på ikke-lineære optiske fænomener, kan reduceret vinkelfotovalg og forbedret aksial opløsning opnås sammenlignet med en-foton exciteret fluorescensmikroskopimetoder. Derudover fører det til lavere lysspredning, lavere fototoksicitet og dybere prøvepenetration sammenlignet med en-foton excitationsfluorescensmikroskopiteknikker19,20. Som vi allerede har bevist, er det velegnet til målinger af tætpakkede aggregater af proteiner såsom sfærulitter, som kan udføres på en etiketfri måde21.
For effektivt at anvende den metode, der er beskrevet her, skal der dog lægges vægt på flere centrale spørgsmål. Startende med prøveforberedelse og dens kvalitet, nemlig inkubation, skal du altid sikre, at amyloidoverbygninger er vokset korrekt. I tilfælde af sfærulitter brugte vi et polariseret optisk mikroskop med krydsede polarisatorer til at lokalisere modne sfærulitter, som giver et karakteristisk maltesisk krydsmønster og har en radius på ~ 5 μm16. Imidlertid er sfærulitter heterogene, og karakteristiske strukturer kan observeres inden for prøven. Derfor er det afgørende at udvælge adskilte og ikke-forvrængede arter. Hvad angår selve målesystemet, er det afgørende at kontrollere polariseringen af indfaldende lys, så polariseringen af strålen ved indgangen til mikroskoplegemet skal bestemmes nøjagtigt, og depolariseringen indført af de anvendte optiske elementer skal minimeres22. For at sikre den bedste ydeevne anbefaler vi at bruge sølvspejle og optiske filtre af høj kvalitet, der passer til excitations- og fluorescensemissionbølgelængderne. På grund af lyspolariseringens nøglerolle også i emissionsvejen er det vigtigt at måle en isotrop referenceprøve før den faktiske måling. Hvis excitationsvejen og APD-detektorerne er justeret korrekt, skal man se et lige intenst signal på begge detektorer som vist i figur 4C. Reference skal generere en stærk to-foton exciteret fluorescens ved relativt lav lasereffekt for at undgå fotoblegning; Vi brugte fluorescein, da dets to-fotonabsorptionstværsnit for forskellige bølgelængder allerede blev rapporteret i litteraturen23.
For korrekt at bestemme arrangementet af strukturer inde i sfærulitterne skal der også lægges stor vægt på dataanalyse. Den grundlæggende antagelse af denne model er kollinæriteten af overgangsdipolmomentet for lysabsorption og emission. Under denne antagelse muliggør justering af molekylets overgangsdipolmoment parallelt med polariseringen af det indfaldende lys dets kombination med den testede prøves indre struktur, hvilket giver den højeste emissionsintensitet. Den givne model kan også bruges som en god tilnærmelse til små forskelle i vinklen mellem de to dipolmomenter8 , men kræver yderligere modifikationer for store afvigelser. Derfor skal nogle antagelser vedrørende prøven som beskrevet tages i betragtning a priori til billeddannelse og dataanalyse. I det modeltilfælde, som simuleringen og ligningerne anvendt i denne metode er baseret på, er hovedkilden til depolarisering i systemet det dikroiske spejl. Før du fortsætter med dataanalysen, er det derfor nødvendigt at bestemme de parametre, der er ansvarlige for depolariseringen indført af det dikroiske spejl på grund af deres indvirkning på formen af de indsamlede polære grafer og følgelig den korrekte bestemmelse af molekylernes organisation inden for den undersøgte struktur under montering18. Dette bliver et centralt problem, især i tilfælde af målinger for flere bølgelængder, da ændringen i ellipticiteten af det dikroiske spejl er karakteristisk bølgelængdeafhængig12. Induktion af depolarisering kan stærkt påvirke egenskaberne ved det indsamlede signal11. Sidst men ikke mindst, når man opretter scriptet til dataanalyse, skal man være opmærksom, mens man introducerer matematiske funktioner og variabler, der præsenteres i den sidste del af protokollen. For at undgå fejl skal du fokusere på funktioner som multifunktionsopkald og globale parametre, hvilket også vil fremskynde analysetiden betydeligt.
Vi bør også nævne de mest almindelige problemer, man kan støde på, når man bruger den beskrevne metode. Prøveforberedelsestiden afhænger meget af hastigheden af monteringshærdning. For at fremskynde dette anbefaler vi, at prøverne fremstilles på et varmt, tørt sted, og sfæruteleopløsningen forsegles, inden den monteres i et mikroskop. Målinger, der udføres for tidligt, kan føre til fjernelse af forseglingen af objektglasset og ødelæggelse af den anvendte objektivlinse. På trods af korrekt prøveforberedelse kan små sfærulitter desuden flyde i opløsningen under målingen på grund af den materialespænding, der indføres af målet. For at undgå dette anbefaler vi at scanne isolerede mellemstore strukturer, da de største ofte er aggregater. Det anbefales at kontrollere, om den scannede sfærulit har bevæget sig efter dataindsamling i forhold til billedet, før målingen påbegyndes. På trods af den korrekte justering af alle optiske elementer og detektorer, der bruges til at måle ps-2PFM, kan de målte intensiteter og den isotrope reference stadig afvige lidt i intensitet. I et sådant tilfælde er det nødvendigt at tage højde for dette ved analysen af dataene fra prøvemålingerne ved at multiplicere en af intensiteterne med den korrektionsfaktor, der er bestemt under referencemålingerne. Sidst, men ikke mindst, er det muligt, at scriptet under tilpasningsproceduren ikke kan finde nogen matchende værdier af Φ og ΔΨ. Dette kan skyldes flere faktorer-data blev indsamlet fra et uorganiseret sted på en prøve, for eksempel kernen i en sfærulit; den undersøgte struktur blev ikke fuldt dannet under inkubation; forkert simulering af og ; ved hjælp af forkerte dikroiske spejlparametre γ og δ; for stort trinsæt til vinklerne Φog Δ Ψ mellem hver iteration under montering. I tilfælde af et uorganiseret sted anbefaler vi at forsøge at indsamle data fra punkter, der ligger tættere på omkredsen af den undersøgte struktur. I tilfælde af en ufuldstændigt dannet struktur gentages inkubationen eller søger diaset efter andre strukturer. I tilfælde af forkerte simuleringer skal du manuelt kontrollere, om de simulerede intensiteter og ændre og rette eventuelle fejl i koden ved at ændre parametrene Φ, Ψ og ΔΨ. I tilfælde af forkerte dikroiske spejlparametre skal du omhyggeligt kontrollere γ og δ parametre for det dikroiske spejl, der anvendes under målingerne. I tilfælde af et stort trinsæt til vinklerne under montering reduceres trinnet mellem successive iterationer til 2º eller 1º. Det skal også huskes, at i tilfælde af stærk lokal uorganisering af strukturen vilR2 altid være lavere, ofte i området 0, 5-0, 6. Dette skyldes, at den præsenterede model beskriver højt ordnede molekyler, hvor de fleste af de forbigående dipolmomenter er justeret i en lignende retning; Derfor fører matchende amorfe eller stærkt uordnede strukturer til lavere korrelationskoefficienter. Derfor er det afgørende at have mindst nogle strukturelle oplysninger om prøven før målingen for korrekt at analysere de opnåede data.
Det er også værd at bemærke, at den præsenterede metode har flere begrænsninger. Dataanalyse kan resultere i flere værdier af Φ og ΔΨ vinkler med høje nok korrelationsfaktorer, hvilket kræver, at eksperimentatoren bruger deres viden og erfaring til at vælge passende værdier. I dette tilfælde skal grænsebetingelserne tages i betragtning, såsom at fluoroforkeglens halvvinkel Ψ altid skal være større end dens afvigelse ΔΨ. Derudover er det værd at bemærke, når vi sammenligner vores data med litteraturen, at nogle papirer beskriver Ψ som en fuldkeglevinkel, mens vi opererer i en halvkeglevinkel. En anden begrænsning er måleopløsningen, begrænset til en submikronopløsning. På grund af dette er systemets fotoselektivitet og resulterende lokale organisationsbestemmelse baseret på det gennemsnitlige signal fra fibriller, der er spændt i brændpunktet snarere end enkeltstrukturer. Desuden skal selve prøven have tilstrækkeligt fluorescenskvanteudbytte, da lang eksponering under fs indfaldende laserkraft (nødvendig for at erhverve data til polære grafer) kan være destruktiv og påvirke resultaterne.
På trods af disse vanskeligheder mener vi, at den metode, der præsenteres i dette dokument, har en bred vifte af anvendelser til etiketbaseret og etiketfri billeddannelse af biostrukturer i hydrerede og komplekse miljøer. Vi havde tidligere vist, at lokal fibrilbestilling beregnet ud fra ps-2PEF-data korrelerer med information afledt af transmissionselektronmikroskopi7. Derfor bekræftede vi validiteten af ps-2PEF i bio-imaging og udvidede yderligere viden om den strukturelle rækkefølge af amyloidoverbygninger. Denne metode kan anvendes til at lære om oprindelsen af iboende fluorescens observeret i tilfælde af forskellige komponenter i biologiske prøver, såsom autofluorescensen af proteinaggregater - amyloider. På baggrund af relevante data om orienteringen af absorptions-/emissionsdipolmomentretninger i forhold til amyloidfibrillernes lange akse kan fibrillernes optiske egenskaber korreleres med deres struktur6. Vi angav, at for strukturer med en allerede bestemt Ψ-vinkel tillader denne teknik påvisning af forskellige strukturelle træk ved amyloidoverbygninger og polymorfer af insulinoverbygninger baseret på niveauet af deres organisation7. Som tidligere nævnt i protokollen kunne den præsenterede opsætning også anvendes til polarisationsfølsomme anden harmoniske generationsmålinger, som også er en etiketfri to-fotonmikroskopi-teknik24. Dette kræver ikke blot montering af forskellige optiske filtre, men også ændring af de formler, der anvendes til dataanalyser25. Desuden kan den med tilføjelsen af en korrekt justeret kvartbølgeplade bruges til at excitere prøven med cirkulært polariseret lys, hvilket kan føre til generering af chirale ikke-lineære optiske egenskaber af amyloider, da de er chirale biopolymerer med bekræftede stærke chiroptiske egenskaber26. I et sådant tilfælde ville den konstant roterende elektriske vektor imidlertid føre til den konstant skiftende retning af den ophidsede emission, hvilket gør det umuligt at bestemme nogen strukturel information ved hjælp af ligningerne præsenteret i dette manuskript. Alt i alt er ps-2PEF et lovende værktøj til bestemmelse af organisationen inden for adskillige komplekse biostrukturer med ordnede emissionsdipoler, såsom proteinaggregater, DNA eller væv på en ikke-invasiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Sonata Bis 9-projektet (2019/34/E/ST5/00276) finansieret af det nationale videnskabscenter i Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
